張肖瑕,劉欣妍,許 艷,賈 喆,宋 茹
(浙江海洋大學食品與藥學學院,浙江 舟山 316022)
維生素D是重要的脂溶性維生素之一,它分為維生素D2(麥角鈣化醇)和維生素D3(膽鈣化醇),維生素D2主要來源于植物、真菌、某些無脊椎動物[1],維生素D3主要來源于動物,如水產(chǎn)動物體、魚類、動物肝臟、蛋類等[2]。維生素D可調(diào)節(jié)機體對鈣磷的代謝,提高人體免疫功能的作用[3],缺乏維生素D導致兒童產(chǎn)生佝僂病,成人引起軟骨病及其他癥狀[4,5]。維生素D3(Vitamin D3),分子式C27H44O,由于維生素D3與陽光有直接關系,所以又稱為“陽光維生素”[6]。David等[7]報道澳洲肺魚維生素D3含量達到10.7μg/100 g,大西洋鮭魚維生素D3含量5.8 μg/100 g。目前國內(nèi)對于貝類中維生素D3的分布及含量鮮見報道。本研究以白蛤、花蛤和青蛤3種不同貝類(圖1)為研究對象,分別提取蛤肉和內(nèi)臟維生素D3,對3種貝類維生素D3的分布及含量進行比較研究,旨在為后續(xù)貝類維生素D3的活性研究及綜合利用奠定基礎。
圖1 3種貝類
1.1.1 材料與試劑 新鮮活白蛤、花蛤、青蛤于2019年12月購自舟山市定海區(qū)華潤萬家超市,凍藏備用;考馬斯亮藍G-250、分析級石油醚(30~60℃沸程)、甲醇均購于國藥集團;色譜級無水甲醇購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;維生素D3標準品(純度98%)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.1.2 主要試驗設備 TM-767攪拌機,中山市海盤電器有限公司;Thermo He高速冷凍離心機,賽默飛世科技有限公司;SHA-B型雙功能水浴恒溫振蕩器,金壇市岸頭良友實驗儀器廠;Vortex QL-861漩渦振蕩器,海門市其林貝爾儀器有限公司;EYELA MGS-2200氮吹儀,上海五久自動化設備有限公司;SM800酶標儀,上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司;Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀,德國安捷倫科技有限公司。
1.2.1 維生素D3的提取 冷凍貝類用流動水解凍,手動分別剝?nèi)「蛉夂蛢?nèi)臟,絞碎,蛤肉和內(nèi)臟樣品取適量,分置于50 mL離心管中,按照1∶2(m∶V)比例加入(30~60℃沸程)石油醚,根據(jù)樣液體積加入抗壞血酸(終濃度為0.012 5%),37℃水浴振蕩(200 r/min),避光提取3 h,然后7 500 r/min離心15 min(4℃),取石油醚萃取層,氮氣吹干,加入無水甲醇復溶,渦旋振蕩至充分溶解,然后定容至2 mL,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾,濾液備用。
1.2.2 總維生素D3含量的測定 參照Sazali等[8]高效液相色譜法測定維生素D3含量,具體條件如下。色譜柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm),柱溫40℃,進樣量10μL,流動相為100%甲醇,流速0.6 mL/min,檢測波長264 nm。在相同條件下,測定不同濃度維生素D3標準品(0.1、0.5、1、2、6、10μg/mL)洗脫情況,以維生素D3濃度為橫坐標(μg/mL),峰面積為縱坐標,繪制維生素D3標準曲線。樣品峰面積帶入維生素D3標準曲線,計算出樣品中維生素D3濃度(μg/mL),根據(jù)式(1)計算樣品中維生素D3含量。
式中,c為提取液中維生素D3濃度,μg/mL;v為提取液體積,mL;m為樣品質量,g。
1.2.3 蛋白質定性及含量測定 考馬斯亮藍G-250染色液呈藍綠色,與蛋白質分子中的酰胺基通過分子間范德華鍵結合,使溶液變?yōu)樗{色[9,10],常用于蛋白質的定性及定量分析。樣品液與考馬斯亮藍G-250試劑按照1∶5比例混合,充分反應15 min,測定595 nm處吸光度。不同濃度牛血清白蛋白(0~400 μg/mL)與考馬斯亮藍試劑反應后,測定595 nm處吸光度,以蛋白質濃度為橫坐標(x),吸光度為縱坐標(y),繪制出蛋白質標準曲線y=0.001 5x+0.040 3,R2=0.920 7,用于樣品提取液中蛋白質濃度測定。
試驗結果用平均值±標準差(n=3)表示,采用Origin 2019軟件繪制圖形,用SPSS 19.0軟件對組間差異性進行比較。
