張 宇, 劉進(jìn)兵

(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽 422000)

酪氨酸酶是含銅離子的多酚氧化酶，廣泛存在于微生物和動植物中，在酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴醌的過程中起催化作用。因此，酪氨酸酶對黑色素的合成有重要作用[1-2]。酪氨酸酶是導(dǎo)致果蔬發(fā)生酶促褐變的關(guān)鍵酶。果蔬褐變會對蔬果的外觀、品質(zhì)及營養(yǎng)價(jià)值產(chǎn)生不利影響。酪氨酸酶也是人體中黑色素合成的關(guān)鍵限速酶。黑色素可以防紫外輻射，但酪氨酸酶過量表達(dá)會引起黃褐斑、雀斑等。此外，昆蟲的生長發(fā)育、傷口愈合以及角質(zhì)層的形成與酪氨酸酶也有重要聯(lián)系[3-8]。近年來，關(guān)于酪氨酸酶抑制劑的報(bào)道較多[9]，但具有應(yīng)用價(jià)值的抑制劑較少，高效低毒的酪氨酸酶抑制劑具有廣闊的市場前景。

噻唑是一類重要的含氮硫五元雜環(huán)化合物，包含噻唑環(huán)結(jié)構(gòu)的雜環(huán)化合物為藥物分子設(shè)計(jì)的重要先導(dǎo)化合物之一[10]。噻唑衍生物具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、消炎、抑制酪氨酸酶等多種生物活性[11-13]。

為了開發(fā)新型高效低毒酪氨酸酶抑制劑，本文在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，以噻唑烷二酮和取代芳香醛為原料，通過縮合反應(yīng)合成了一系列新型噻唑烷二酮衍生物(1～11, Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR、 IR、 MS(ESI)和元素分析表征?？疾炝?～11對酪氨酸酶的抑制活性，并選擇化合物8進(jìn)行了抑制動力學(xué)和分子對接研究。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SGW-X4型熔點(diǎn)儀；UV-2600型紫外分光光譜儀；Bruker 300/400 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；Nicolet-iS5型紅外光譜儀；LCMS- 2010A型質(zhì)譜儀；Euro EA型元素分析儀。

酪氨酸酶、L-多巴、曲酸、1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基(DPPH)、 2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)， Sigma-Aldrich；其余所用試劑均為分析純。

1.2 1～11的合成通法

稱取噻唑烷-2,4-酮6 mmol，加入50 mL反應(yīng)瓶中，加入20 mL乙醇、5 mL三乙胺(或哌啶)，攪拌下加入5 mmol取代芳香醛，于80 ℃回流反應(yīng)至終點(diǎn)(薄層色譜跟蹤，展開劑：石油醚/乙酸乙酯=2/1,V/V)。冷卻至室溫，加入10 mL水，析出沉淀，抽濾，濾餅用蒸餾水洗滌3次，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析純化得目標(biāo)產(chǎn)物。

5-苯亞甲基-2,4-噻唑烷二酮(1)： 黃色固體，收率59.51%， m.p.218.6～219.3 ℃；1H NMRδ: 12.65(s, 1H, -NH), 7.80(s, 1H, =CH), 7.60(d,J=8.0 Hz, 2H, Ph-H), 7.56～7.45(m, 3H, Ph-H);13C NMRδ: 168.3, 167.7, 133.4, 132.2, 130.8, 130.4, 129.7, 123.9; IRν: 3032, 1736, 1685, 1349, 826, 760, 650 cm-1; MS(ESI)m/z: 206{[M+H]+}; Anal. Calcd for C10H7NO2S: C 58.52, H 3.44, N 6.82, found C 58.54, H 3.41, N 6.85。

5-(3-氯苯亞甲基)-2,4-噻唑烷二酮(2)： 黃色固體，收率27.17%， m.p.223.5～225.7 ℃;1H NMRδ: 7.77(s, 1H, =CH), 7.68(s, 1H, Ph-H), 7.56～7.53(m, 3H, Ph-H);13C NMRδ: 167.8, 167.6, 135.3, 133.9, 131.1, 129.9, 129.8, 129.7, 127.7, 125.8; IRν: 1671, 1313, 1281, 1158, 781, 684, 681 cm-1; MS(ESI)m/z: 240{[M+H]+}; Anal. Calcd for C10H6NO2SCl: C 50.11, H 2.52, N 5.84, found C 50.12, H 2.55, N 5.81。

