楊勁博，朱曉勤，胡海霞*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122）

腦卒中是全球第二大死亡原因［1］，據(jù)其發(fā)病機(jī)制可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，缺血性腦卒中占所有腦卒中病例的87%［2］。目前腦卒中發(fā)生的機(jī)制較為復(fù)雜，興奮毒性、氧化應(yīng)激和炎癥在內(nèi)的多種機(jī)制都可以引起腦損傷，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。針對(duì)腦卒中的治療，溶栓治療是缺血性腦卒中急性期最為有效的治療手段之一，靜脈溶栓組織型纖溶酶原激活劑（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）是唯一獲得美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的藥物［3］。然而，rt-PA的治療時(shí)間窗口狹窄，僅為腦卒中發(fā)生后4.5 h，僅有3%～5%的患者能夠時(shí)得到救治，顯著降低了其對(duì)缺血性腦卒中的療效［4］。其他藥物如谷氨酸受體抑制劑阿替加奈、鈣通道抑制劑尼莫地平、氧自由基清除劑及抗氧化劑依達(dá)拉奉等［5］，在臨床前實(shí)驗(yàn)中都已證實(shí)能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)細(xì)胞狀態(tài)，但在臨床使用中療效欠佳。其中主要原因在于這些藥物治療作用靶點(diǎn)較為單一，僅針對(duì)整個(gè)腦卒中病程中的單一病理過程和發(fā)病機(jī)制，而腦卒中是多種病理過程共同作用的結(jié)果。近年來，中藥復(fù)方因其具有多組分協(xié)同，可在多系統(tǒng)、多層次、多靶點(diǎn)上發(fā)揮整體治療作用，且毒副作用小、成本低，已成為治療腦卒中的研究熱點(diǎn)。栝樓桂枝湯（Gualou Guizhi decoction，GLGZD）出自東漢末年張仲景《金匱要略》，已有研究表明栝樓桂枝湯可以減輕腦缺血再灌注損傷［6-8］，課題組前期實(shí)驗(yàn)也已證明GLGZD可通過多途徑、多機(jī)制緩解神經(jīng)細(xì)胞損傷［9］，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚未深入探討。基于此，本研究以小鼠海馬HT22神經(jīng)細(xì)胞為切入點(diǎn)，從減輕神經(jīng)元凋亡角度探討栝樓桂枝湯對(duì)腦卒中神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22（上海澤葉生物科技有限公司，批號(hào)：C8339）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號(hào)：SH30022）；EBSS無糖培養(yǎng)基（美國S igma公司，批號(hào)：M5017）；PBS緩沖液（美國Hyclone公司，批號(hào)：SH30256）；胎牛血清（批號(hào)：10099141）、胰酶消化液（批號(hào)：15050057）均購自美國ThermoFisher公司；栝樓桂枝湯藥材購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂；CCK-8試劑盒（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：MA0218-50）；ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：ml003167）；細(xì)胞凋亡DAPI染色試劑盒（批號(hào)：KGA215-50）、Caspase-3熒光檢測試劑盒（批號(hào)：KGA202F）均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C05-02001）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州安泰儀器設(shè)備有限公司）；酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；CO2培養(yǎng)箱（香港力康儀器設(shè)備有限公司）；倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）；細(xì)胞低氧培養(yǎng)工作站（英國Don Whitley公司）；恒溫水浴箱（江蘇太倉醫(yī)用儀器廠）；細(xì)胞相差熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 栝樓桂枝湯水提液制備 取天花粉30 g，白芍15 g，生姜9 g，甘草6 g，桂枝9 g，大棗12枚混合，5倍量水加熱回流2次，每次1 h，過濾，濾液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，真空干燥成干浸膏，-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｊ褂们坝门囵B(yǎng)基將干浸膏稀釋成50 mg／mL液體，過濾后4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HT22細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞用完全培養(yǎng)基［含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基］于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。細(xì)胞貼壁生長至80%，用0.25%胰酶消化并傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組和處理 HT22細(xì)胞分為正常組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。正常組：HT22細(xì)胞在完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。模型組：氧糖剝奪／再灌注（OGD／R）誘導(dǎo)損傷，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，將完全培養(yǎng)基更換無糖EBSS培養(yǎng)基后，置于1%O2、5%CO2、94%N2低氧培養(yǎng)工作站培養(yǎng)90 min，此即為氧糖剝奪過程；再將無糖EBSS培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，放置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱復(fù)氧培養(yǎng)24 h，復(fù)氧復(fù)糖，此過程即為再灌注過程。HT22細(xì)胞經(jīng)OGD／R模型損傷后，細(xì)胞生長活力明顯下降，活力在50%～60%左右。正常HT22細(xì)胞輪廓清晰，貼壁牢固，立體感強(qiáng)，而OGD／R損傷后，細(xì)胞突起皺縮、變圓，貼壁狀態(tài)較差，部分細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)基中，甚至死亡。低、中、高劑量組：在OGD／R模型復(fù)氧復(fù)糖過程中分別于完全培養(yǎng)基中加入50、100、200μg／mL GLGZD藥液。

