馮 敏， 呂 琦， 林 婷， 陳霞霞， 楊小玲， 林開平， 溫俊平

（1福建省老年醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建福州350009；2福建省立醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建福州350001）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathies，DN）約占糖尿病患者的40%，是糖尿病最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致慢性腎臟病的主要原因［1］。研究發(fā)現(xiàn)，血清脂聯(lián)素（adiponectin，ADPN）水平與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生有密切聯(lián)系，ADPN可通過多種途徑保護(hù)高糖環(huán)境下的腎系膜細(xì)胞［2-3］，對延緩DN的進(jìn)程具有重要意義。微小RNA-221（microRNA-221，miR-221）是與腎臟生理功能密切相關(guān)的調(diào)節(jié)性miRNA，參與了ADPN抑制腎系膜細(xì)胞增殖的過程［4］。生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶組織抑制物3（tissue inhibitor of metalloproteinase 3，Timp3）是miR-221負(fù)調(diào)控的重要靶基因。Timp3在腎臟中高表達(dá)，是調(diào)控組織微環(huán)境和腎臟纖維化的重要因子，研究證實(shí)小鼠腎臟損傷和腎臟纖維化的發(fā)生與Timp3的表達(dá)缺失密切相關(guān)［5］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在體外高糖環(huán)境下，ADPN可通過下調(diào)miR-221靶向負(fù)調(diào)控Timp3表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對小鼠腎系膜細(xì)胞的增殖抑制作用［6］。因此，本研究擬通過構(gòu)建DN小鼠模型，探討ADPN在體內(nèi)調(diào)控miR-221/Timp3信號對小鼠腎臟生理功能和病理狀態(tài)的影響，以期進(jìn)一步揭示ADPN在DN中的保護(hù)機(jī)制。

材料和方法

1 動物

健康清潔級雄性C57BL/6小鼠36只，8周齡，體重約20~25 g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2012-0002。

2 主要試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma；血糖試紙購自強(qiáng)生公司；pcDNA 3.1質(zhì)粒、Lipo?fectamine 2000脂質(zhì)體和Trizol試劑均購自Invitro?gen；血清ADPN檢測試劑盒購自武漢云克隆科技公司；血清肌酐（serum creatinine，SCr）測定試劑盒購自Thermo Fisher；尿蛋白測定試劑盒購自R&D；Mir-X?miRNA First-Strand Synthesis Kit、Prime Script RT Master Mix和SYBR Advantage qPCR Premix均購自TaKaRa；miR-221抑制劑和miR-221抑制劑對照試劑均購自廣州銳博生物科技公司；抗Timp3和GAPDH鼠單克隆抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠II抗購自中杉金橋公司；引物由Invitrogen合成。

3 主要方法

3.1 DN小鼠模型的建立 36只清潔級C57BL/6小鼠，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)、自由進(jìn)食水、每日普通光照12 h的適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取6只為正常對照組（control組），其余30只被用于建立DN小鼠模型：高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，用0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.2）溶解STZ，按35 mg/kg的劑量腹腔注射，每天1次，連續(xù)5 d。以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L達(dá)3 d以上為糖尿病小鼠造模成功［7］。糖尿病小鼠模型在STZ注射4周以后，繼續(xù)高脂高糖喂養(yǎng)，每周留取一次24 h尿液標(biāo)本，應(yīng)用試劑盒測定24 h尿總蛋白（urine total protein，UTP）水平，當(dāng)24 h UTP≥30 mg提示DN小鼠模型建立成功。

3.2 脂質(zhì)體/pCMV-ADPN轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備 根據(jù)Lipofectamine 2000說明書，重組質(zhì)粒pCMV-ADPN或pcDNA 3.1與脂質(zhì)體按1μg∶0.5μL的比例配制成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，用量根據(jù)小鼠體重按1μg/g的劑量進(jìn)行腹腔注射，每周注射1次，連續(xù)8周，進(jìn)行重組質(zhì)粒pCMV-ADPN的轉(zhuǎn)染［8］。