5-(2,4-二氯苯亞甲基)-2,4-噻唑烷二酮(3)： 黃色固體，收率26.5%， m.p.241.7～243.2 ℃;1H NMRδ: 12.82(s, 1H, -NH), 7.85(s, 1H, =CH), 7.63～7.55(m, 3H, Ph-H);13C NMRδ: 167.8, 167.6, 135.3, 133.9, 131.1, 129.9, 129.8, 129.7, 127.7, 125.8; IRν: 1698, 1463, 1338, 1146, 806, 715, 618 cm-1; MS(ESI)m/z: 275{[M+H]+}; Anal. Calcd for C10H5NO2SCl2: C 43.81, H 1.84, N 5.11, found C 43.85, H 1.82, N 5.13。

5-(3,4-二氯苯亞甲基)-2,4-噻唑烷二酮(4)： 黃色固體，收率23.40%， m.p.>280 ℃;1H NMRδ: 7.84(s, 1H, =CH), 7.63(d,J=8.7Hz, 1H, Ph-H), 7.60(s, 1H, Ph-H), 7.58(d,J=8.7Hz, 1H, Ph-H);13C NMRδ: 167.6, 167.3, 135.33, 135.31, 130.1, 129.9, 129.8, 128.3, 128.2, 125.2; IRν: 1697, 1557, 1321, 1108, 866, 786, 688 cm-1; MS(ESI)m/z: 275{[M+H]+}; Anal. Calcd for C10H5NO2SCl2: C 43.81, H 1.84, N 5.11, found C 43.83, H 1.81, N 5.11。

5-(3-羥基苯亞甲基)-2,4-噻唑烷二酮(5)： 黃色固體，收率33.09%， m.p.267.6～269.7 ℃;1H NMRδ: 12.61(s, 1H, -NH), 9.85(s, 1H, OH), 7.70(s, 1H, =CH), 7.36(t,J=8.1 Hz, 1H, Ph-H), 7.05(d,J=8.1 Hz, 1H, Ph-H), 6.99(s, 1H, Ph-H), 7.91(d,J=8.1 Hz, 1H, Ph-H);13C NMRδ: 167.9, 167.3, 157.8, 134.1, 132.0, 130.3, 123.2, 121.3, 117.7, 115.9; IRν: 1698, 1450, 1305, 1167, 857, 793, 635 cm-1; MS(ESI)m/z: 220{[M-H]-}; Anal. Calcd for C10H7NO3S: C 54.29, H 3.19, N 6.33, found C 54.27, H 3.16, N 6.36。

5-(4-羥基苯亞甲基)-2,4-噻唑烷二酮(6)： 黃色固體，收率39.91%，m.p.299.1～299.7 ℃;1H NMRδ: 12.47(s, 1H, -NH), 10.33(s, 1H, OH), 7.71(s, 1H, =CH), 7.47(d,J=8.7 Hz, 2H, Ph-H), 6.94(d,J=8.7 Hz, 2H, Ph-H);13C NMRδ: 168.0, 167.5, 159.9, 132.4, 132.3, 123.9, 118.9, 116.3. IRν: 3400, 1672, 1570, 1508, 1338, 1154, 823, 739, 695 cm-1; MS(ESI)m/z: 220{[M-H]-}; Anal. Calcd for C10H7NO3S: C 54.29, H 3.19, N 6.33, found C 54.30, H 3.19, N 6.31。

5-(3,4-二羥基苯亞甲基)-2,4-噻唑烷二酮(7)： 黃色固體，收率41.32%，m.p.>280 ℃;1H NMRδ: 12.34(s, 1H, -NH), 10.46(s, 1H, OH), 10.19(s, 1H, OH), 7.99(s, 1H, =CH), 7.19(d,J=8.1Hz, 1H, Ph-H), 6.43(d,J=8.1Hz, 1H, Ph-H), 6.39(s, 1H, Ph-H);13C NMRδ: 168.3, 167.7, 161.6, 159.4, 129.9, 127.4, 116.8, 111.6, 108.3, 102.5; IRν: 1674, 1533, 1347, 1150, 848, 755, 690 cm-1; MS(ESI)m/z: 236{[M-H]-}; Anal. Calcd for C10H7NO4S: C 50.63, H 2.97, N 5.90, found C 50.65, H 2.94, N 5.92。

