霍志鵬, 劉 迪, 邱 峰

(天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院 組分中藥國家重點實驗室，天津 301617)

近年來氘代藥物逐漸成為新藥研發(fā)的熱點之一，氘代藥物因氘(D)元素的同位素效應(yīng)，有減緩藥物代謝、改善藥代動力學(xué)、減少毒性代謝產(chǎn)物以及抑制藥物間的相互作用等優(yōu)勢。在原有上市藥物或活性成分基礎(chǔ)上進行氘代設(shè)計為常用策略，在保持原藥物療效的基礎(chǔ)上，有望改善該藥的代謝特性，降低用藥劑量，發(fā)揮更穩(wěn)定的治療作用[1-2]。穩(wěn)定同位素標記藥物在生物樣品檢測中作為內(nèi)標也有廣泛的應(yīng)用，在《中國藥典》2020年版通則“9012 生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則”中推薦生物樣品質(zhì)譜檢測時，盡可能使用穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)標[3]。脫水穿心蓮內(nèi)酯(穿心蓮丁素)為穿心蓮Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees的主要活性成分之一，現(xiàn)代藥理研究顯示，脫水穿心內(nèi)酯和其衍生物具有具有抗炎、抗癌以及抗病毒等藥理活性[4-6]。

Scheme 1

本研究合成了脫水穿心蓮內(nèi)酯15-位兩個氘原子取代的15-二氘脫水穿心蓮內(nèi)酯，并考察了其在不同pH下的H-D交換速率，以期為脫水穿心蓮內(nèi)酯和其衍生物的氘代藥物合成提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Advance 400 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標)；LC-IT-TOFMS型液相聯(lián)用離子阱飛行時間質(zhì)譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 15-二氘脫水穿心蓮內(nèi)酯的合成

量取四氫呋喃10 mL，加入無水亞硫酸2.0 g，振搖1 min，靜置24 h后取上層除水的四氫呋喃備用。將上述四氫呋喃2 mL和氧化氘1 mL混勻，加入脫水穿心內(nèi)酯(1) 30 mg，三乙胺50 μL，60 ℃反應(yīng)4 h。減壓除去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱(洗脫劑：二氯甲烷/乙酸乙酯=1/0～4/1,V/V)層析純化，收集(二氯甲烷/乙酸乙酯=4/1,V/V)主要流分，旋蒸濃縮蒸干后得白色粉末狀固體(A)21 mg。

15-二氘脫水穿心蓮內(nèi)酯(A): 白色粉末狀固體，收率70%;1H NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 7.63(brs, 1H), 6.75(dd,J=15.8 Hz, 10.1 Hz, 1H), 6.13(d,J=15.8 Hz, 1H), 4.87(brs, 0.05H), 4.73(brs, 1H), 4.42H(brs, 1H), 3.85(d,J=10.9 Hz, 1H), 3.27(d,J=10.9 Hz, 1H), 3.22(m, 1H), 1.10(s, 3H), 0.76(s, 3H)；13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 172.5, 148.9, 146.6, 134.3, 127.3, 121.3, 108.1, 78.6, 69.8, 62.6, 60.6, 53.8, 42.4, 38.3, 38.0, 36.3, 27.6, 27.6, 23.0, 15.5; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C20H26D2O4{[M+Na]+}357.2005, found 357.1993。

脫水穿心蓮內(nèi)酯(B)： 白色粉末狀固體，收率85%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.65(brs, 1H), 6.75(dd,J=15.8 Hz, 10.1 Hz, 1H), 6.13(d,J=15.8 Hz, 1H), 4.89(brs, 2H), 4.73(brs, 1H), 4.42H(brs, 1H), 3.84(d,J=10.9 Hz, 1H), 3.27(d,J=10.9 Hz, 1H), 3.22(m, 1H), 1.10(s, 3H), 0.76(s, 3H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 172.4, 148.9, 146.8, 134.3, 127.1, 121.3, 108.1, 78.5, 70.2, 62.6, 60.6, 53.8, 42.4, 38.3, 38.0, 36.3, 27.6, 27.6, 23.0, 15.5; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C20H28O4{[M+Na]+}355.1880, found 350.1886。

1.3 15-二氘脫水穿心蓮內(nèi)酯在不同pH緩沖溶液中氘代的交換速率

用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉分別配置成0.067 mol·L-1的pH 分別為6、 7和 8的磷酸緩沖液。用碳酸鈉、碳酸氫鈉配置成0.1 mol·L-1的pH為10的緩沖液。取反應(yīng)產(chǎn)物用甲醇配置成0.1 mg·mL-1溶液，分別取1 mL 15-二氘脫水穿心蓮內(nèi)酯溶液，與上述pH分別為6， 7， 8和10的緩沖液1 mL混合，搖勻。室溫放置，分別于不同的時間用LC-IT-TOFMS檢測氘元素保留速率。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成條件的選擇

