張肖瑕，劉欣妍，許 艷，賈 喆，宋 茹

（浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022）

維生素D是重要的脂溶性維生素之一，它分為維生素D2（麥角鈣化醇）和維生素D3（膽鈣化醇），維生素D2主要來源于植物、真菌、某些無脊椎動(dòng)物［1］，維生素D3主要來源于動(dòng)物，如水產(chǎn)動(dòng)物體、魚類、動(dòng)物肝臟、蛋類等［2］。維生素D可調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)鈣磷的代謝，提高人體免疫功能的作用［3］，缺乏維生素D導(dǎo)致兒童產(chǎn)生佝僂病，成人引起軟骨病及其他癥狀［4，5］。維生素D3（Vitamin D3），分子式C27H44O，由于維生素D3與陽光有直接關(guān)系，所以又稱為“陽光維生素”［6］。David等［7］報(bào)道澳洲肺魚維生素D3含量達(dá)到10.7μg/100 g，大西洋鮭魚維生素D3含量5.8 μg/100 g。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于貝類中維生素D3的分布及含量鮮見報(bào)道。本研究以白蛤、花蛤和青蛤3種不同貝類（圖1）為研究對(duì)象，分別提取蛤肉和內(nèi)臟維生素D3，對(duì)3種貝類維生素D3的分布及含量進(jìn)行比較研究，旨在為后續(xù)貝類維生素D3的活性研究及綜合利用奠定基礎(chǔ)。

圖1 3種貝類

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 新鮮活白蛤、花蛤、青蛤于2019年12月購自舟山市定海區(qū)華潤(rùn)萬家超市，凍藏備用；考馬斯亮藍(lán)G-250、分析級(jí)石油醚（30～60℃沸程）、甲醇均購于國(guó)藥集團(tuán)；色譜級(jí)無水甲醇購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 主要試驗(yàn)設(shè)備 TM-767攪拌機(jī)，中山市海盤電器有限公司；Thermo He高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世科技有限公司；SHA-B型雙功能水浴恒溫振蕩器，金壇市岸頭良友實(shí)驗(yàn)儀器廠；Vortex QL-861漩渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器有限公司；EYELA MGS-2200氮吹儀，上海五久自動(dòng)化設(shè)備有限公司；SM800酶標(biāo)儀，上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司；Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀，德國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 維生素D3的提取 冷凍貝類用流動(dòng)水解凍，手動(dòng)分別剝?nèi)「蛉夂蛢?nèi)臟，絞碎，蛤肉和內(nèi)臟樣品取適量，分置于50 mL離心管中，按照1∶2（m∶V）比例加入（30～60℃沸程）石油醚，根據(jù)樣液體積加入抗壞血酸（終濃度為0.012 5%），37℃水浴振蕩（200 r/min），避光提取3 h，然后7 500 r/min離心15 min（4℃），取石油醚萃取層，氮?dú)獯蹈?，加入無水甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩至充分溶解，然后定容至2 mL，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，濾液備用。

1.2.2 總維生素D3含量的測(cè)定 參照Sazali等［8］高效液相色譜法測(cè)定維生素D3含量，具體條件如下。色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm），柱溫40℃，進(jìn)樣量10μL，流動(dòng)相為100%甲醇，流速0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)264 nm。在相同條件下，測(cè)定不同濃度維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品（0.1、0.5、1、2、6、10μg/mL）洗脫情況，以維生素D3濃度為橫坐標(biāo)（μg/mL），峰面積為縱坐標(biāo)，繪制維生素D3標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品峰面積帶入維生素D3標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中維生素D3濃度（μg/mL），根據(jù)式（1）計(jì)算樣品中維生素D3含量。

式中，c為提取液中維生素D3濃度，μg/mL；v為提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 蛋白質(zhì)定性及含量測(cè)定 考馬斯亮藍(lán)G-250染色液呈藍(lán)綠色，與蛋白質(zhì)分子中的酰胺基通過分子間范德華鍵結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色［9，10］，常用于蛋白質(zhì)的定性及定量分析。樣品液與考馬斯亮藍(lán)G-250試劑按照1∶5比例混合，充分反應(yīng)15 min，測(cè)定595 nm處吸光度。不同濃度牛血清白蛋白（0～400 μg/mL）與考馬斯亮藍(lán)試劑反應(yīng)后，測(cè)定595 nm處吸光度，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度為縱坐標(biāo)（y），繪制出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.001 5x+0.040 3，R2=0.920 7，用于樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示，采用Origin 2019軟件繪制圖形，用SPSS 19.0軟件對(duì)組間差異性進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素D3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

圖2結(jié)果表明，在0～10μg/mL維生素D3濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=28.557x+4.339 2，R2=0.998 9，可用于本試驗(yàn)提取液中維生素D3濃度測(cè)定。

圖2 維生素D3標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 貝類不同部位維生素D 3分布及含量比較