5-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)-2,4-噻唑烷二酮(8)： 黃色固體，收率26.70%， m.p.>280 ℃;1H NMRδ: 7.37(s, 1H, =CH), 7.13(s, 1H, Ph-H), 7.02(d,J=8.4Hz, 1H, Ph-H), 6.88(d,J=8.4Hz, 1H, Ph-H), 3.81(s, 3H, -OCH3);13C NMRδ: 179.1, 174.0, 147.7, 128.9, 126.4, 125.6, 123.0, 118.7, 115.8, 113.1, 55.5; IRν: 1674, 1577, 1287, 1137, 831, 789, 675 cm-1; MS(ESI):m/z(100%) 250{[M-H]-}; Anal. Calcd for C11H9NO4S: C 52.58, H 3.61, N 5.57, found C 52.57, H 3.65, N 5.55。

5-(3-羥基-4-甲氧基苯亞甲基)-2,4-噻唑烷二酮(9)： 黃色固體，收率22.47%， m.p.201.5～203.2 ℃;1H NMRδ: 12.47(s, 1H, -NH), 9.96(s, 1H, OH), 7.72(s, 1H, =CH), 7.17(d,J=8.0 Hz, 1H, Ph-H), 7.07(m, 1H, Ph-H), 6.94(d,J=8.1 Hz, 1H, Ph-H), 6.92(d,J=8.1 Hz, 1H, Ph-H), 3.83(s, 3 H,-OCH3);13C NMRδ: 168.5, 167.9, 149.9, 148.4, 133.1, 124.8, 124.6, 119.6, 116.6, 114.5; IRν: 3338, 3041, 1733, 1674, 1592, 1272, 788, 766, 690 cm-1; MS(ESI)m/z: 250{[M-H]-}; Anal. Calcd for C11H9NO4S: C 52.58, H 3.61, N 5.57, found C 52.57, H 3.63, N 5.55。

5-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯亞甲基)-2,4-噻唑烷二酮(10)： 黃色固體，收率60.93%， m.p.224.3～226.8 ℃;1H NMRδ: 12.53(s, 1H, NH), 9.36(s, 1H, OH), 7.71(s, 1H, =CH), 6.89(s, 2H, Ph-H), 3.82(s, 6H, OCH3);13C NMRδ: 168.4, 167.8, 148.6, 139.0, 133.3, 123.7, 120.2, 108.4; IRν: 3595, 3512, 2991, 1719, 1676, 1117, 824, 719, 674 cm-1; MS(ESI)m/z: 280{[M-H]-}; Anal. Calcd for C12H11NO5S: C 51.24, H 3.94, N 4.98, found C 51.26, H 3.93, N 4.97。

5-(3,4,5-三甲氧基苯亞甲基)-2,4-噻唑烷二酮(11)： 黃色固體，收率26.57%， m.p.173.7～174.5 ℃;1H NMRδ: 12.60(s, 1H, -NH), 7.74(s, 1H, =CH), 6.91(s, 2H, Ph-H), 3.83(s, 6H, OCH3), 3.32(s, 3H, OCH3);13C NMRδ: 168.3, 167.8, 153.6, 139.8, 132.5, 129.0, 122.9, 107.9; IRν: 3171, 1741, 1607, 1311, 998, 790, 621 cm-1; MS(ESI)m/z: 296{[M+H]+}; Anal. Calcd for C13H13NO5S: C 52.87, H 4.44, N 4.74, found C 52.90, H 4.47, N 4.76。

1.3 抑制酪氨酸酶活性、抑制動力學(xué)和分子對接

按文獻(xiàn)[14-15]方法測試化合物的酪氨酸酶抑制活性和抑制動力學(xué)；按文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)行分子對接研究。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑制酪氨酸酶活性

