顧宏霞, 王 宇, 戴衛(wèi)國, 何黎琴*

(1. 皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)系，安徽 六安 273000； 2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230038)

心腦血管疾病對人類健康造成了極大威脅。多方面因素會導(dǎo)致心腦血管疾病，其中血栓是最主要的因素之一[1]。臨床研究證實(shí)，抗血小板藥物能夠有效降低常見的心腦血管疾病(如心肌梗死、冠心病、腦缺血、中風(fēng)、腦梗死)的發(fā)病率。目前常用的抗血小板藥物有環(huán)氧酶抑制劑(如阿司匹林)、腺苷受體拮抗劑(如氯吡格雷)等。使用這類藥物治療時，也會導(dǎo)致藥物抵抗、出血等不良反應(yīng)[2]。因此，進(jìn)一步尋找療效強(qiáng)、副作用小的抗血小板藥物成為研究重點(diǎn)。

丹皮酚是傳統(tǒng)中藥牡丹皮的有效成分，具有多種藥理活性，且分子量小，利于進(jìn)一步修飾改造[3-7]。本研究室針對丹皮酚易氧化代謝、水溶性小及易升華等[8]不足進(jìn)行了修飾，對丹皮酚2-位羥基羧甲基化后再與不同的有機(jī)胺偶聯(lián)，得到了穩(wěn)定性好、且具有較好水溶性的系列丹皮酚衍生物，體外抗血小板聚集活性結(jié)果顯示，部分目標(biāo)化合物的活性強(qiáng)于對照藥阿司匹林[9-10]。

肟類化合物具有強(qiáng)的抗血小板聚集活性[11-13]。本研究室前期的研究也表明，將丹皮酚2-位羥基乙基化后再將其酮羰基肟化，得到的乙基丹皮酚肟顯示出較強(qiáng)的抗血小板聚集活性[9]。在此基礎(chǔ)上，為探究丹皮酚2-位羥基不同烴基取代對抗血小板聚集活性的影響，設(shè)計并合成了7個不同烴基取代的丹皮酚肟衍生物，并對其進(jìn)行了抗血小板聚集活性測試。結(jié)果表明，2-位芐基取代的丹皮酚肟具有強(qiáng)的抗血小板聚集活性，但是水溶性較差(研究結(jié)果待發(fā)表)。為改善其水溶性，本研究利用其肟羥基通過連接臂與不同的有機(jī)胺偶聯(lián)，得到了芐基丹皮酚肟胺基醚類衍生物(Scheme 1):以丹皮酚為原料，在堿性條件下與相應(yīng)的氯芐反應(yīng)，得到芐基丹皮酚(1)；1與鹽酸羥胺反應(yīng)得到相應(yīng)的肟(2)；2與1,4-二溴丁烷反應(yīng)，得到芐基丹皮酚肟溴代丁基醚(3)；化合物3與不同的有機(jī)胺結(jié)合，得到芐基丹皮酚肟胺基醇醚類衍生物(4)。

Scheme 1

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

WRS-1B型熔點(diǎn)儀；Thermo Nicolet Avatar 370DTGS型紅外光譜儀(KBr壓片)；Bruker AVⅢ 600 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；Finnigan LCQ Advantage MAX型液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀。

所用試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 合成

(1)1的合成[7]

取丹皮酚(1.00 g, 6.00 mmol)、氫氧化鈉(0.36 g, 9.00 mmol)和10 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)加入50 mL圓底燒瓶中，攪拌0.5 h；加入氯芐(1 mL， 9.00 mmol)，攪拌下于45 ℃反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC跟蹤,展開劑：乙酸乙酯/石油醚=1/8,V/V)。將反應(yīng)液倒入100 mL水中，用二氯甲烷(3×50 mL)萃取，合并有機(jī)相，依次用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化得白色粉末11.11 g，產(chǎn)率72.2%， m.p.81.2～81.5 ℃。

(2)2的合成[9]