3.3 實(shí)驗(yàn)動物的分組與干預(yù) 造模成功后的DN小鼠根據(jù)干預(yù)因素的不同被隨機(jī)分為5組：（1）DN組：造模成功后不給予任何處理；（2）pCMV-ADPN轉(zhuǎn)染組（DA組）：造模成功后將配制好的脂質(zhì)體/pCMVADPN轉(zhuǎn)染復(fù)合物腹腔注射入小鼠體內(nèi)，每周1次，連續(xù)8周；（3）空載體組（DP組）：造模成功后將配制好的脂質(zhì)體/pcDNA 3.1轉(zhuǎn)染復(fù)合物腹腔注射入小鼠體內(nèi)，每周1次，連續(xù)8周；（4）miR-221抑制劑組（DM組）：造模成功后，根據(jù)小鼠體重按1μg/g的劑量，尾靜脈注射內(nèi)源性miR-221抑制劑，每周1次，連續(xù)8周；（5）miR-221抑制劑對照組（DC組）：造模成功后尾靜脈注射miR-221抑制劑對照試劑，每周1次，連續(xù)8周。

3.4 血、尿標(biāo)本和腎臟重量的檢測 各組連續(xù)干預(yù)8周后，稱取小鼠體重（body weight，BW）；每周一次將小鼠置于金屬代謝籠中，用代謝籠收集小鼠24 h尿液標(biāo)本并檢測UTP水平；腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉小鼠后心尖采血并分離血清，檢測SCr和血清ADPN水平；采血后剖腹，經(jīng)腹主動脈灌注生理鹽水后稱取腎臟重量（kidney weight，KW），由KW（mg）與BW（g）比值得出腎臟肥大指數(shù)（KW/BW）。

3.5 腎臟組織的病理學(xué)檢查 用10%水合氯醛按3 mL/kg的劑量腹腔注射，麻醉后取出雙腎，將部分腎組織經(jīng)10%福爾馬林固定、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、4μm厚切片后，常規(guī)HE染色，在顯微鏡下觀察腎臟組織的病理學(xué)改變。

3.6 RT-qPCR檢測腎組織miR-221和Timp3 mRNA的表達(dá) Trizol試劑一步法提取腎組織總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行miR-221和Timp3的cDNA合成。應(yīng)用SYBR Advantage qPCR Premix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增（25μL的反應(yīng)體系）。miR-221的上游引物序列為5'-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3'，下游引物為Mir-X?miRNA First-Strand Synthesis Kit提供的通用引物mRQ 3'Primer；其內(nèi)參照U6的上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。Timp3的上游引物序列為5'-CGTGCAGTACATTCACACG?GAAG-3'，下游引物序列為5'-ACCCAGGTGGTAGC?GGTAATTG-3'；其內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'，下游引物序列為5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。反應(yīng)條件為：95℃30 s；95℃5 s，58℃1 min，40個循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

3.7 Western blot檢測腎組織Timp3的蛋白表達(dá)將小鼠腎組織研磨后加入裂解液，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取30μg總蛋白，進(jìn)行10%SDS-PAGE，接著以300 mA電轉(zhuǎn)膜1.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到醋酸纖維膜上。在室溫下應(yīng)用5%的脫脂奶粉封閉醋酸纖維膜條2 h，分別與抗Timp3鼠單克隆抗體和抗GAPDH鼠單克隆抗體4℃孵育過夜，洗膜后分別與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠Ⅱ抗孵育1 h，加入ECL發(fā)光劑后在暗室曝光顯影，應(yīng)用圖像分析掃描軟件對條帶進(jìn)行灰度分析并計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行資料分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ADPN過表達(dá)對小鼠血清ADPN及腎功能的影響

DN小鼠成模后，與control組比較，DN組小鼠血清ADPN水平顯著降低（P<0.05），而24 h UTP水平顯著升高（P<0.05）；pCMV-ADPN連續(xù)干預(yù)8周后，與DP組比較，DA組小鼠血清ADPN水平顯著升高（P<0.05），而24 h UTP顯著降低（P<0.05）；DA組小鼠SCr水平雖有所降低，但與DP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P>0.05），見表1。

