何葉，楊勝輝，唐明杰，劉葉芳

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，長沙 410208

2湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院呼吸科，湖南 常德 415000

近幾十年來，肺癌的發(fā)病率和病死率均有所下降，然而，其作為腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，仍然是人類面臨的嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題。通過使用低劑量計算機斷層掃描進(jìn)行篩查，可以在高危人群中早期診斷出肺癌，這可以降低與肺癌相關(guān)的病死率。但是，陽性結(jié)果可能會產(chǎn)生與惰性腫瘤過度診斷有關(guān)的新問題，這突出了如何更加有效診斷肺癌的重要性，因此，迫切需要開發(fā)用于肺癌診斷的有效方法。一些血清腫瘤標(biāo)志物可以明顯提高肺癌的診斷率，但腫瘤診斷的特異性標(biāo)志物仍然缺乏。盡管為了發(fā)現(xiàn)早期腫瘤采用基于影像學(xué)和細(xì)胞學(xué)先進(jìn)的篩查策略，但在大多數(shù)國家肺癌患者確診時通常已是晚期，這是該疾病高病死率的決定性因素。因此，越來越多的研究都致力于找到有效的非侵入性的腫瘤生物標(biāo)志物用于肺癌診斷，特別是在早期階段。微小RNA（microRNA，miRNA）是指短的、高度保守、非編碼的RNA，以轉(zhuǎn)錄后的方式調(diào)控下游基因的表達(dá)，具有重要的生物學(xué)作用，其畸變可能對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要影響。不同腫瘤中的miRNA特征表明，miRNA-21是最豐富的RNA之一，miRNA-21對肺癌診斷有很高的價值。但是，關(guān)于miRNA-21 的研究主要來自各個研究中心，并且缺乏不同研究中心的循證醫(yī)學(xué)結(jié)果。因此，本研究在相關(guān)研究和可用研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了Meta分析，以評估m(xù)iRNA-21 在肺癌診斷中的價值，并提供可靠的科學(xué)結(jié)論來指導(dǎo)臨床實踐。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索

全面檢索萬方、CNKI、維普、PubMed、Embase數(shù)據(jù)庫，檢索時間從建庫至2020 年10 月，由兩名檢索者單獨收集。中文檢索詞為“肺癌”“微小RNA-21”，英文檢索詞為“miRNA-21”“microRNA-21”“miR-21”“l(fā)ung cancer”“cancer of lung”“l(fā)ung neoplasms”，采用兩兩不同的配對檢索，檢索文獻(xiàn)語種為中文和英文。納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究對象限制為中國人群；②進(jìn)行miRNA-21 檢測，其中肺癌患者作為病例組，肺部良性疾病患者和（或）健康者作為對照組；③研究中提供了如真陽性、假陽性等完整數(shù)據(jù)；④若有重復(fù)的數(shù)據(jù)，選擇最完整數(shù)據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①內(nèi)容不符、不相關(guān)文獻(xiàn)；②綜述、會議、非對照研究等文獻(xiàn)。

1.2 數(shù)據(jù)提取

根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選文獻(xiàn)，并根據(jù)已設(shè)計好的資料提取表分別進(jìn)行數(shù)據(jù)提取。所有數(shù)據(jù)均由兩名研究人員從研究中獨立提取，提取的信息包括：研究特征（第一作者、年份、樣本類型、探針類型、內(nèi)參類型）、樣本數(shù)量、結(jié)果數(shù)據(jù)（靈敏度、特異度）等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Meta-Disc 1.4 和Stata 16.0 軟件進(jìn)行分析，將納入研究中的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比及診斷比值比（diagnostic odds ratio，DOR）相應(yīng)的95%CI 合并起來，初步評估m(xù)iRNA-21 對肺癌的診斷價值。然后，基于原始數(shù)據(jù)繪制綜合受試者工作特征（summary receiver operating characteristic，SROC）曲線，計算SROC 曲線下面積（area under the curve，AUC）以評估m(xù)iRNA-21 對肺癌的診斷準(zhǔn)確性，并以

I

檢驗評價研究間的異質(zhì)性大小。此外，為了研究異質(zhì)性的潛在影響，進(jìn)行回歸分析、敏感性分析和亞組分析，繪制Deek’s 漏斗圖評價納入研究是否存在發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果

2.1 檢索過程

通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫共檢索文獻(xiàn)646 篇，由于重復(fù)研究，共排除75 篇，根據(jù)標(biāo)題和摘要排除519 篇。通過初步檢索，本研究共篩選出文獻(xiàn)52 篇。經(jīng)更詳細(xì)的評估后，最終納入文獻(xiàn)11 篇。

