張召力，李淑香

廈門市第五醫(yī)院1皮膚科，2血透室，福建 廈門 361101

黑色素瘤是黑色素細(xì)胞惡變形成的，多見于皮膚，偶見于眼睛、鼻腔等部位，黑色素瘤起病初期可通過外科手術(shù)治療方式將其切除，但若干預(yù)、治療不及時，黑色素瘤細(xì)胞將會發(fā)生遷移和侵襲，依靠現(xiàn)有的醫(yī)療手段，治療效果往往難以達(dá)到預(yù)期，生存率普遍不高。因此，抑制黑色素瘤的遷移和侵襲是提高黑色素瘤患者生存率的關(guān)鍵。光動力療法屬于微創(chuàng)療法，臨床常將其應(yīng)用于非黑色素性皮膚癌的治療中，且均取得了理想的治療效果。有報道顯示，光動力療法可通過抑制核因子κB 信號通路達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的，繼而抑制細(xì)胞惡變。然而經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，有關(guān)光動力療法治療黑色素瘤的研究并不多見，且研究結(jié)論尚未統(tǒng)一。鑒于此，本研究探討了光動力療法對黑色素瘤細(xì)胞遷移、侵襲的影響及作用機(jī)制，旨在為黑色素瘤患者的治療開辟新的思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

溶媒：滅菌注射用水、生理鹽水。腫瘤細(xì)胞株：黑色素瘤細(xì)胞株B16-F10購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；羊胚素：每瓶25 mg。二甲基亞砜、胰蛋白酶、培養(yǎng)基與胎牛血清均購自美國Sigma公司，二喹啉甲酸試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；破膜液購自武漢博士德生物工程有限公司，流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；Ki-67抗體、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）抗體均購自英國Abcam 公司。研究涉及的所有材料均在有效期內(nèi)，且儀器的使用均由專業(yè)人員在嚴(yán)格質(zhì)控下完成。

1.2 黑色素瘤細(xì)胞B16-F10 的培養(yǎng)

復(fù)蘇黑色素瘤細(xì)胞B16-F10，將其置于含有10%胎牛血清與青霉素的高糖培養(yǎng)基中，在5%CO、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至融合度約為90%時進(jìn)行傳代，每3 天傳代一次，傳代時使用0.25%胰蛋白酶細(xì)胞消化液進(jìn)行處理。

1.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測黑色素瘤細(xì)胞B16-F10 的遷移能力

選取生長至對數(shù)期的黑色素瘤細(xì)胞B16-F10，經(jīng)胰蛋白酶消化處理后接種在六孔板內(nèi)，并在每個孔中加入2 ml 細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)1 天。當(dāng)細(xì)胞融合度≥80%時，孵育光敏劑，給予1 mmol/L 5-氨基酮戊酸，2 h 后給予635 nm 紅光照射治療，能量分別為0 J（A 組）、2.4 J（B 組）、4.8 J（C 組），以未進(jìn)行紅光照射的細(xì)胞作為對照組。然后采用1 ml 移液槍槍頭垂直于培養(yǎng)板劃“一”字劃痕，之后加入胎牛血清，再次放入培養(yǎng)箱，光動力療法的時間為24 h，通過顯微鏡下拍攝的照片觀察并比較細(xì)胞遷移情況。采用Image J 定量評估劃痕愈合率，劃痕愈合率=（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積）/24 h 劃痕面積×100%。對照組不給予任何干預(yù)。

1.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測黑色素瘤細(xì)胞B16-F10 的侵襲能力

將預(yù)先在Transwell 上室內(nèi)平鋪好的Matrigel膠放在37 ℃培養(yǎng)箱中聚合2 h，與遷移能力檢測方法相同，進(jìn)行孔內(nèi)培養(yǎng)、孵育、光照，制成單細(xì)胞懸液后，將其培養(yǎng)在含有1%胎牛血清的培養(yǎng)基中，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×10/ml，在Transwell 下室中加入培養(yǎng)基（含胎牛血清），并在下室中鋪入制好的細(xì)胞懸液，恒溫（37 ℃）培養(yǎng)1 天，然后采用0.5%結(jié)晶紫對上室底部的細(xì)胞染色，顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞數(shù)量。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測遷移和侵襲相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量

