李禮斌，魏旻俊，李洪玉，余 平

(浙江省立同德醫(yī)院·浙江 杭州 310012)

我國幅員遼闊、自然環(huán)境復(fù)雜、條件優(yōu)越，分布著極其豐富的中藥材資源，而中藥材往往會因為地域、氣候、水質(zhì)及栽培方式等差異，藥效有所不同，對于疾病的治療效果存在差異[1-2]。野生中藥材資源的銳減促進(jìn)了中藥材人工種植業(yè)的快速發(fā)展，然而只有在道地產(chǎn)區(qū)種植的中藥材，藥用活性成分含量才較高，藥用效果好[3]。

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDielset Gilg)，又名石猴子、金絲吊葫蘆、雷膽子等，具有清熱解毒、活血止痛、祛風(fēng)化痰等功效，常用于治療高熱驚厥、肺炎、肝炎、風(fēng)濕、瘰疬、癰疔瘡癤、月經(jīng)不調(diào)等；隨著其良好抗腫瘤效果的發(fā)現(xiàn)，三葉青被廣泛地應(yīng)用于各種腫瘤的臨床治療，同時，體內(nèi)外腫瘤抑制實驗研究發(fā)現(xiàn)其對于各種腫瘤細(xì)胞或組織具有良好的抑制效果[4-5]。三葉青主要分布于我國長江以南地區(qū)，如浙江、江西、福建、廣西、湖南、湖北及云南等省份[6]。同樣，受產(chǎn)地、種質(zhì)、氣候及種植條件等因素影響，三葉青在植物學(xué)特征特性、地下塊莖產(chǎn)量以及有效活性成分含量存在顯著差異[7-8]。浙江和廣西是我國三葉青兩大主要產(chǎn)區(qū)，兩區(qū)域所產(chǎn)三葉青在市面及臨床上應(yīng)用較廣；同樣，兩產(chǎn)地三葉青因較遠(yuǎn)的物理距離導(dǎo)致其在生物學(xué)性狀及藥效方面存在較大差異[9-10]。本研究對浙江與廣西兩產(chǎn)地三葉青水提物進(jìn)行抗肺癌效果的對比分析，為三葉青質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定、道地藥材標(biāo)定及臨床合理應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 實驗藥物 浙江產(chǎn)三葉青2018 年12 月采自浙江臺州溫嶺市；廣西產(chǎn)三葉青 2018 年12 月采自廣西河池天峨縣；由浙江省中醫(yī)藥研究院中藥研究中心李洪玉研究員鑒定為葡萄科崖爬藤屬Tetrastigmahemsleyanum三葉青的塊莖。新鮮三葉青塊莖洗凈后晾干，切片后于55 ℃ 下烘干備用。水煎液制備：取上述兩產(chǎn)地三葉青切片各200 g，置于 10 倍量水(2 000 mL)浸泡30 min 后，武火煮沸后文火煎煮 1.5 h，共煎煮 2 次，合并兩次煎液，紗布過濾后，濾液在水浴鍋上濃縮至 400 mL，使成為0.5 g生藥/mL濃度，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞株及動物 人肺腺癌細(xì)胞株 A549：購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。SPF級BALB/c裸鼠，雄性，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自上海斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物合格證號為SCXK(滬)2017-0005。以裸鼠專用飼料、滅菌水，于25 ℃室溫條件下喂養(yǎng)，自由取食飲水，1 周后取用。

1.3 實驗試劑及儀器 TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白抗體：艾博抗上海貿(mào)易有限公司；PBS、DAB、蘇木精、多聚甲醛：武漢博士德生物工程有限公司。SQP 十萬分之一電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；游標(biāo)卡尺：上海永準(zhǔn)電子科技有限公司；BX63 熒光顯微鏡：日本Olympus公司；RM2235石蠟切片機(jī)：德國萊卡儀器有限公司)。

2 方法

2.1 模型制備與分組給藥 取對數(shù)生長期A549 細(xì)胞，以PBS 液調(diào)節(jié)成濃度為2×107/mL 的單細(xì)胞懸液，35只小鼠按每只0.2 mL接種于裸鼠前肢右腋下，構(gòu)建 A549小鼠腫瘤移植瘤模型。小鼠接種2 周待腫瘤生長至 60～140 mm3后，取成模的 30 只裸鼠隨機(jī)分為5 組：模型對照組、10 g/L 浙江產(chǎn)三葉青水煎液組、50 g/L浙江產(chǎn)三葉青水煎液組、10 g/L廣西產(chǎn)三葉青水煎液組、50 g/L廣西產(chǎn)三葉青水煎液組，每組6只。各組每日灌胃 1 次，對照組給予同實驗組等體積的生理鹽水，各組每隔2 d稱量體質(zhì)量1 次并進(jìn)行記錄。給藥期間密切關(guān)注小鼠體質(zhì)量、活動能力及攝食飲水等情況；連續(xù)給藥1 周。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.2.1 移植瘤體積、瘤重及抑瘤率 給藥1 周后，頸椎脫臼處死小鼠，小心剝離瘤體，稱重、測量體積并拍照，計算腫瘤平均瘤重量、平均瘤體積及抑瘤率。