脫水穿心蓮內(nèi)酯在水中難溶，本研究采用了無活性質(zhì)子溶劑非氘代四氫呋喃作為輔助溶劑以使脫水穿心蓮內(nèi)酯全部溶解。結(jié)果顯示，四氫呋喃中的H在反應(yīng)中無明顯的H-D交換，產(chǎn)物脫水穿心蓮內(nèi)酯-d2在15-氘代比例大于85%，在反應(yīng)產(chǎn)物的硅膠柱純化中使用的二氯甲烷和乙酸乙酯也為非氘代試劑。使用非氘代溶劑在H-D交換反應(yīng)中助溶，可節(jié)約試劑成本。

δ

2.2 15-二氘脫水穿心蓮內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)表征

反應(yīng)原料脫水穿心蓮內(nèi)酯與文獻報道的脫水穿心蓮內(nèi)酯特征一致[7]，反應(yīng)產(chǎn)物和脫水穿心蓮內(nèi)酯相比，15-H信號明顯降低，積分僅為0.05個H[8]， 15-C信號因和兩個磁不等價D核耦合裂分，明顯降低，D核量子自旋數(shù)為1，單個D核取代產(chǎn)生(2nI+1)=3重裂分[9-11]， 兩個磁不等價D核理論上可對15-C可形成(2nI+1)×(2nI+1)=9重裂分，文中13C NMR圖譜因裂分后峰高降低較多，受基線噪音干擾，未觀察到裂分的細微結(jié)構(gòu)(見圖1和2)。反應(yīng)產(chǎn)物15-C信號向高場移動了0.4 ppm，和文獻報道的D元素同位素效應(yīng)引起的位移變化方向一致[10-12]。

δ

文獻報道堿催化用于羰基鄰位(α-位) C—H 鍵氫氘交換，因羰基的吸電子作用，酸性增強，在堿性催化下可與氘代水(氧化氘)發(fā)生氫氘交換[13-15]。脫水穿心蓮內(nèi)酯15-H為α，β-不飽和羰基的γ-位，本研究通過堿催化合成了15-二氘的脫水穿心蓮內(nèi)酯，表明羰基的吸電子作用可通過共軛的π鍵影響γ-位，使γ-位的酸性增強。脫水穿心蓮內(nèi)酯7-H為烯鍵的臨位，反應(yīng)產(chǎn)物中未發(fā)現(xiàn)7-H的氘代，提示單一烯鍵的α-位酸性較α，β-不飽和羰基中烯鍵的臨位弱。C—H鍵的氘代速率一定程度上反映了該位點氫解離能力。氘代后化合物在氘代位置的1H NMR譜和13C NMR在對應(yīng)位置有明顯變化，H信號降低或消失，在全去耦合碳譜的中由于不能完全去掉D核對13C核的耦合，C—D連接的碳譜信號因D核的裂分降低。化合物的氘代對化學(xué)特性和結(jié)構(gòu)鑒定研究也有一定的輔助作用。

2.3 15-二氘脫水穿心蓮內(nèi)酯在不同pH緩沖溶液中氘代的交換速率

兩個15-D取代時質(zhì)譜上信號較原化合物m/z增加2，一個氘原子取代時，質(zhì)譜信號較原化合物m/z增加1。因C13自然豐度較高，原化合物存在天然的+1和+2的同位素信號，計算氘原子比例應(yīng)將天然同位素豐度的影響考慮在內(nèi)。15-二氘脫水穿心蓮內(nèi)酯內(nèi)酯在pH 分別為6， 7和8的溶液中0， 2， 4， 8， 12， 20和192 h的15-氘原子保留比例見表1，在20 h內(nèi)上述3個pH值溶液的保留比例無明顯降低，在192 h， pH為6的氘原子比例變化不明顯，pH為7的保留比例為77.4%， pH為8的保留比例為49.1%。 pH為10溶液中0～20 h的D原子保留比例見圖3，在pH為10溶液中氘原子比例降低較快，4 h降低至45%， 20 h降低至1.7%。脫水穿心蓮內(nèi)酯15-H與D交換速率在接近中性的溶液中交換速率較慢，隨pH升高交換速率加快。

表1 15-二氘脫水穿心蓮內(nèi)酯的C-15位D原子保留比例

Time/h

因氘代試劑成本所限，本研究僅考察了D交換回H的速率，未考察H交換為D速率。D交換回H的速率可為化合物在后續(xù)的穩(wěn)定使用提供支持，藥物服用后一般在數(shù)小時內(nèi)在體內(nèi)發(fā)揮藥效，15-二氘脫水穿心蓮內(nèi)酯在pH 6～8溶液中20 h無明顯交換，提示其在近似pH值的生理環(huán)境中可保持D元素在較高比例。

合成并表征了15-二氘脫水穿心蓮內(nèi)酯，考察了15-二氘脫水穿心蓮內(nèi)酯在不同pH值溶液中的H-D交換速率，探討了為α，β-不飽和羰基的γ位氫的酸性。合成的氘代化合物可用于后續(xù)生物活性研究，或用于質(zhì)譜檢測的內(nèi)標。