2.2 納入文獻(xiàn)的基本信息

11 篇文獻(xiàn)中，病例組1113 例，對照組1182 例，共2295 例。（表1）

表1 11 篇納入文獻(xiàn)的基本特征

2.3 納入文獻(xiàn)質(zhì)量評價

采用QUADAS-2 對納入文獻(xiàn)質(zhì)量進(jìn)行評估，在偏倚風(fēng)險方面：6 項研究（5 篇文獻(xiàn)）在病例選擇中顯示出較高偏倚，8 項研究（7 篇文獻(xiàn)）在指標(biāo)測試中顯示出較低偏倚，9 項研究（7 篇文獻(xiàn)）在參考標(biāo)準(zhǔn)中顯示出較低偏倚，7 項研究（6 篇文獻(xiàn)）在病例流程和進(jìn)展情況中顯示出較低偏倚；在適用性問題方面：7 項研究（6 篇文獻(xiàn)）在病例選擇中顯示出較低偏倚，12 項研究（10 篇文獻(xiàn)）在其指標(biāo)測試中顯示出較低偏倚，11 項研究（9 篇文獻(xiàn)）在參考標(biāo)準(zhǔn)中顯示出較低偏倚。（圖1）

圖1 11篇納入研究的質(zhì)量評價結(jié)果

2.4 異質(zhì)性檢測及miRNA-21 診斷效能評價

采用Meta-Disc 1.4 計算出本研究中Spearman相關(guān)系數(shù)的

P

值為0.294，提示不存在顯著閾值效應(yīng)，納入文獻(xiàn)間存在異質(zhì)性，可選用隨機效應(yīng)模型合并數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，合并靈敏度和特異度分別為：0.76（95%CI：0.73～0.78）和0.75（95%CI：0.72～0.77），陽性似然比和陰性似然比分別為2.85（95%CI：2.54～3.20）和0.33（95%CI：0.28～0.37），DOR 為9.16（95%CI：7.11～11.80），SROC 曲 線 的AUC 為0.82。（圖2）

圖2 miRNA-21診斷肺癌的SROC圖

2.5 Meta 回歸分析

將樣本類型、探針類型及內(nèi)參類型納入Meta回歸模型，結(jié)果顯示，不同內(nèi)參類型對肺癌診斷準(zhǔn)確性的影響比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

=0.0256），相對DOR 為0.60（95%CI：0.39～0.93）。

2.6 敏感性分析

敏感性分析結(jié)果顯示，擬合優(yōu)度（圖3A）與二元正態(tài)性（圖3B）結(jié)果顯示出隨機效應(yīng)模型分析的合理性；影響性分析（圖3C）發(fā)現(xiàn)納入文獻(xiàn)中易震南等和李世榮等的研究所占權(quán)重偏大；異常值檢測（圖3D）顯示離群的易震南等、李世榮等的研究可能是本Meta 分析的異質(zhì)性來源之一，尤其是李世榮等的研究數(shù)據(jù)不僅占有權(quán)重最大，且離群最遠(yuǎn)。對上述2 篇文獻(xiàn)數(shù)據(jù)行進(jìn)一步詳細(xì)查看后，剔除異常研究數(shù)據(jù)，重新合并發(fā)現(xiàn)靈敏度由0.76（95%CI：0.73～0.78）下降至0.74（95%CI：0.71～0.77），特異度由0.75（95%CI：0.72～0.77）下降至0.74（95%CI：0.71～0.77），陽性似然比由2.85（95%CI：2.54～3.20）下降至2.78（95%CI：2.50～3.10），陰性似然比由0.33（95%CI：0.28～0.37）上升至0.36（95%CI：0.32～0.40），DOR 由9.16（95%CI：7.11～11.80）下降至7.92（95%CI：6.51～9.64），AUC 由0.82下降至0.80?？傮w結(jié)果與剔除前無明顯差異，提示本研究Meta分析匯總結(jié)果較為可靠和穩(wěn)定。

圖3 敏感性分析

2.7 亞組分析

miRNA-21 在肺癌診斷中，組織樣本、血清樣本和SYBR 探針的診斷價值較高（DOR=10.61、9.46、9.71），而內(nèi)參為

U6

的診斷價值較低（DOR=6.74）。（表2）

表2 miRNA-21 在肺癌診斷中的亞組分析結(jié)果

2.8 發(fā)表偏倚分析

通過STATA 16.0 分析得出miRNA-21 在肺癌診斷中的文獻(xiàn)發(fā)表偏倚漏斗圖，提示本次Meta 分析所納入文獻(xiàn)間無明顯發(fā)表偏倚（