采用RIPA 裂解液提取各組細(xì)胞中的蛋白，并采用二喹啉甲酸試劑盒檢測蛋白濃度，各組分別選取40 μg 蛋白，采用10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，采用半干法將分離后的目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，應(yīng)用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后加入適宜濃度的一抗（Ki-67 抗體的稀釋比例為1∶100，VEGF 抗體的稀釋比例為1∶1000，MMP9 抗體的稀釋比例為1∶800），4 ℃孵育過夜，次日取出PVDF 膜，洗去膜上未結(jié)合的一抗，加入二抗37 ℃孵育1 h 后，滴加化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行曝光顯影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，計算Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 光動力療法對黑色素瘤細(xì)胞B16-F10 遷移、侵襲的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組、A 組、B 組、C 組的劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)目比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.01）。A 組、B組、C 組的劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)目均低于對照組，B 組、C 組的劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)目均低于A 組，C 組的劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)目均低于B 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.05）。（表1）

表1 不同組別黑色素瘤細(xì)胞B16-F10 劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)目的比較（±s）

2.2 光動力療法對黑色素瘤細(xì)胞B16-F10 中遷移和侵襲相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的影響

對照組、A 組、B 組、C 組黑色素瘤細(xì)胞B16-F10 中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.01）。A 組、B 組、C組中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達(dá)量均低于對照組，B 組、C 組中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達(dá)量均低于A 組，C 組中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達(dá)量均低于B 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.05）。（表2）

表2 不同組別黑色素瘤細(xì)胞B16-F10中遷移和侵襲相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

3 討論

研究顯示，絕大多數(shù)皮膚癌患者死亡的直接原因?yàn)楹谏亓觯M管黑色素瘤僅占皮膚癌的5%左右，且早期黑色素瘤患者可通過外科手術(shù)治療，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高一直是臨床尚未攻克的難題，進(jìn)展期黑色素瘤患者的預(yù)后更不理想，病死率居高不下，其根本原因在于細(xì)胞增殖與凋亡受到抑制，因此治療黑色素瘤的根本在于抑制黑色素瘤細(xì)胞的異常增殖或促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡。

光動力療法是近年來新興的腫瘤治療方法，其原理如下：使局部細(xì)胞攝取光敏劑并視情況給予光照射，在氧分子與光敏劑的協(xié)同作用下，發(fā)生氧化損傷，造成靶細(xì)胞壞死、凋亡，誘發(fā)炎癥免疫反應(yīng)。光動力療法在發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的同時，對正常的組織細(xì)胞幾乎不會造成影響，因此臨床對皮膚癌、食管癌等惡性腫瘤的治療時均會開展光動力療法。眾所周知，遷移和侵襲是腫瘤病灶重要的惡性生物學(xué)特征之一，這一過程尤為繁雜，包括原發(fā)性腫瘤血管產(chǎn)生，腫瘤細(xì)胞脫落后侵襲鄰近組織的基底膜、細(xì)胞外基質(zhì)，通過全身循環(huán)轉(zhuǎn)移至其他部位進(jìn)行生長。其中腫瘤血管生成是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，VEGF 是促血管生成因子，當(dāng)其與受體結(jié)合后，可使內(nèi)皮細(xì)胞增殖與分泌增多，大量細(xì)胞基質(zhì)被降解，加速血管腔形成的同時促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲。Ki-67 是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的抗原，Ki-67 的表達(dá)水平可直接反映細(xì)胞的增殖活性，因此臨床常將其作為黑色素瘤患者預(yù)后的評估指標(biāo)之一。研究表明，MMP9 在腫瘤遷移和侵襲的過程中至關(guān)重要，其主要的生物學(xué)作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)，當(dāng)機(jī)體內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）與金屬蛋白酶組織抑制劑之間的平衡被打破時，細(xì)胞外基質(zhì)的異常代謝產(chǎn)物將是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要促進(jìn)因子。本研究結(jié)果顯示，對照組、A 組、B 組、C 組的劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)目比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.01），其中C 組的劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)目均最低，然后由低至高依次為B 組、A 組、對照組，表明光動力療法可抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，本研究結(jié)果還顯示，對照組、A 組、B 組、C 組黑色素瘤細(xì)胞B16-F10 中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

﹤0.01），其中C 組中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達(dá)量均最低，然后由低至高依次為B 組、A 組、對照組，提示光動力療法可抑制黑色素瘤細(xì)胞中遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。鑒于此，考慮在黑色素瘤患者的臨床治療中可開展光動力療法，旨在延緩疾病進(jìn)程，最大程度地促進(jìn)患者獲得良好預(yù)后。但因此類研究較少見，且本研究結(jié)果無較多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)作為支持，故本研究結(jié)果的真實(shí)性、可靠性還需在未來開展大量前瞻性、大樣本量的研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，光動力療法可明顯抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，臨床可考慮將光動力療法作為提高黑色素瘤治療效果、促進(jìn)患者獲得良好預(yù)后的重要方法。