2.4 CCK-8法篩選GLGZD藥物最佳干預(yù)濃度 取上述5組HT22細(xì)胞，按照1×105個(gè)／mL密度，接種在96孔板，每孔100μL，各組細(xì)胞處理結(jié)束后，每孔加入10μL CCK-8毒性檢測液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，使用酶標(biāo)儀于波長450 nm處檢測OD值，根據(jù)公式計(jì)算各組細(xì)胞生長活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示：氧糖剝奪再灌注后，HT22細(xì)胞生長活力降至57.36%（見模型組），說明模型建立成功；而使用低、中、高不同劑量（50、100、200μg／mL）GLGZD干預(yù)，則可顯著恢復(fù)細(xì)胞的生長活力，并隨著劑量的加大，細(xì)胞活力增加，呈現(xiàn)劑量性依賴，高劑量組細(xì)胞活力達(dá)到85.43%，最佳藥物濃度為200μg／mL，見圖1。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)以高劑量組濃度200μg／mL作為藥物干預(yù)濃度。

圖1 各組細(xì)胞生長活力結(jié)果圖

2.5 DAPI染色檢測HT22細(xì)胞凋亡 DAPI（4，6-Diamidino-2-phenylindole，4，6-二氨基-2-苯基吲哚）是一種DNA染料，對(duì)細(xì)胞膜有半通透性，可以透過細(xì)胞與DNA產(chǎn)生非嵌入式結(jié)合，發(fā)出藍(lán)色熒光。HT22細(xì)胞分為正常組、模型組、GLGZD組。正常組與模型組細(xì)胞處理同“2.4”，GLGZD組在復(fù)氧復(fù)糖過程于完全培養(yǎng)基中加入200μg／mL GLGZD藥液。按照1×105個(gè)／mL密度接種于6孔板，每孔2 mL。制備1.5μg／mL DAPI工作液，各組細(xì)胞處理結(jié)束后吸棄6孔板中的培養(yǎng)基，PBS清洗，加入500μL DAPI工作液，37℃避光15 min，50μL甲醇漂洗，加入50μL Buffer A，熒光顯微鏡下以340／380 nm紫外光激發(fā)，×200、×400顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。

