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        右美托咪定通過抑制TLR4/NF-κB信號通路促進(jìn)佐劑性膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞凋亡*

        2021-09-01 08:30:52邢丹丹康文越王志華吳多志
        中國病理生理雜志 2021年8期
        關(guān)鍵詞:模型

        邢丹丹, 康文越, 王志華, 王 穎, 李 娜, 吳多志, 林 慧

        (海南省人民醫(yī)院,海南???70311)

        膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨損傷、滑膜炎癥和滑膜增生,是骨關(guān)節(jié)炎中常見類型[1]。成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,F(xiàn)LS)作為KOA中參與發(fā)病機(jī)制的主要細(xì)胞,可參與滑膜血管形成、炎癥等過程[2],特別是其出現(xiàn)的腫瘤樣特征,包括過度增殖和凋亡不足導(dǎo)致滑膜組織異常增生現(xiàn)象[3],因此促進(jìn)FLS凋亡成為KOA的潛在治療方法。右美托咪定(dexmedetomi?dine,DEX)作為α2受體激動藥物,具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡作用[4],研究發(fā)現(xiàn)在KOA中DEX能夠抑制軟骨細(xì)胞凋亡,進(jìn)而緩解疾?。?],但在FLS中尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路在KOA中發(fā)揮重要作用,不僅可介導(dǎo)促炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等影響疾病狀態(tài)[6],而且對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)代謝具有重要調(diào)控作用[7],推測TLR4/NF-κB信號通路可能與DEX調(diào)控FLS凋亡機(jī)制存在一定關(guān)系。因此,本研究采用弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant,F(xiàn)CA)建立KOA大鼠模型,探究DEX對FLS凋亡的影響,并探究其機(jī)制。

        材料和方法

        1 動物

        SPF級健康SD大鼠,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司,合格證號為SCXK(京)-2016-0011,體重(200±10)g,6~8周齡。溫度(24±1)℃、濕度(50±5)%、12 h光照/12 h黑暗、定期通風(fēng)環(huán)境中自由飲水?dāng)z食。實(shí)驗(yàn)符合3R原則,本研究經(jīng)本院倫理委員會審核并通過。

        2 主要試劑

        鹽酸DEX注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20090248,規(guī)格:2 mL;200μg);FCA(北京梅科萬德生物科技有限公司,批號:201850231,規(guī)格:10 mL);TLR4激動劑脂多糖(lipo?polysaccharide,LPS;Invivogen,貨號tlrl-b5lps);蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(上海生工生物技術(shù)公司,貨號E607318);末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位切口末端標(biāo)記(terminal deoxy?nucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end la?beling,TUNEL)凋亡試劑盒(上海通善生物科技有限公司,貨號Ts-E1001);抗血管細(xì)胞黏附分子1(vas?cular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、TLR4、NF-κB p65、caspase-3、活化的caspase-3(cleaved caspase-3)、核纖層蛋白B(lamin B)和GAPDH抗體(Abcam,貨號分別為ab271899、ab13556、ab207297、ab184787、ab214430、ab16048和ab8245);Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測試劑盒和annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司,貨號分別為C0037和C1062S)。

        3 主要方法

        3.1 動物分組及處理 參考文獻(xiàn)[8]建立KOA大鼠模型,大鼠備皮與消毒,剃須刀將大鼠右側(cè)前、后膝關(guān)節(jié)及以下部位毛剃干凈,75%乙醇對剃毛部位消毒,消毒完全后使用注射器將0.1 mL FCA注射液注射入膝關(guān)節(jié)內(nèi),分別在第1、3和7天各注射1次,每天強(qiáng)制大鼠活動1 h,7 d后大鼠膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫熱痛、同時(shí)伴有腫脹現(xiàn)象,周圍出現(xiàn)僵硬,膝關(guān)節(jié)活動受限則為模型建立成功。模型成功30只,隨機(jī)分為模型組(model group)、DEX組(DEX group)、DEX+TLR4激活劑組(DEX+TLR4 activator group),每組10只。對照組(control group)10只大鼠將FCA注射液換為生理鹽水,其余步驟相同。

        DEX組鞘內(nèi)注射100μL/kg DEX[9],DEX+TLR4激活劑組在DEX組基礎(chǔ)上鞘內(nèi)注射500μg/kg LPS,對照組、模型組相同部位注射等體積生理鹽水,每天1次,連續(xù)28 d。

        3.2 KOA嚴(yán)重程度的評估及膝關(guān)節(jié)直徑的測量在建模前和建模后、給藥后均評價(jià)關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度情況。關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度分級[10]:無腫脹為0分;關(guān)節(jié)稍紅腫為1分;關(guān)節(jié)輕度紅、腫、熱為2分;關(guān)節(jié)中度紅、腫、熱,出現(xiàn)輕度功能障礙為3分;關(guān)節(jié)重度紅、腫、熱,活動受限,不能負(fù)重為4分。單個(gè)膝關(guān)節(jié)評分在[0,4]分之間,本研究為2個(gè)膝關(guān)節(jié)評估總分(即KOA評估值)。建模前和建模后、給藥后分別用游標(biāo)卡尺檢測大鼠膝關(guān)節(jié)直徑。