2.2.1 不同蛤肉中維生素D3分布比較 白蛤、花蛤、青蛤的蛤肉中維生素D3分布情況見圖3。維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品在洗脫時(shí)間19 min出現(xiàn)特征吸收峰，根據(jù)洗脫時(shí)間來定性。由圖3可知，白蛤肉在18.5 min有特征吸收峰，花蛤肉和青蛤肉均在18.6 min處有特征吸收峰出現(xiàn)（箭頭所示），但同時(shí)也能看出，蛤肉除了在18.5～18.6 min處有特征吸收外，在其他時(shí)間段也出現(xiàn)264 nm特征吸收峰，推測(cè)可能與提取液中含有蛋白質(zhì)、肽、維生素D3衍生物及其他復(fù)合產(chǎn)物有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。由圖3還可以看出，3種貝類的蛤肉在17～25 min出峰時(shí)間比較類似，表明3種貝類除了含有維生素D3外，還可能含有其他類似物。

2.2.2 不同蛤內(nèi)臟中維生素D3分布比較 白蛤、花蛤、青蛤的蛤內(nèi)臟中維生素D3分布比較見圖4。由圖4可以看出，白蛤內(nèi)臟、花蛤內(nèi)臟、青蛤內(nèi)臟均在18.7 min出現(xiàn)特征吸收（箭頭所示），說明含有維生素D3。與蛤肉的色譜圖相似，3種貝類內(nèi)臟提取液同樣在其他時(shí)間段也出現(xiàn)類似吸收峰，說明這3種貝類內(nèi)臟提取液中含有大量類似物。

2.2.3 3種貝類提取液中蛋白質(zhì)定性和定量分析維生素D3在264 nm處有特征吸收［8］，蛋白質(zhì)中肽鍵、酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸在220～280 nm也有吸收［11］。對(duì)3種貝類肉和內(nèi)臟提取液中蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知，3種貝類肉和內(nèi)臟提取液中均含有蛋白質(zhì)，即考馬斯亮藍(lán)溶液被染色呈藍(lán)色，說明圖3和圖4分離的色譜峰中含有蛋白質(zhì)類物質(zhì)存在。進(jìn)一步對(duì)3種貝類肉和內(nèi)臟提取液的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量分析，花蛤肉提取液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到519.20μg/mL，顯著高于白蛤肉和青蛤肉中蛋白質(zhì)濃度（P＜0.05）。而3種貝類內(nèi)臟提取液中，花蛤內(nèi)臟蛋白質(zhì)濃度顯著高于白蛤和花蛤內(nèi)臟提取液的蛋白質(zhì)濃度（P＜0.05）。由此可見，3種貝類肉和內(nèi)臟提取液中蛋白質(zhì)濃度不同。推測(cè)該部分蛋白質(zhì)可能具有較強(qiáng)的疏水性或與脂類結(jié)合在一起，結(jié)果被石油醚萃取出來。因此，這3種貝類肉和內(nèi)臟提取液的維生素D3純化后續(xù)需要經(jīng)過脫蛋白處理。

圖4 不同蛤內(nèi)臟中維生素D3分布比較

圖5 3種貝類提取液的蛋白質(zhì)定性及定量分析

2.2.4 不同蛤肉和內(nèi)臟維生素D3含量比較 進(jìn)一步比較了3種貝類的蛤肉和內(nèi)臟維生素D3含量及維生素D3總量，結(jié)果見圖6。由圖6（a）可以看出，白蛤肉中維生素D3含量顯著低于花蛤肉維生素D3含量（P＜0.05），花蛤肉維生素D3含量高達(dá)到10.90±0.74 μg/g。而在內(nèi)臟中，花蛤內(nèi)臟的維生素D3含量顯著高于白蛤和青蛤內(nèi)臟中維生素D3含量，其中青蛤內(nèi)臟維生素D3含量最低為2.10±0.24μg/g。此外，圖6（a）結(jié)果顯示白蛤肉和內(nèi)臟的維生素D3含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異，而花蛤和青蛤肉中維生素D3含量均顯著高于其內(nèi)臟維生素D3含量。

比較圖6（b）維生素D3總量可知，花蛤的維生素D3總量最高，達(dá)到19.30±0.72μg/g，比青蛤維生素D3總量高出3倍。Bourre等［12］報(bào)道，貝類牡蠣中維生素D3含量達(dá)8.0 mg/100 g，William等［13］報(bào)道，海鱸魚中維生素D3含量為0.73 mg/100 g。本研究中白蛤、花蛤和青蛤的維生素D3總量與文獻(xiàn)報(bào)道的水產(chǎn)品維生素D3含量范圍具有一致性。

圖6 3種貝類維生素D3含量比較

3 結(jié)論

3種貝類肉和內(nèi)臟中均含有維生素D3，但是含量差異較大，其中花蛤內(nèi)臟及肉中維生素D3含量最高，青蛤維生素D3總量最低。高效液相色譜法及蛋白質(zhì)定性和定量分析表明，3種貝類提取液中除了含有維生素D3外，還有蛋白質(zhì)等其他干擾物質(zhì)，因此從貝類提取維生素D3需要進(jìn)一步純化處理，其他洗脫峰的特性也需要深入研究，為后續(xù)維生素D3的活性及應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。