取芐基丹皮酚(2.71 g， 10.00 mmol)加入50 mL圓底燒瓶中，加入30 mL無水乙醇溶解，依次加入鹽酸羥胺(2.08 g， 30.00 mmol)和吡啶(4 mL， 49.70 mmol)，攪拌下于50 ℃反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC跟蹤)。冷卻至室溫，攪拌下倒入1 L冰水中，析出白色固體，抽濾，粗品用95%乙醇重結(jié)晶得黃灰色粉末2，產(chǎn)率91.2%， m.p.111.6～114.6 ℃; HR-MS(ESI)m/z: 272.1308{[M+H]+}; IRν: 3014(Ph-H), 2935, 2818(C—H), 1606(C=O), 1502, 1494(C=C) cm-1;1H NMR(600 MHz, DMSOd6)δ: 10.84(s, 1H), 7.42(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.37(t,J=8.4 Hz, 2H), 7.32(t,J=8.4 Hz, 1H), 7.13(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.68(s, 1H), 6.65(d,J=8.4 Hz, 1H), 5.12(s, 2H), 3.75(s, 3H), 2.01(s, 3H)。

(3)3的合成[9]

取800mg(2.95 mmol)芐基丹皮酚肟加入50 mL圓底燒瓶中，用4 mL DMF溶解；冰浴冷卻，加入NaH(0.21 g, 8.86 mmol)，攪拌至無氣泡產(chǎn)生時加入1,4-二溴丁烷(1.20 mL, 10.17 mmol)，反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC跟蹤)。向反應(yīng)液中加入100 mL冰水，用二氯甲烷(3×50 mL)萃取，合并有機(jī)相，減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化得無色油狀液體31.07 g，產(chǎn)率81.3%。

(4)4a～4e的合成通法

取3(0.20 g， 0.49 mmol)和有機(jī)胺(2.45 mmol)加入25 mL 圓底燒瓶中，加入2 mL乙腈溶解，回流反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC跟蹤)。加入50 mL水，用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至8～9，用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，合并有機(jī)相，用50 mL飽和食鹽水洗滌，減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化得目標(biāo)化合物4a～4e。

芐基丹皮酚肟-4-(4-乙基-哌嗪基)丁基醚(4a)： 黃色油狀液體160 mg，產(chǎn)率74.7%; HR-MS(ESI)m/z: 440.2012{[M+H]+};1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.43～7.34(m, 4H), 7.31～7.28(m, 1H), 7.25～7.22(m, 1H), 6.51～6.45(m, 2H), 5.08(s, 2H), 4.15(t,J=6.9 Hz, 2H), 3.78(s, 3H), 2.42～2.34(m, 12H), 2.16(s, 3H), 1.74～1.67(m, 2H), 1.64～1.56(m, 2H), 1.20(t,J=6.9 Hz, 3H); IRν： 3012, 2942, 2878, 1658(C=N), 1613, 1528, 1545(C=C), 882(N—O) cm-1。

芐基丹皮酚肟-4-(哌啶基)丁基醚(4b)： 黃色油狀液體121.8 mg，產(chǎn)率58.00%; HR-MS(ESI)m/z: 411.2673{[M+H]+};1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.41～7.35(m, 4H), 7.31～7.28(m, 1H), 7.27(s, 1H), 6.52～ 6.47(m, 2H), 5.06(s, 2H), 4.15(t,J=6.9 Hz, 2H), 3.78(s, 3H), 2.40～2.35(m, 6H), 2.17(s, 3H), 1.72～1.68(m, 2H), 1.65～1.57(m, 6H), 1.45～1.40(m, 2H); IR(KBr)ν：3025, 2938, 2875, 1662(C=N), 1615, 1520, 1505(C=C), 876(N—O) cm-1。

芐基丹皮酚肟-4-(二乙胺基)丁基醚(4c)： 黃色油狀液體88.5 mg，產(chǎn)率45.2%; HR-MS(ESI)m/z: 399.2675{[M+H]+};1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.44～7.34(m, 4H), 7.31(t,J=8.4 Hz, 1H), 7.28～7.23(m, 1H), 6.54～6.43(m, 2H), 5.06(s, 2H), 4.15(t,J=6.9 Hz, 2H), 3.78(s, 3H), 2.40～2.35(m, 6H), 2.17(s, 3H), 1.74～1.68(m, 2H), 1.62～1.57(m, 2H), 1.19(t,J=6.9 Hz, 6H); IRν： 3096, 2934, 2876, 1658(C=N), 1616, 1521, 1501(C=C), 874(N—O) cm-1。