表1 ADPN過表達(dá)后小鼠血清ADPN水平及腎功能的變化Table 1.The changes of serum ADPN level and renal function after over-expression of ADPN gene（Mean±SD.n=6）

2 ADPN過表達(dá)對小鼠體重、腎臟重量及腎臟肥大指數(shù)的影響

DN小鼠成模后，與control組比較，DN組小鼠體重顯著下降（P<0.05），腎臟重量顯著增加（P<0.05），KW/BW顯著升高（P<0.05）；pCMV-ADPN連續(xù)干預(yù)8周后，與DP組比較，DA組小鼠體重顯著增加（P<0.05），腎臟重量顯著減輕（P<0.05），KW/BW顯著降低（P<0.05），見圖1。

3 ADPN過表達(dá)對小鼠腎臟miR-221和Timp3表達(dá)的影響

DN小鼠成模后，與control組比較，DN組小鼠腎臟miR-221相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05），而Timp3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）；轉(zhuǎn)染pCMV-ADPN后，與DP組比較，DA組miR-221表達(dá)被抑制（P<0.05），Timp3的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（P<0.05），見圖2。

Figure 1.The changes of body weight（BW），kidney weight（KW）and renal hypertrophy index（KW/BW）after over-expression of ADPN gene.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs DPgroup.圖1 ADPN過表達(dá)后小鼠體重、腎臟重量及腎臟肥大指數(shù)的變化

4 抑制miR-221對小鼠腎臟miR-221和Timp3表達(dá)水平的影響

miR-221抑制劑尾靜脈注射后，與DC組比較，DM組小鼠腎臟miR-221表達(dá)被抑制（P<0.05），而Timp3的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），見圖3。

5 抑制miR-221對小鼠腎功能的影響

miR-221抑制劑尾靜脈注射后，DM組小鼠SCr水平有所下降，但與DC組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P>0.05），而24 h UTP水平降低，與DC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 miR-221阻斷后小鼠腎功能的變化Table 2.The changes of renal function after treatment with miR-221 inhibitor（Mean±SD.n=6）

6 抑制miR-221對小鼠體重、腎臟重量及腎臟肥大指數(shù)的影響

與control組比較，DC組小鼠體重顯著下降（P<0.05），腎臟重量顯著增加（P<0.05），KW/BW顯著升高（P<0.05）；miR-221抑制劑尾靜脈注射8周后，與DC組比較，DM組小鼠體重顯著增加（P<0.05），腎臟重量顯著減輕（P<0.05），KW/BW顯著降低（P<0.05），見圖4。

7 ADPN過表達(dá)和抑制miR-221對小鼠腎臟組織病理形態(tài)的影響

光鏡下HE染色顯示，control組小鼠腎臟腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，毛細(xì)血管清晰可見；造模成功后，DN組小鼠出現(xiàn)明顯的腎組織損傷，可見腎小球體積增大，系膜細(xì)胞增生，腎小管水腫明顯，部分腎小管上皮細(xì)胞見顆粒狀或空泡樣變性、萎縮、壞死；而分別給予pCMV-ADPN轉(zhuǎn)染和miR-221抑制劑干預(yù)后的DA組和DM組，腎組織病理損傷明顯減輕，表現(xiàn)為腎小管和腎小球損害明顯減輕，系膜細(xì)胞增生減少，見圖5。

Figure 2.The changes of renal expression of miR-221（A）and Timp3（B and C）after over-expression of ADPN gene.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs DPgroup.圖2 ADPN過表達(dá)后小鼠腎臟miR-221和Timp3表達(dá)水平的變化

討 論

DN是由于糖尿病患者腎臟中發(fā)生特定的病理改變和功能變化所導(dǎo)致的以尿蛋白增多、腎小球高濾過，逐漸發(fā)展為腎小球?yàn)V過率下降、SCr升高，最終出現(xiàn)腎衰竭為主要臨床表現(xiàn)的綜合征，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，臨床治療手段有限。