        3.3 HE染色觀察大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織的形態(tài) 收集各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織,部分置于4%多聚甲醛中固定48 h,0.5 mol/L脫鈣液EDTA(pH 8.0)脫鈣12 h,經(jīng)石蠟包埋后切片(厚度5μm),蘇木精染色、伊紅復(fù)染,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化(包括病理變化和滑膜增生情況)。

        3.4 TUNEL染色檢測膝關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞的凋亡情況 使用TUNEL凋亡試劑盒檢測膝關(guān)節(jié)滑膜組織中細(xì)胞凋亡情況。石蠟切片經(jīng)脫蠟處理,蛋白酶K工作液37℃孵育30 min、DAB顯色液顯色,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察、拍照。濃縮棕色DAB沉淀的細(xì)胞為TUNEL陽性細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞)。隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)數(shù),凋亡指數(shù)(%)=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

        3.5 大鼠FLS的分離與培養(yǎng) 方法3.3中剩余部分膝關(guān)節(jié)滑膜組織立即剔除脂肪和纖維,手術(shù)剪剪成1 cm×1 cm×1 cm大小組織塊,用無Ca2+、Mg2+的DHank’s液輕輕漂洗3次,滑膜組織塊平鋪在培養(yǎng)瓶中,置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)2 h,添加含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。每天觀察,待組織邊緣長出較多細(xì)胞后去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)期間更換培養(yǎng)液,原代培養(yǎng)細(xì)胞成片時(shí)傳代,待細(xì)胞傳代3代時(shí),光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),并采用抗VCAM-1多克隆抗體鑒定培養(yǎng)細(xì)胞是否為FLS。

        3.6 FLS的鑒定 細(xì)胞置6孔板中,95%的冷乙醇固定細(xì)胞30 min,滴加VCAM-1多克隆抗體37℃孵育30 min,滴加FITC標(biāo)記的Ⅱ抗37℃孵育30 min,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

        3.7 CCK-8法檢測FLS活力 1×107/L FLS接種于96孔板上,每孔100μL,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,添加CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀在450 nm處檢測細(xì)胞的吸光度(A)值。存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組(A)值/對照組(A)值×100%。

        3.8 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測FLS的凋亡情況 每組1×108/L FLS,經(jīng)胰酶消化后500 r/min離心5 min收集細(xì)胞置于離心管中,加入400μL annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞,再加入5μL annexin VFITC染色液4℃避光孵育15 min,加入10μL PI染色液4℃避光孵育5 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

        3.9 Western blot檢測FLS中TLR4、NF-κB p65、cas?pase-3和cleaved caspase-3蛋白水平 細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒提取細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白(檢測NF-κBp65蛋白水平),其余細(xì)胞添加蛋白裂解液冰上裂解10 min,10 000 r/min離心10 min,上清為總蛋白(檢測其余蛋白水平)。凝膠電泳分離蛋白、PVDF膜轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫孵育2 h,分別添加對應(yīng)抗TLR4、NF-κB p65、caspase-3、cleaved caspase-3、lamin B(細(xì)胞核蛋白內(nèi)參照)和GAPDH(其余蛋白內(nèi)參照)抗體,4℃孵育過夜;加入對應(yīng)Ⅱ抗,室溫孵育1 h。DAB顯色試劑盒避光顯色,蛋白凝膠成像儀(Tanon,型號:3500)拍照和定量分析。

        4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        GraphPad Prism 7.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較行單因素方差分析,組間兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 DEX對大鼠KOA的影響

        建模前,各組KOA評估值和膝關(guān)節(jié)直徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)。建模后,與對照組相比,模型組、DEX組和DEX+TLR4激活劑組KOA評估值、膝關(guān)節(jié)直徑升高(P<0.05)。給藥后,與對照組相比,模型組、DEX+TLR4激活劑組KOA評估值和膝關(guān)節(jié)直徑及DEX組KOA評估值升高(P<0.05);與模型組相比,DEX組KOA評估值和膝關(guān)節(jié)直徑及DEX+TLR4激活劑組KOA評估值降低(P<0.05);與DEX組相比,DEX+TLR4激活劑組KOA評估值和膝關(guān)節(jié)直徑升高(P<0.05)。見表1。

        表1 4組大鼠KOA評估值和膝關(guān)節(jié)直徑的比較Table 1.Comparison of KOA evaluation value and knee joint diameter in the 4 groups(Mean±SD.n=10)