圖2結果表明,在0~10μg/mL維生素D3濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系,回歸方程為y=28.557x+4.339 2,R2=0.998 9,可用于本試驗提取液中維生素D3濃度測定。
圖2 維生素D3標準曲線
2.2.1 不同蛤肉中維生素D3分布比較 白蛤、花蛤、青蛤的蛤肉中維生素D3分布情況見圖3。維生素D3標準品在洗脫時間19 min出現(xiàn)特征吸收峰,根據(jù)洗脫時間來定性。由圖3可知,白蛤肉在18.5 min有特征吸收峰,花蛤肉和青蛤肉均在18.6 min處有特征吸收峰出現(xiàn)(箭頭所示),但同時也能看出,蛤肉除了在18.5~18.6 min處有特征吸收外,在其他時間段也出現(xiàn)264 nm特征吸收峰,推測可能與提取液中含有蛋白質、肽、維生素D3衍生物及其他復合產(chǎn)物有關,有待于進一步研究。由圖3還可以看出,3種貝類的蛤肉在17~25 min出峰時間比較類似,表明3種貝類除了含有維生素D3外,還可能含有其他類似物。
2.2.2 不同蛤內(nèi)臟中維生素D3分布比較 白蛤、花蛤、青蛤的蛤內(nèi)臟中維生素D3分布比較見圖4。由圖4可以看出,白蛤內(nèi)臟、花蛤內(nèi)臟、青蛤內(nèi)臟均在18.7 min出現(xiàn)特征吸收(箭頭所示),說明含有維生素D3。與蛤肉的色譜圖相似,3種貝類內(nèi)臟提取液同樣在其他時間段也出現(xiàn)類似吸收峰,說明這3種貝類內(nèi)臟提取液中含有大量類似物。
2.2.3 3種貝類提取液中蛋白質定性和定量分析維生素D3在264 nm處有特征吸收[8],蛋白質中肽鍵、酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸在220~280 nm也有吸收[11]。對3種貝類肉和內(nèi)臟提取液中蛋白質進行定性和定量分析,結果見圖5。由圖5可知,3種貝類肉和內(nèi)臟提取液中均含有蛋白質,即考馬斯亮藍溶液被染色呈藍色,說明圖3和圖4分離的色譜峰中含有蛋白質類物質存在。進一步對3種貝類肉和內(nèi)臟提取液的蛋白質濃度進行定量分析,花蛤肉提取液中蛋白質濃度達到519.20μg/mL,顯著高于白蛤肉和青蛤肉中蛋白質濃度(P<0.05)。而3種貝類內(nèi)臟提取液中,花蛤內(nèi)臟蛋白質濃度顯著高于白蛤和花蛤內(nèi)臟提取液的蛋白質濃度(P<0.05)。由此可見,3種貝類肉和內(nèi)臟提取液中蛋白質濃度不同。推測該部分蛋白質可能具有較強的疏水性或與脂類結合在一起,結果被石油醚萃取出來。因此,這3種貝類肉和內(nèi)臟提取液的維生素D3純化后續(xù)需要經(jīng)過脫蛋白處理。
圖4 不同蛤內(nèi)臟中維生素D3分布比較
圖5 3種貝類提取液的蛋白質定性及定量分析
2.2.4 不同蛤肉和內(nèi)臟維生素D3含量比較 進一步比較了3種貝類的蛤肉和內(nèi)臟維生素D3含量及維生素D3總量,結果見圖6。由圖6(a)可以看出,白蛤肉中維生素D3含量顯著低于花蛤肉維生素D3含量(P<0.05),花蛤肉維生素D3含量高達到10.90±0.74 μg/g。而在內(nèi)臟中,花蛤內(nèi)臟的維生素D3含量顯著高于白蛤和青蛤內(nèi)臟中維生素D3含量,其中青蛤內(nèi)臟維生素D3含量最低為2.10±0.24μg/g。此外,圖6(a)結果顯示白蛤肉和內(nèi)臟的維生素D3含量無統(tǒng)計學上差異,而花蛤和青蛤肉中維生素D3含量均顯著高于其內(nèi)臟維生素D3含量。
比較圖6(b)維生素D3總量可知,花蛤的維生素D3總量最高,達到19.30±0.72μg/g,比青蛤維生素D3總量高出3倍。Bourre等[12]報道,貝類牡蠣中維生素D3含量達8.0 mg/100 g,William等[13]報道,海鱸魚中維生素D3含量為0.73 mg/100 g。本研究中白蛤、花蛤和青蛤的維生素D3總量與文獻報道的水產(chǎn)品維生素D3含量范圍具有一致性。
圖6 3種貝類維生素D3含量比較
3種貝類肉和內(nèi)臟中均含有維生素D3,但是含量差異較大,其中花蛤內(nèi)臟及肉中維生素D3含量最高,青蛤維生素D3總量最低。高效液相色譜法及蛋白質定性和定量分析表明,3種貝類提取液中除了含有維生素D3外,還有蛋白質等其他干擾物質,因此從貝類提取維生素D3需要進一步純化處理,其他洗脫峰的特性也需要深入研究,為后續(xù)維生素D3的活性及應用研究奠定基礎。