Figure 3.The changes of renal expression of miR-221（A）and Timp3（Band C）after treatment with miR-221 inhibi?tor.Mean±SD.n=6.△P<0.05 vs DCgroup.圖3 抑制miR-221后小鼠腎臟miR-221和Timp3的表達(dá)變化

Figure 4.The changes of body weight（BW），kidney weight（KW）and renal hypertrophy index（KW/BW）after treatment with miR-221 inhibitor.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；△P<0.05 vs DCgroup.圖4 抑制miR-221后小鼠體重、腎臟重量及腎臟肥大指數(shù)的變化

Figure 5.The pathological changes of renal tissues after over-ex?pression of ADPN gene or treatment with miR-221 in?hibitor（HEstaining，×400）.圖5 ADPN過表達(dá)和抑制miR-221后小鼠腎臟組織的病理學(xué)變化

ADPN是由脂肪細(xì)胞分泌的一種生物活性多肽，具有抗炎和抗氧化應(yīng)激等作用，其活性水平與高血糖所致腎臟細(xì)胞內(nèi)炎癥、氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，可通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子的表達(dá)及AMPK信號通路減輕腎臟細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷［9-10］。在ADPN基因敲除的小鼠中，尿白蛋白增加、腎小球肥大和腎小管間質(zhì)纖維化均更顯著［3］。在腎小管-間質(zhì)纖維化小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，羅格列酮可通過提高ADPN水平而抑制炎癥因子釋放，并下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1（trans?forming growth factor-β1，TGF-β1）的表達(dá)，從而減緩DN進(jìn)程和腎小管間質(zhì)纖維化［11］。這些對動物模型的實(shí)驗(yàn)研究表明，ADPN對延緩DN的發(fā)生發(fā)展具有重要作用，對DN的臨床治療具有潛在的應(yīng)用價值。

miRNA是一類內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼RNA分子，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而抑制靶蛋白的表達(dá)，對細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝等發(fā)揮調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中許多miRNA的表達(dá)水平可以發(fā)生改變，同時DN患者足細(xì)胞損傷與血液、尿液和腎臟中的miRNA表達(dá)水平之間具有顯著相關(guān)性［12］。已有研究表明，多個miRNA在DN的發(fā)生過程中起重要作用。在體外高糖環(huán)境的刺激下，腎系膜細(xì)胞增生伴有miR-34a表達(dá)增高，生長停滯特異性蛋白1（growth arrest-specific protein 1，GAS1）是miR-34a的靶基因，抑制miR-34a/GAS1信號可抑制腎系膜細(xì)胞的增生和腎小球的肥大［13］。另有研究顯示，抑制miR-135a表達(dá)也能夠降低DN中腎系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的聚集，進(jìn)而阻止腎臟纖維化［14］。在經(jīng)TGF-β處理的腎系膜細(xì)胞中，miR-216a、miR-217和miR-200均表達(dá)上調(diào)，并能夠激活PI3K/Akt信號通路，引起腎系膜細(xì)胞增生、肥大及細(xì)胞外基質(zhì)的生成［15］。隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)以及miRNA失調(diào)在DN發(fā)病機(jī)制中的重要作用，越來越多的證據(jù)顯示miRNA可能是DN潛在的生物學(xué)標(biāo)志物及藥物治療新靶點(diǎn)［16-17］。基于此，我們在前期的體外實(shí)驗(yàn)中，篩選出能夠參與改善胰島素抵抗作用并受ADPN信號調(diào)控的miR-221作為研究對象，經(jīng)過生物信息學(xué)技術(shù)和螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證Timp3是miR-221的靶基因，并經(jīng)體外研究證實(shí)在高糖培養(yǎng)環(huán)境下小鼠腎系膜細(xì)胞的增殖與miR-221的表達(dá)水平呈正相關(guān)，且這種增殖效應(yīng)能夠被ADPN抑制，在減緩細(xì)胞增殖的同時，ADPN可顯著抑制miR-221并上調(diào)Timp3基因的表達(dá)［6］。同期有研究發(fā)現(xiàn)，在DN足細(xì)胞損傷的過程中，miR-221通過直接靶向DKK2（Dickkopf-related protein 2）基因的表達(dá)，調(diào)控Wnt/βcatenin信號并介導(dǎo)近端小管細(xì)胞的損傷［18］。