芐基丹皮酚肟-4-(4-甲基-哌嗪基)丁基醚(4d)： 黃色油狀液體117.8 mg，產(chǎn)率56.5%; HR-MS(ESI)m/z: 426.2788{[M+H]+};1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.41～7.35(m, 4H), 7.33～7.29(m, 1H), 7.25(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.52～6.46(m, 2H), 5.06(s, 2H), 4.15(t,J=6.9 Hz, 2H), 3.78(s, 3H), 2.40～2.35(m, 10H), 2.30(s, 3H), 2.17(s, 3H), 1.74～1.68(m, 2H), 1.62～1.57(m, 2H); IRν: 3056, 2932, 1658(C=N), 1612, 1 521, 1502(C=C), 872(N—O) cm-1。

芐基丹皮酚肟-4-(嗎啉基)丁基醚(4e): 黃色油狀液體94.2 mg，產(chǎn)率46.5%; HR-MS(ESI)m/z: 413.2468{[M+H]+};1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.41～7.34(m, 4H), 7.33～7.28(m, 1H), 7.28～7.22(m, 1H), 6.53～6.43(m, 2H), 5.06(s, 2H), 4.15(t,J=6.9 Hz, 2H), 4.05(t,J=6.9 Hz, 4H), 3.78(s, 3H), 2.60～2.32(m, 6H), 2.17(s, 3H), 1.75～1.67(m, 2H), 1.63～1.58(m, 2H); IRν: 3048, 2932, 1655(C=N), 1614, 1518, 1501(C=C), 869(N—O) cm-1。

1.3 藥理實(shí)驗

取健康雄性家兔，按30 mg·kg-1的劑量耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉生理鹽水溶液，使其麻醉，手術(shù)分離頸總動脈取血，收集于塑料離心管中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.2%的枸櫞酸鈉水溶液抗凝(血與抗凝劑體積比為 9/1)。于800 r·min-1離心10 min，制備富血小板血漿(PRP)；于3000 r·min-1離心10 min，制備貧血小板血漿(PPP)，按比濁法進(jìn)行血小板聚集實(shí)驗[10 ]。將樣品溶于DMSO中，加生理鹽水稀釋至所需濃度，加樣量為 100 μL，終濃度50 μmol·L-1。測試杯中加入PRP 300 μL、溶劑或受試樣品10 μL，在 37 ℃預(yù)溫孔內(nèi)預(yù)溫 1 min，將測試杯轉(zhuǎn)入測試通道，加入誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(ADP，終濃度 50 μmol·L-1)10 μL，觀察記錄 5 min 內(nèi)最大聚集(MAR)。以 DMSO 作空白對照，阿司匹林作陽性對照，計算目標(biāo)化合物的血小板聚集抑制率(AIR)，結(jié)果見表1。

表1 4a～4e對血小板聚集的抑制活性

以阿司匹林為陽性對照藥，對合成的目標(biāo)化合物的進(jìn)行了體外抗血小板聚集活性測試(表1)。由表1可知，目標(biāo)化合物均具有較強(qiáng)的抗血小板聚集活性。其中化合物4c,4e對ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集抑制作用顯著，AIR值分別為 20.76%和21.50%，明顯優(yōu)于陽性對照阿司匹林(AIR值為11.14%)。初步的構(gòu)效關(guān)系分析顯示，在丹皮酚的2-位酚羥基上引入芐基，對其羰基肟化后與胺基醇成醚，所得到的肟醚類化合物具有較好的抗血小板聚集活性，且引入不同的有機(jī)胺對活性存在一定的影響：當(dāng)有機(jī)胺為二乙胺和嗎啉時，目標(biāo)化合物的抗血小板聚集活性顯著提高，約為陽性對照藥阿司匹林的兩倍；當(dāng)有機(jī)胺為乙基哌嗪，哌啶，甲基哌嗪時，活性有所下降，其抗血小板聚集活性略強(qiáng)于阿司匹林。

以丹皮酚為先導(dǎo)化合物，通過酚羥基芐基化，酮基肟化后胺基醇醚化，合成了5個芐基丹皮酚肟類衍生物(4a～4e)。體外抗血小板聚集活性結(jié)果表明，4a～4e的活性均強(qiáng)于陽性對照藥阿司匹林，其中化合物4c和4e的抗血小板聚集活性(AIR)是陽性對照藥阿司匹林的兩倍，AIR值達(dá)到20.76%和21.50%，具有進(jìn)一步研究的價值。