P

=0.20）。（圖4）

圖4 發(fā)表偏倚漏斗圖

3 討論

miRNA-21 屬于miRNA 家族成員之一，通過調(diào)節(jié)各種分子機制（如細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等）在腫瘤發(fā)展中起關(guān)鍵作用。不少研究已經(jīng)觀察到肺癌患者循環(huán)系統(tǒng)中miRNA-21 的失調(diào)。正常肺上皮細(xì)胞癌變后miRNA-21 表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而激活上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤，促進(jìn)細(xì)胞遷移。miRNA-21通過蛋白激酶/磷酸化蛋白激酶B/裂解半胱氨酸蛋白-3/基質(zhì)金屬蛋白酶2/基質(zhì)金屬蛋白酶9 信號通路可以抑制肺癌細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞外配體與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）結(jié)合時，會產(chǎn)生受體的同二聚體或異二聚體，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶中的位點磷酸化，并激活各種細(xì)胞內(nèi)途徑，使細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，防止細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，

EGFR

突變陽性肺腺癌與miRNA-21 表達(dá)明顯增加相關(guān)，miRNA-21 可以通過抑癌基因磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）和程序性死亡受體4（programmedcell death4，PDCD4）的表達(dá)來誘導(dǎo)表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）抗性。miRNA-21 下調(diào)細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）1、SOCS6 和PTEN 的表達(dá)，促進(jìn)肺癌的發(fā)展。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，對miRNA-21 表達(dá)的抑制會上調(diào)PDCD4 的表達(dá)，并最終降低其增殖、遷移和侵襲。

目前已有多篇文獻(xiàn)報道m(xù)iRNA-21 與肺癌相關(guān)，顏曉慧等研究探索了外泌體miRNA-21 在肺癌患者血清中的表達(dá)水平及對肺癌的診斷效能，共納入肺癌患者94 例，肺結(jié)核患者29 例，健康對照26 名，均就診于2014—2016 年，結(jié)果顯示AUC為0.702。周金林和鄧述愷研究探討了血清miRNA-210 和miRNA-21 聯(lián)合檢測對非小細(xì)胞肺癌的臨床應(yīng)用價值，患者均就診于2012—2014 年，結(jié)果顯示AUC 為0.725。Qiu 等探討了miRNA-19 和miRNA-21 在未分化肺癌患者外周血中的表達(dá)水平及診斷價值，共納入58例未分化肺癌患者作為試驗組，同時選擇42 名健康志愿者作為對照組，患者均就診于2014—2017年，結(jié)果顯示AUC為0.923。

由于目前國內(nèi)痰液及外泌體樣本的miRNA-21檢測靈敏度、特異度等數(shù)據(jù)不全，未考慮納入本次Meta分析。本次研究異常值檢測提示易震南等和李世榮等研究可能是本Meta 分析研究的異質(zhì)性來源之一，進(jìn)一步研究以上2篇文獻(xiàn)后，初步分析發(fā)現(xiàn)：易震南等研究入組樣本中部分對照組患者經(jīng)CT 確診為良性病變，存在一定的臨床檢查醫(yī)師的主觀性，易導(dǎo)致研究結(jié)果偏差。而李世榮等研究在選擇對照組患者的入組要求中存在一些主觀性判定條件，且真陰性與假陽性樣本數(shù)量差異明顯，同樣可能是導(dǎo)致研究結(jié)果存在誤差。

根據(jù)本研究，miRNA-21 對肺癌的診斷具有較高的靈敏度和特異度。但是，本Meta 分析仍然存在以下局限性：①納入文獻(xiàn)僅包括以英文和中文發(fā)表的論文，可能會排除其他語言的文獻(xiàn)，從而導(dǎo)致不可避免的誤差。②由于數(shù)據(jù)缺乏，沒有評估m(xù)iRNA-21 對肺癌不同階段（不同分期、手術(shù)前后）的診斷價值，以及miRNA 不同檢測方法的差異，因此靈敏度和特異度均會受到影響，進(jìn)一步的研究應(yīng)集中在這個問題上。③沒有統(tǒng)一的臨界水平，存在個別研究病例組與對照組樣本數(shù)量存在明顯差距。④部分研究中被評估為高風(fēng)險的患者選擇。⑤組織樣本診斷價值高于血液樣本，但組織樣本的獲取對于肺小結(jié)節(jié)患者存在困難，對血液樣本檢測相對更方便，近年來越來越多的研究也表明，miRNA-21 血液標(biāo)本檢測與肺癌相關(guān)。未來仍需要采用各種微生物組學(xué)、代謝組學(xué)等方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以更好地了解該疾病，從根本上改變診斷的方法，以優(yōu)化肺癌的診斷。

目前研究表明，miRNA-21 是一種將肺癌患者與健康者和良性肺疾病患者區(qū)分開的相對有前途和有效的生物標(biāo)志物。但是，由于本研究的局限性，有必要進(jìn)行更多大規(guī)模且設(shè)計合理的研究以證實本結(jié)論。