2.6 熒光定量法檢測Caspase-3活性 HT22細(xì)胞分組和處理同“2.4”，干預(yù)完成后裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞后加入100μL冰冷Lysis Buffer，冰上裂解30 min，其間渦旋振蕩3～4次，每次10 s，4℃，10 000 r／min離心1 min。小心吸取上清液（含裂解的蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)移至新的管中，進(jìn)行BCA蛋白定量，于波長562 nm處測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。根據(jù)Caspase-3活性檢測試劑盒說明書，用熒光酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長＝485 nm，發(fā)射波長＝535 nm），通過公式計(jì)算Caspase-3活性熒光強(qiáng)度比值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料屬正態(tài)分布的以（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，非正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 栝樓桂枝湯對(duì)HT22細(xì)胞凋亡的影響 正常細(xì)胞的核形態(tài)呈圓形，邊緣清晰，染色均勻；凋亡細(xì)胞的膜通透性增加，細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，染色體濃集，熒光著色較重，且細(xì)胞核固縮，核小體碎片增加。DAPI染色結(jié)果顯示：正常組細(xì)胞形態(tài)正常，無損傷，模型組呈現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)，GLGZD組細(xì)胞凋亡形態(tài)有所恢復(fù)，見圖2，說明GLGZD可以抑制神經(jīng)元凋亡。

圖2 3組細(xì)胞凋亡形態(tài)DAPI染色結(jié)果圖

3.2 栝樓桂枝湯對(duì)Caspase-3活性的影響 Caspase-3是凋亡的執(zhí)行因子，通過多種途徑介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［10-11］。圖3所示：模型組Caspase-3活性熒光強(qiáng)度比值明顯增強(qiáng)，GLGZD組Caspase-3活性熒光強(qiáng)度比值雖未達(dá)到正常水平，但是較模型組明顯下降，說明GLGZD可通過降低Caspase-3活性水平，抑制凋亡，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。

圖3 3組細(xì)胞Caspase-3活性檢測結(jié)果圖

4 討 論

本研究通過CCK-8實(shí)驗(yàn)證明：氧糖剝奪再灌注后，在各種損傷機(jī)制作用下，HT22神經(jīng)生長活力迅速下降，細(xì)胞受到明顯損傷；在GLGZD作用下，HT22細(xì)胞的生長活力明顯上升，其中以200μg／mL藥物濃度最佳，初步證實(shí)GLGZD對(duì)損傷HT22細(xì)胞的保護(hù)作用。而DAPI染色實(shí)驗(yàn)顯示：模型組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)，染色體濃集，細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，熒光著色較重；經(jīng)過GLGZD干預(yù)后，細(xì)胞凋亡形態(tài)雖未恢復(fù)至完全正常的細(xì)胞形態(tài)，但較模型組細(xì)胞形態(tài)有了明顯改善，細(xì)胞形態(tài)較為完整，染色質(zhì)均一。細(xì)胞凋亡［12］是指存在于大多數(shù)生物體內(nèi)由基因調(diào)控的細(xì)胞自主、有序的死亡過程，凋亡具有獨(dú)特的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征，如細(xì)胞質(zhì)膜泡狀化、胞質(zhì)濃縮、染色質(zhì)凝集、DNA片段化等，GLGZD可以通過改善細(xì)胞的凋亡形態(tài)，進(jìn)而起到神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的作用。Caspase-3是凋亡的最終執(zhí)行者［13］，在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中居于核心地位，Caspase-3正常情況下以無活性的酶原形式存在，在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)下活化為Cleaved Caspase-3，抑制Caspase-3活化可抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞遭受OGD／R損傷后，Caspase-3活性明顯升高并活化，啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。經(jīng)GLGZD干預(yù)后，Caspase-3活性雖未降至正常水平，但是較模型組有了明顯下降，故GLGZD是通過抑制細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3的活性水平，減輕凋亡，從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。綜上所述，GLGZD對(duì)卒中后神經(jīng)細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用，機(jī)制主要是抑制凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3活化，減輕凋亡損傷。

本研究主要探討GLGZD對(duì)卒中后HT22細(xì)胞生長活力和凋亡方面的影響，為其臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。但是卒中后神經(jīng)細(xì)胞損傷受到眾多機(jī)制的調(diào)控，凋亡是其中一種，GLGZD對(duì)卒中后神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用是否涉及其他機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。