抑瘤率=(對照組瘤體體積-實驗組瘤體體積)/對照組瘤體體積×100%

抑瘤率=(對照組瘤體重量-實驗組瘤體重量)/對照組瘤體重量×100%

2.2.2 TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡 將腫瘤組織用 4% 多聚甲醛固定，制成切片后，采用 TUNEL 法檢測A549 肺癌裸鼠皮下移植瘤內(nèi)細(xì)胞凋亡情況。經(jīng)顯色、復(fù)染、脫水、透明與封片后于熒光顯微鏡下觀察，以細(xì)胞核中出現(xiàn)綠色熒光顆粒者為陽性，即為凋亡的細(xì)胞。每張切片至少觀察 5 個以上高倍視野，每個視野在熒光顯微鏡下用 520 nm 波長拍照1 次，使用 Image-Pro Plus 6.0 進(jìn)行熒光分析。計數(shù)500 個以上完整癌細(xì)胞，計算每 100 個癌細(xì)胞內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)，即為凋亡指數(shù)(apoptopic index，AI)，即凋亡細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

2.2.3 免疫組化檢測瘤組織Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá) PBS 作為漂洗液，Bcl-2、Bax、Caspase3和 Caspase9 一抗工作濃度分別為1∶150、1∶150、1∶100和1∶100。一抗孵育 4 ℃ 過夜，鏡下控制染色，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染。判斷標(biāo)準(zhǔn)以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，無染色反應(yīng)者為陰性。使用 Image-Pro Plus 6.0軟件以陽性細(xì)胞所占百分率和顯色強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)，計算蛋白的陽性率。

3 結(jié)果

3.1 兩產(chǎn)地三葉青水煎液對A549 肺癌裸鼠移植瘤生長抑制效果比較 結(jié)果見表1。

表1 各組裸鼠抑瘤效果比較

3.2 兩產(chǎn)地三葉青水煎液對肺癌 A549 裸鼠移植瘤體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果見表2。

表2 各組裸鼠肺癌 A549 移植瘤體內(nèi)腫瘤 細(xì)胞凋亡的比較

3.3 兩產(chǎn)地三葉青水煎液對 A549 肺癌裸鼠移植瘤Bax、Bcl-2、Caspase-3 和 Caspase-9 蛋白表達(dá)的影響 見圖1，表3。

圖1 各組裸鼠A549 肺癌移植瘤組織Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(×200)

表3 各組裸鼠A549 肺癌移植瘤Bax、Bcl-2、Caspase-3 和 Caspase-9 蛋白表達(dá)的比較

4 討論

三葉青以其優(yōu)良的清熱解毒、消腫止痛、化痰等特性，常用于癌癥、結(jié)節(jié)、各類炎癥、肝病等疾病的治療，同時還具有增強(qiáng)人體免疫力的功效[11]。就藥效與品質(zhì)而言，很多報道以浙江所產(chǎn)三葉青為最佳，但相關(guān)報道缺少足夠的實際臨床療效對比及有效研究數(shù)據(jù)支撐。本研究通過三葉青水煎液處理A549肺癌移植瘤裸鼠的方法于體內(nèi)就浙江產(chǎn)三葉青與廣西產(chǎn)三葉青肺癌抑制效果進(jìn)行了對比研究。研究結(jié)果可見：兩產(chǎn)地三葉青水煎液對小鼠A549 肺癌移植瘤均有增長抑制作用且呈現(xiàn)劑量依賴性；但浙江產(chǎn)三葉青水煎液對肺癌腫瘤組織增長抑制效果顯著，抑制作用優(yōu)于廣西產(chǎn)三葉青水煎液。誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示：三葉青水煎液腫瘤抑制作用與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用存在密切關(guān)系，且浙江產(chǎn)三葉青水煎液誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡效果顯著，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用優(yōu)于廣西產(chǎn)三葉青水煎液。抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制與其上調(diào)促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)及下調(diào)抑制凋亡因子 Bcl-2存在密切關(guān)系；Bcl-2與Bax是 Bcl-2 家族中最具代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因，Bcl-2/Bax 比值對決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)具有重要的意義，而Caspase-3、Caspase-9是Caspase家族中引起凋亡的關(guān)鍵成分[12-13]。本研究結(jié)果顯示浙江產(chǎn)三葉青水煎液誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax上調(diào)表達(dá)及Bcl-2下調(diào)效果要顯著優(yōu)于廣西產(chǎn)三葉青水煎液，這是浙江產(chǎn)三葉青水煎液具有顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡效果的重要原因之一。

綜上所述，浙江產(chǎn)三葉青水煎液在肺癌腫瘤組織生長抑制、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效果方面要顯著優(yōu)于廣西產(chǎn)三葉青水煎液；因此，在臨床三葉青組方使用時，應(yīng)當(dāng)明確其產(chǎn)地來源而確定用藥量才能達(dá)到更好地治療效果。