劉慧敏 馬彥

(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院皮膚性病科，太原 030001)

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是自然界中普遍存在的條件致病菌，是臨床中第二類重要的真菌病原體。它以孢子的形式經(jīng)過呼吸道而進入人體，在免疫力正常的人群中可以腐生定植，但在癌癥、器官移植、艾滋病等群體中可以引起以肺為主要靶器官的侵襲性感染，占人類侵襲性感染的65%[1]。真菌細胞壁是動態(tài)的細胞器，是真菌與周圍環(huán)境接觸的第1個環(huán)節(jié)，也是抗真菌治療的獨特靶點，而細胞壁重塑也是極性生長過程中的重要程序[2]。極性生長即有方向地生長，是真菌中普遍存在的一種生長模式，過程極其復(fù)雜，涉及細胞壁的合成和塑性、孢子出芽、細胞膜延伸等，煙曲霉的生命周期開始于分生孢子的萌發(fā)，當分生孢子休眠被打破時，便開始由同向生長轉(zhuǎn)變?yōu)闃O性生長[3]，從周圍環(huán)境中攝取營養(yǎng)，在菌絲的頂端或分枝處增加新的物質(zhì)，同時可以維持真菌在宿主體內(nèi)的菌絲形態(tài)以防止被宿主正常的免疫功能所清除，從而引起侵襲性感染的發(fā)生，如圖1所示。極性生長對于煙曲霉正常的生長和毒力有重要作用,而真菌細胞壁又是抗真菌藥物的重要靶點，所以對于煙曲霉極性生長以及細胞壁的研究以期發(fā)現(xiàn)新的抗真菌藥物靶點尤為重要。

圖1 煙曲霉孢子極性建立至出芽、形成菌絲及分枝示意圖

1 可影響細胞壁成分含量變化的極性生長相關(guān)基因

煙曲霉細胞壁中多糖成分主要有β-1,3葡聚糖、半乳甘露聚糖、幾丁質(zhì)等，是細胞壁三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)[4]，細胞壁合成受損時會影響煙曲霉的極性生長過程。

1.1 α-葡萄糖苷酶I基因

Romero等[5]在1997年定義了酵母中cwh41基因編碼α-葡萄糖苷酶I(CWH1P),且該基因間接參與了β-1,6-葡聚糖的合成[6]。cwh41基因在煙曲霉中的研究較少，Zhang等[7]在2008年通過在煙曲霉中敲除cwh41基因觀察到突變株在分生孢子出芽和菌絲延長時出現(xiàn)了異常的極性生長，分生孢子的形成明顯減少、細胞壁的完整性途徑(CWI)受損，并且引起煙曲霉所分泌蛋白的N-聚糖加工過程受限，所以他們當時推測可能是因為該基因敲除后影響了參與細胞壁合成的蛋白質(zhì)的功能而引起的。之后又進一步研究了ΔAfcwh41突變株表型變化的分子基礎(chǔ)，幾丁質(zhì)合成酶基因chsEb表達量下降，LHSLP(Hsp70伴侶家族成員之一)、鈣聯(lián)蛋白以及參與泛素介導(dǎo)降解的RPT6,E3泛素蛋白連接酶和組蛋白泛素化蛋白表達量均增加，也因此認為煙曲霉中cwh41基因缺陷會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。通過對ΔAfcwh41突變體的細胞骨架進行染色，在出芽的早期階段和菌絲延長的階段，分別觀察到幾丁質(zhì)斑塊集中分布在腫大的分生孢子中而在菌絲中是隨機分布的，在第一、二芽管處尤其是生長的尖端以及菌絲尖端并沒有熒光的聚集，這與在野生菌株中觀察到的結(jié)果截然不同，說明ΔAfcwh41突變株中極性的異常是由于肌動蛋白細胞骨架錯誤的極性定位所引起的[8]。

1.2 1,2-α-甘露糖苷酶基因

ɑ-甘露糖苷酶類對人類和牛等哺乳動物的生長發(fā)揮著重要的作用。ɑ-甘露糖苷酶分為I類和II類，在不同的物種有不同的活性。1993年Yoshida等[9]在橘青霉中克隆并定義了msdS基因編碼的1,2-ɑ-甘露糖苷酶，之后其在米曲霉[10]、構(gòu)巢曲霉[11]中均成功表達。煙曲霉中，msdS基因編碼的1,2-α-甘露糖苷酶(1,2-ɑ-mannosidase)屬于I類1,2-ɑ-甘露糖苷酶。ΔmsdS突變體的細胞壁的完整性受損，分生孢子的形成下降，細胞壁中α-葡聚糖、甘露糖蛋白、β-葡聚糖和幾丁質(zhì)含量都減少，但在免疫缺陷的小鼠模型中證明了msdS基因?qū)τ跓熐沟纳L和毒力并不是必須的。37℃，野生型菌株以經(jīng)典的雙極模式在18°方向分生孢子出芽，并且在第一芽管附近的“頸部”的位置形成隔膜，而ΔmsdS突變株中第二芽管的出現(xiàn)是在12°方向生長的，隔膜是在新生芽管頸部的部位形成的，而且要早于野生菌株中第二芽管生長(7～8 h)。突變株的芽管要比野生型菌株的芽管更加腫脹，且4輪有絲分裂后在菌絲尖端沒有形成隔膜，突變株形成多核、少?；哪遗荻甲C明了msdS基因缺陷降低了菌絲生長過程中的極性生長和分隔作用[12]。