        2 DEX對大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)的影響

        對照組滑膜組織、滑膜內(nèi)膜各層次完整,整齊排列;模型組出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象,纖維組織增生、滑膜細(xì)胞增生明顯,各層次排列紊亂,滑膜組織周圍出現(xiàn)較多毛細(xì)血管增生現(xiàn)象,呈重度滑膜炎現(xiàn)象;DEX組出現(xiàn)輕度炎癥浸潤現(xiàn)象,纖維組織、滑膜細(xì)胞存在部分增生,排列規(guī)則,滑膜組織周圍出現(xiàn)微量毛細(xì)血管增生現(xiàn)象,呈輕度滑膜炎現(xiàn)象;DEX+TLR4激活劑組呈中度滑膜炎現(xiàn)象。見圖1。

        Figure 1.Histological changes of knee synovium in the 4 groups(HEstaining,×200).圖1 4組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)

        3 DEX對大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞凋亡的影響

        分別與對照組和模型組相比,DEX組和DEX+TLR4激活劑組膝關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.05);與DEX組相比,DEX+TLR4激活劑組膝關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(P<0.05)。見圖2、表2。

        4 大鼠FLS的鑒定結(jié)果

        各組細(xì)胞分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞均呈紡錘形,與FLS形態(tài)基本一致。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分析顯示,VCAM-1呈陽性表達(dá),即培養(yǎng)細(xì)胞為FLS。見圖3。

        Figure 2.Apoptosis of synovial cells in the knee joint of rats in the 4 groups(TUNEL staining,×200).圖2 4組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞凋亡情況

        Figure 3.The morphological changes of FLS(×100)and the expression of its marker protein VCAM-1(cytoimmunofluorescence staining,×200).圖3 FLS的形態(tài)及標(biāo)志蛋白VCAM-1的表達(dá)

        5 DEX對FLS活力的影響

        與對照組相比,模型組、DEX組和DEX+TLR4激活劑組FLS的活力升高(P<0.05);與模型組相比,DEX組和DEX+TLR4激活劑組FLS活力降低(P<0.05);與DEX組相比,DEX+TLR4激活劑組FLS活力升高(P<0.05)。見表2。

        6 DEX對FLS凋亡的影響

        分別與對照組和模型組相比,DEX組和DEX+TLR4激活劑組FLS的凋亡率升高(P<0.05);與DEX組相比,DEX+TLR4激活劑組FLS的凋亡率降低(P<0.05)。見圖4、表2。

        表2 4組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(TUNEL染色)、FLS活力和FLS凋亡率(流式細(xì)胞術(shù))的比較Table 2.Comparisons of apoptotic index of synovial tissue cells in knee joint(by TUNEL staining),the viability of FLS,and the apoptotic index of FLS(by flow cytometry)in the 4 groups(%.Mean±SD.n=10)

        Figure 4.The representitive images of flow cytometry for analyzing the apoptosis of FLSin 4 groups.圖4 4組FLS凋亡情況的流式細(xì)胞術(shù)圖像

        7 DEX對FLS中TLR4、NF-κB p65、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

        與對照組相比,DEX組、DEX+TLR4激活劑組FLS中TLR4、cleaved caspase-3/caspase-3及核內(nèi)NF-κB p65蛋白水平,模型組FLS中TLR4和核內(nèi)NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05),模型組、DEX組和DEX+TLR4激活劑組FLS中核外NF-κB p65蛋白水平降低(P<0.05);與模型組相比,DEX組和DEX+TLR4激活劑組FLS中TLR4和核內(nèi)NF-κB p65蛋白水平降低(P<0.05),cleaved caspase-3/caspase-3和核外NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05);與DEX組相比,DEX+TLR4激活劑組FLS中TLR4和核內(nèi)NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05),cleaved caspase-3/cas?pase-3和核外NF-κB p65蛋白水平降低(P<0.05)。見圖5、表3。

        表3 4組FLS中TLR4、NF-4a p65、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平的比較Table 3.Comparisons of TLR4,NF-κB p65,caspase-3 and cleaved caspase-3 protein levels in FLSof the 4 groups(Mean±SD.n=10)

        Figure 5.The images of Western blot for determining the protein levels of TLR4,NF-κB p65,caspase-3 and cleaved caspase-3 in FLSof the 4 groups.圖5 4組FLS中TLR4、NF-κB p65、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平變化的比較