以L-多巴為底物，曲酸為陽性對照，對合成的11個(gè)化合物進(jìn)行了抑制酪氨酸酶活性研究，結(jié)果見表1。

表1 化合物1～11對酪氨酸酶的抑制作用

由表1可知，所有噻唑烷二酮衍生物具有一定的抑制酪氨酸酶活性，IC50值為0.12±0.03 μM～30.11±0.27 μM，部分化合物的抑制活性優(yōu)于陽性對照曲酸?；衔?抑制活性最好，IC50值為0.12±0.03 μM。取代基是影響抑制活性的重要因素，化合物2比化合物1的抑制活性好，因此氯原子取代氫原子可能是提高活性的有利因素。然而，對比化合物3、4和化合物2的活性可以發(fā)現(xiàn)，氯原子數(shù)目的增加，活性反而下降，這說明抑制活性與氯原子的位置及數(shù)目有關(guān)。具有4-羥基結(jié)構(gòu)的化合物(6)具有一定的抑制酪氨酸酶活性，其抑制活性強(qiáng)于有3-羥基結(jié)構(gòu)的化合物(5)。因此，羥基在苯環(huán)上的位置也是影響抑制活性因素之一，羥基在對位可能更有利于與酪氨酸酶活性中心或氨基酸殘基相互作用。具有3,4-二羥基結(jié)構(gòu)化合物(7)抑制酪氨酸酶活性不如化合物(6)，這進(jìn)一步說明了取代基位置和數(shù)目對抑制活性有重要影響。具有4-羥基苯基結(jié)構(gòu)的化合物(8)抑制活性強(qiáng)于具有3-羥基苯基結(jié)構(gòu)的化合物(9)，同樣說明了羥基在4-羥基對提高抑制活性更有利。

2.2 抑制動力學(xué)

在所合成的化合物中，化合物8抑制酪氨酸酶的活性強(qiáng)于其他化合物，為了進(jìn)一步探討抑制機(jī)理和抑制類型，優(yōu)選該化合物進(jìn)行抑制動力學(xué)研究。通過不同濃度抑制劑作用下的酶促反應(yīng)速率vs底物濃度的雙倒數(shù)曲線來確定抑制類型。如圖1所示，得到了一組具有不同斜率的直線，斜率隨著抑制劑的濃度降低而下降，所有直線交于Y軸上，這就表明化合物8為競爭性抑制劑，其抑制常數(shù)Ki為0.54 μM。

1/[S](mM)-1A

2.3 分子對接

通過計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算抑制劑與酪氨酸酶的親和力，結(jié)合能越小說明配體與目標(biāo)蛋白形成的配合物越穩(wěn)定?；衔?的結(jié)合能為-6.22 kcal/mol，小于陽性對照曲酸的結(jié)合能(-5.7 kcal/mol)。因此，化合物8能夠與酪氨酸酶形成更穩(wěn)定的配合物。如圖2所示，化合物8的苯環(huán)上4-羥基可以和酪氨酸酶的銅離子活性中心相互作用，說明4-羥基可能是其活性中心?；衔?的甲氧基可與Asn260形成氫鍵，噻唑環(huán)可分別與Val283和Ser282形成氫鍵。

圖2 化合物8的分子對接圖

合成了11個(gè)噻唑烷二酮衍生物，考察了其對酪氨酸酶的抑制活性。結(jié)果表明，所有化合物均有一定的抑制酪氨酸酶活性，其中化合物8抑制活性最好，其IC50值為0.12±0.03 μM。抑制動力學(xué)研究表明化合物8為競爭性抑制劑，其抑制常數(shù)Ki為0.54 μM。分子對接結(jié)果顯示化合物8的酚羥基可以與酪氨酸酶銅離子活性中心相關(guān)作用，甲氧基能夠與Asn260形成氫鍵，噻唑環(huán)能夠與Ser282、 Val283形成氫鍵。初步構(gòu)效關(guān)系分析表明：苯環(huán)上氯原子位置和數(shù)目能夠調(diào)節(jié)抑制酪氨酸酶活性；苯環(huán)上羥基位置對抑制活性有影響，4-羥基更有利于提高抑制活性。化合物8可以作為設(shè)計(jì)新型酪氨酸酶抑制劑的先導(dǎo)化合物。