1.3 鋅指轉(zhuǎn)錄因子Crz1同源物

鈣調(diào)磷酸酶途徑(calcineurin pathway)是真菌中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)真菌的生長、形態(tài)、壓力反應(yīng)及致病性。CrzA(鋅指轉(zhuǎn)錄因子Crz1同源物)是煙曲霉中鈣調(diào)磷酸酶途徑中重要的下游因子，CrzA的缺陷引起了細胞壁β-1,3-葡聚糖含量降低[13]。在煙曲霉ΔcrzA突變株中觀察到出芽減少并且時間延長，菌絲極性生長比野生型要少68%，并且掃描電鏡下觀察到菌絲尖端變鈍且存在畸形；分生孢子形成較少且其表面相對平滑，說明CrzA參與煙曲霉極性生長過程，但同時可能也有其它的基因參與著菌絲極性生長和形態(tài)發(fā)生。CrzA還可以促進鈣脅迫耐受[14]，且在特定的位點控制分生孢子的產(chǎn)生和煙曲霉的毒力[15]。

1.4 Rho GTP酶基因家族

Rho GTP酶基因家族包括rhoA、cdc42、racA，從真菌至人類都是高度保守的，它們調(diào)節(jié)細胞外信號，激發(fā)肌動蛋白細胞骨架的變化[16]，在細胞極性生長方面扮演著中心角色。在新生隱球菌中，racA同源基因在ras1下游發(fā)揮作用，并與ste20協(xié)同來共同控制新生隱球菌在高溫下的生長和細胞分化[17]。在白念珠菌中，racA以及其激活劑dck1對于侵襲性絲狀真菌的生長是必需的。在解脂耶氏酵母[18]和馬爾尼菲籃狀菌[19]中均已發(fā)現(xiàn)racA基因參與極性生長過程。在煙曲霉中，racA參與菌落的增殖和分生孢子的產(chǎn)生，ΔracA菌株形成的菌落更致密，菌落直徑要比野生型短，菌絲過度分枝且變鈍，末端變卷曲，F(xiàn)ortwendel等[20]也發(fā)現(xiàn)該基因缺陷后出芽及菌絲形態(tài)表現(xiàn)異常且細胞壁完整性途徑受損，這些都表明racA參與了煙曲霉極性生長[21]，其介導(dǎo)的ROS信號途徑可能是極性生長的發(fā)育信號[22]。

煙曲霉中rhoA基因缺陷后細胞壁中β-1,3-葡聚糖的含量和葡萄糖胺的含量減少，細胞壁完整性受損，致病性也降低，同時抑制了分生孢子向肺上皮細胞的移動以及炎癥因子的釋放[23]。cdc42已經(jīng)發(fā)現(xiàn)參與了裂殖酵母[24]、白假絲酵母菌[25]的極性生長過程，煙曲霉中cdc42以及rhoA可以介導(dǎo)膠霉菌素引發(fā)的煙曲霉細胞內(nèi)在化，從而引起侵襲性感染[26]。極性生長相關(guān)基因sho1敲除后引起Rho GTP酶基因家族的表達量下降[27]。

此外，既參與極性生長過程又可以影響細胞壁成分含量的變化的基因還有很多，如幾丁質(zhì)合成酶chs基因、α-1,3葡聚糖合成酶基因(ags1,ags2,ags3)等。

2 可影響細胞壁塑型的極性生長相關(guān)基因

細胞壁的三維空間結(jié)構(gòu)需要細胞壁各個組分進行重構(gòu)、交聯(lián)后形成，常需要特定的轉(zhuǎn)移酶或通過GPI錨定在細胞壁上的蛋白來完成[4]，參與這一環(huán)節(jié)的基因缺陷后會影響煙曲霉極性生長過程。

2.1 磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶基因

真菌中有很多維持細胞壁功能以及參與真菌致病的蛋白質(zhì)都是通過糖基磷脂酰肌醇(GPI,glycosylphosphatidylinositol)錨來固定在真菌細胞表面的，磷酸乙醇胺(EtN-P,phosphoethanolamine)與GPI錨的連接、移動及修飾對于GPI錨定蛋白的成熟和分類有重要作用。在酵母菌中已經(jīng)證明gpi7基因敲除后細胞壁的完整性有所受損[28]，Δgpi7的出芽模式、胞質(zhì)分裂、細胞形態(tài)以及細胞壁結(jié)構(gòu)都有異常[29]。煙曲霉中g(shù)pi7基因編碼了EtN-P轉(zhuǎn)移酶，Δgpi7第一、二、三芽管的出現(xiàn)及出芽都要早于野生型菌株，且93.1%的突變株顯示菌絲高度分枝且在其尖端有幾丁質(zhì)聚集；Δgpi7沒有形成芽體且產(chǎn)生的孢子數(shù)僅僅是野生型菌株的30%都說明gpi7參與了煙曲霉極性生長[30]，但煙曲霉中關(guān)于gpi7基因的研究相對較少。