Timp3是TIMPs家族在腎臟中表達(dá)水平最高的一種細(xì)胞因子。Timp3基因表達(dá)缺失的小鼠模型表現(xiàn)出對腎臟纖維化的敏感性增高；Timp3的表達(dá)上調(diào)可抑制高糖刺激下腎小管導(dǎo)管上皮細(xì)胞的纖維化進(jìn)程［19］。Timp3表達(dá)缺失能夠加重DN小鼠的腎臟損害，主要表現(xiàn)為間質(zhì)性腎炎、間質(zhì)纖維化、腎臟重量增加、腎小球系膜基質(zhì)增厚、尿蛋白排泄增加等［20-21］。為驗(yàn)證在體內(nèi)環(huán)境下ADPN是否通過調(diào)控miR-221/Timp3信號對DN小鼠腎臟產(chǎn)生保護(hù)作用，本研究通過構(gòu)建DN小鼠模型并轉(zhuǎn)染ADPN過表達(dá)質(zhì)粒，觀察體內(nèi)高ADPN水平對小鼠腎臟生理功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)轉(zhuǎn)染pCMV-ADPN的DN小鼠，24 h UTP顯著低于轉(zhuǎn)染對照組，同時轉(zhuǎn)染后的DN小鼠體重增加，腎臟重量減輕，KW/BW降低，表明在ADPN的作用下，DN小鼠的腎臟生理功能得到明顯改善。進(jìn)一步給予DN小鼠轉(zhuǎn)染miR-221抑制劑后，在24 h UTP水平、小鼠體重、腎臟重量及KW/BW等方面獲得了與ADPN作用一致的結(jié)果。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ADPN對DN小鼠腎臟生理功能的改善作用與miR-221的介導(dǎo)密切相關(guān)。

此外，本研究應(yīng)用RT-qPCR檢測小鼠腎組織發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pCMV-ADPN后，miR-221在DN小鼠腎組織中表達(dá)下調(diào)，而Timp3表達(dá)增強(qiáng)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在DN小鼠腎組織中Timp3蛋白表達(dá)水平與mi-221水平呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合前期的螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)［6］，表明Timp3表達(dá)是受mi-221靶向負(fù)調(diào)控。給予miR-221抑制劑后，Timp3的表達(dá)改變與ADPN作用一致。由此可以證實(shí)ADPN對DN小鼠的腎臟保護(hù)作用是通過調(diào)控miR-221/Timp3信號來實(shí)現(xiàn)的。

基于腎系膜細(xì)胞增殖肥大、基底膜增厚及腎小球硬化是DN的基本病理特征［22］。在本研究中，DN小鼠造模成功后，DN小鼠出現(xiàn)明顯的腎組織損傷，表現(xiàn)為腎小球體積增大，系膜細(xì)胞增生，腎小管水腫，腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性、萎縮、壞死。在分別給予pCMV-ADPN轉(zhuǎn)染及miR-221抑制劑后，DN小鼠腎組織病理損傷明顯減輕，表現(xiàn)為腎小管和腎小球損傷明顯減輕，系膜細(xì)胞增生減少，提示ADPN可以改善DN小鼠腎臟的病理狀態(tài)，是ADPN在體內(nèi)發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的有力證據(jù)。

綜上所述，本研究從實(shí)驗(yàn)動物水平上證實(shí)ADPN可以改善DN小鼠的腎臟生理功能和病理狀態(tài)，miR-221/Timp3信號調(diào)控是ADPN發(fā)揮作用的重要途徑。ADPN調(diào)控該信號有望成為DN的治療新靶點(diǎn)，為DN的防治提供新的思路。