        討 論

        KOA中FLS增殖過度、凋亡不足,滑膜組織增生,表現(xiàn)為FLS類腫瘤樣會導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部結(jié)構(gòu)破壞[11]。誘導(dǎo)FLS凋亡能夠降低滑膜組織的異常增生,實(shí)現(xiàn)對疾病的緩解。DEX在KOA治療中常作為麻醉藥物,用于緩解術(shù)后鎮(zhèn)痛[12];隨著研究深入,研究發(fā)現(xiàn)DEX能夠影響細(xì)胞凋亡從而影響疾病,為DEX在KOA臨床上的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。在本研究中,KOA大鼠評估值升高、膝關(guān)節(jié)直徑增加,膝關(guān)節(jié)腫脹明顯,組織病理切片發(fā)現(xiàn)滑膜組織表現(xiàn)出炎癥浸潤明顯、滑膜細(xì)胞增生現(xiàn)象明顯,各層次紊亂嚴(yán)重,表現(xiàn)出重度滑膜炎現(xiàn)象,提示KOA中滑膜組織損傷嚴(yán)重。經(jīng)DEX治療后,KOA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理損傷減輕明顯,僅出現(xiàn)輕度炎癥浸潤現(xiàn)象,纖維組織、滑膜細(xì)胞存在部分增生,提示DEX能夠緩解滑膜細(xì)胞過度增生現(xiàn)象,實(shí)現(xiàn)對KOA大鼠的保護(hù)。進(jìn)一步TUNEL染色發(fā)現(xiàn)DEX治療后滑膜組織細(xì)胞凋亡指數(shù)升高,提示DEX可能是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而緩解KOA中滑膜細(xì)胞的過度生長現(xiàn)象,具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

        滑膜細(xì)胞分為A型滑膜細(xì)胞(巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞)和B型滑膜細(xì)胞(FLS),在KOA中以FLS為主,約占70%~80%。為驗(yàn)證KOA中FLS發(fā)揮的作用,本文提取原代FLS,又因VCAM-1作為FLS分子標(biāo)記之一,在FLS中大量表達(dá),而在其它成纖維細(xì)胞中不表達(dá)[13],因此本研究采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色鑒定FLS,研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞呈紡錘形,且VCAM-1呈陽性表達(dá),即提取細(xì)胞為FLS,可用于接下來研究。本研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)LS在KOA中生長加快、凋亡差異不明顯,提示FLS的異常生長卻不凋亡是滑膜組織異常增生的原因之一。

        在KOA模型大鼠FLS中TLR4、核內(nèi)NF-κB p65蛋白水平明顯升高,核外NF-κBp65蛋白水平明顯降低,提示TLR4/NF-κB在KOA大鼠FLS異常生長中發(fā)揮一定作用。而TLR4作為機(jī)體重要蛋白質(zhì)免疫分子,可調(diào)控多種非特異性免疫,在KOA中既可以激活機(jī)體免疫細(xì)胞應(yīng)答并誘導(dǎo)激發(fā)抗微生物防御系統(tǒng),產(chǎn)生更多炎癥因子,炎癥因子在NF-κB p65作用下參與疾病免疫過程[14];又可以影響細(xì)胞凋亡,從而影響疾?。?5],在KOA中抑制TLR4的表達(dá)能夠緩解疾病,實(shí)現(xiàn)對滑膜細(xì)胞異常增生的緩解[16]。NF-κB p65作為廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子,參與多種基因調(diào)控過程,作為TLR4下游調(diào)控因子,能夠由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi),刺激各種細(xì)胞因子等的表達(dá)[17]。TLR4/NF-κB通路與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切,荔枝核總黃酮在大鼠肝星狀細(xì)胞中抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡與抑制TLR4/NF-κB通路激活關(guān)系密切[18]。caspase-3作為促凋亡因子,在KOA中研究發(fā)現(xiàn),抑制凋亡相關(guān)蛋白caspase-1和caspase-3等的活化可抑制KOA的發(fā)生[19]。此外,DEX能夠抑制炎癥通路TLR4/NF-κB的表達(dá),實(shí)現(xiàn)對KOA的緩解[20]。在本研究中,經(jīng)DEX治療后KOA大鼠FLS存活率及細(xì)胞中TLR4、核內(nèi)NF-κBp65蛋白水平降低,凋亡率及細(xì)胞中核外NF-κB p65、cleaved caspase-3蛋白水平升高;在DEX基礎(chǔ)上添加TLR4激活劑LPS后,大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥浸潤程度加重,且滑膜組織細(xì)胞凋亡指數(shù)及FLS凋亡率降低,提示DEX抑制TLR4/NF-κB的表達(dá)從而促進(jìn)FLS細(xì)胞凋亡,實(shí)現(xiàn)對疾病的緩解。

        綜上所述,DEX通過下調(diào)TLR4表達(dá)、抑制NF-κB核移位從而促進(jìn)KOA中FLS凋亡,從而緩解滑膜組織異常增生,實(shí)現(xiàn)對疾病的保護(hù),為DEX在KOA中應(yīng)用提供新的依據(jù)。TLR4/NF-κB通路與炎癥關(guān)系密切,但在本研究中尚未做炎癥相關(guān)的探討,接下來這將作為研究重點(diǎn)深入探究。

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