2.2 β-1,3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因

gel基因家族編碼的β-1,3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶可引起煙曲霉細胞壁中β-1,3葡聚糖的延伸[31]。煙曲霉中，gel家族共有7個開放閱讀框架：gel1-gel7，在菌絲生長過程中表達的只有g(shù)el1、gel2和gel4。gel1最初由Mouyna等[32]定義，其編碼的GPI-錨定蛋白與釀酒酵母中GAS1P[33]以及白假絲酵母菌中PHRP同源[34]，參與真菌細胞壁的合成，但gel1基因的敲除并未引起表型的改變。gel2與gel1同源，但GEL2P并不能完全補充gel1基因敲除株的生長缺陷，Δgel2中生長明顯降低，分生孢子的形態(tài)學方面也有較大差異，有的很短，有的卻類似菌絲，并且在感染的小鼠模型中觀察到Δgel1Δgel2和Δgel2的毒力降低[35]。gel4的表達量比gel1和gel2要多[31],且GEL4P有雙β-1,3-葡聚糖延伸和分枝活性[36]。gel1和gel4參與了同向和極性生長，而gel2和gel5僅在分生孢子的極性生長過程中表達[2]。Zhao等[37]首次說明了gel7的功能，gel7可能對gel1和gel2有一定的補償作用，但功能又各自不同，gel7參與分生孢子的形成，敲除后引起出芽延遲，分生孢子數(shù)量減少且分生孢子頭部表現(xiàn)出類似“禿頂”的區(qū)域。以上均說明gel家族參與了分生孢子形成、形態(tài)發(fā)生及細胞壁塑性過程。

2.3 α-1,2甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因

煙曲霉中主要的甘露聚糖結(jié)構(gòu)是與β-1,3-葡聚糖-幾丁質(zhì)細胞壁核心交聯(lián)的半乳甘露聚糖。ktr基因家族(kre2/mnt1家族)編碼的α-1,2甘露糖基轉(zhuǎn)移酶參與蛋白質(zhì)的糖基化過程，在不同真菌的細胞壁、菌絲、孢子等方面發(fā)揮著不同的作用，參與了極性生長過程。在釀酒酵母和白假絲酵母菌中，ktr基因家族分別包括9個和5個成員，煙曲霉中僅有3個成員：ktr1、ktr4、ktr7[38]。ktr1、ktr4和ktr7在休眠的分生孢子、芽管和菌絲中均有表達。ktr1是煙曲霉中第3個ktr同源基因，Δktr1突變株在37℃時孢子形成及分生孢子出芽無明顯異常，只是菌絲細胞壁較薄，在48℃時孢子數(shù)量明顯減少且形成短的芽管，可能是由于基因敲除后細胞壁的不穩(wěn)定性引起了菌絲尖端的泄露[39]。ktr4和ktr7編碼的蛋白是細胞壁半乳甘露聚糖產(chǎn)物的關(guān)鍵酶，二者與酵母中ktr4和ktr7同源。Δktr4和Δktr7突變株在極性生長和分生孢子發(fā)芽方面表現(xiàn)出了嚴重的生長表型缺陷，分生孢子活力顯著降低，形成了密集的菌絲且過度分枝，可能與基因敲除后分生孢子通透性增加有關(guān)系，且Δktr4和Δktr7最多可形成7個芽管且沒有特定的出芽位點。

還有很多基因既參與了煙曲霉極性生長過程又參與細胞壁多糖合成后的交聯(lián)、水解等，如負責幾丁質(zhì)與葡聚糖交聯(lián)的crh基因家族，α-1,3葡聚糖水解酶、bgt1和bgt2基因等。

3 小 結(jié)

煙曲霉是我國侵襲性曲霉病中占主要地位的致病菌，侵襲性曲霉病的發(fā)病率逐年升高，但煙曲霉菌株出現(xiàn)耐藥的現(xiàn)象也明顯增多。煙曲霉極性生長參與其在人體內(nèi)存活、繁殖及毒力等過程，是一個極其復(fù)雜的過程，其機制尚未完全清楚，而細胞壁作為煙曲霉與宿主接觸的首要環(huán)節(jié)而發(fā)揮著重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)多個基因可以通過不同的信號通路或者彼此之間相互作用來影響煙曲霉的生長，對于煙曲霉極性生長相關(guān)基因與煙曲霉細胞壁的研究有助于我們發(fā)現(xiàn)新的抗真菌藥物靶點，從而研制更多可用于臨床的抗真菌藥物。