王莉 王華 周潔 翟曉翔

(1.上海市第七人民醫(yī)院皮膚科，上海 200137；2.上海浦東公利醫(yī)院急診科，上海 200135)

近年來(lái)，為應(yīng)對(duì)真菌耐藥率的增加，我們嘗試篩選出一些對(duì)常用抗真菌藥物具有協(xié)同作用且易獲取的藥物。先前的研究已經(jīng)觀察到28種非經(jīng)典抗真菌藥，如他克莫司、舍曲林和利福噴丁與適當(dāng)濃度的氟康唑聯(lián)用對(duì)白念珠菌的體外抑制作用，其中他克莫司(FK506)和環(huán)孢菌素A(CyA)對(duì)氟康唑表現(xiàn)出最顯著的體外協(xié)同抗白念珠菌作用[1]。我們采用棋盤(pán)式微量液基稀釋法對(duì)他克莫司與部分常用抗真菌劑的體外協(xié)同作用進(jìn)行了比較，進(jìn)而篩選出藥物組合的最佳方案。研究結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

藥物 他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K506)原料藥購(gòu)自麥克林生化科技有限公司；兩性霉素B(amphotericin B，AmB)購(gòu)自西安南斯科技有限公司；咪康唑(miconazole，MCZ)、伊曲康唑(itraconazole，ITZ)、酮康唑(ketoconazole，KCZ)及特比萘芬(terbinafine，TBNF)購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

主要試劑 RPMI1640粉末購(gòu)自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

受試菌株 對(duì)氟康唑耐藥的白念珠菌臨床分離株(FCZ-resistant isolates ofCandidaalbicans)，共3株，由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院保存和提供。 經(jīng)過(guò)形態(tài)和生化鑒定并篩選用于體外藥物敏感性測(cè)試后，獲取了MIC80> 256 μg / mL的耐氟康唑菌株。同時(shí)，為確保藥物測(cè)試可靠性，選擇了CLSI推薦的ATCC菌株作為標(biāo)準(zhǔn)菌株：近平滑念珠菌ATCC22019(CandidaparapsilosisATCC22019)。

培養(yǎng)基配制 SDA培養(yǎng)基：900 mL三蒸餾水中加入葡萄糖40 g、瓊脂18 g、蛋白胨10 g，攪拌加熱至完全溶解；用氯霉素水溶液(2 mg/mL)將其pH調(diào)節(jié)至7.0±0.1(常溫)，將該溶液稀釋至1000 mL，分管密封包裝，經(jīng)高壓滅菌，并在4℃下保存、備用。 YEPD培養(yǎng)液：900 mL三蒸餾水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母提取物10g，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?；用氯霉素水溶?2 mg/mL)調(diào)整pH，將該溶液稀釋至1000 mL，分管密封包裝，經(jīng)高壓滅菌，并在4℃下保存、備用。 RPMI1640培養(yǎng)基：900 mL三蒸餾水中加入嗎啡啉丙磺酸34.5 g，碳酸氫鈉2.0 g、 RPMI1640粉末10 g，攪拌至完全溶解；用NaOH溶液(1 mol / L )將其pH調(diào)節(jié)至7.0±0.1(常溫)；將該溶液稀釋至1000 mL使用直徑為0.22 μm的微孔膜(廣東環(huán)凱生物科技有限公司生產(chǎn)，Ф50水系)進(jìn)行過(guò)濾，等分并高壓滅菌后在4℃下保存、備用。

主要儀器設(shè)備 96孔平底帶蓋平板購(gòu)自上海艾研生物科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS)購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠；智能型真菌培養(yǎng)箱(MJX-150L)購(gòu)自上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司；單人雙面凈化工作臺(tái)(SW-CJ-1F)購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HZ-9211K恒溫振蕩器、BSA1245-CW電子天平以及Multiskan MK3型酶標(biāo)檢測(cè)儀均購(gòu)自蘇州賽恩斯儀器有限公司。

1.2 方法

他克莫司原液的配制 取1.5 mL EP管1根，將1 mL二甲基亞砜作為溶劑、1 mg他克莫司原料藥為溶質(zhì)，配制成藥物原液，其溶度為1 mg/mL，并在4℃條件下，避光干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

抗真菌藥物母液的配制 以二甲亞砜(DMSO)作為溶劑，將酮康唑、伊曲康唑、特比萘芬、咪康唑及兩性霉素B等多種原料藥作為溶質(zhì)，各自配制成6.4 mg/mL的母液并-20℃條件下保存?zhèn)溆茫瑑尚悦顾谺母液應(yīng)注意避光。

菌懸液的配制 取1 mL的 YEPD培養(yǎng)液，把挑取自4℃的SDA培養(yǎng)基的少量菌株接種至該培養(yǎng)液中，并在30℃,200 r/min環(huán)境參數(shù)下進(jìn)行震蕩培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)24 h活化后(“一次活化”)，該真菌處于指數(shù)生長(zhǎng)的后期；“一次活化”完成后，取10μL該種“一次活化”真菌溶液，并將其加入1 mL YEPD培養(yǎng)液中，繼而以相同環(huán)境參數(shù)及方法活化16 h(“二次活化”)；“二次活化”完成后，取10 μL的該種“二次活化”真菌培養(yǎng)液加入到10 mL RPMI1640培養(yǎng)液中，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器設(shè)定其濃度為5×103CFU/mL并定為實(shí)驗(yàn)用菌懸液。 任一菌株的接種必須限定在15 min內(nèi)，同時(shí)，確保用于繼代和培養(yǎng)的培養(yǎng)基不會(huì)污染實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基。

他克莫司的抑菌濃度(MIC80)值判定 依據(jù)2002年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)發(fā)布的M27-A2程序?qū)嵤┧幬颩IC值的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)使用96孔板作為培養(yǎng)板；第1列每孔中添加RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL，作為陰性對(duì)照孔；第2列至第12列每孔中添加菌懸液100 μL，作為實(shí)驗(yàn)孔；然后在第2列每孔中添加100 μL他克莫司藥物溶液，此時(shí)他克莫司的濃度為500 μg / mL，待在充分混合后從第2列的孔中吸取100 μL含藥菌液并添加入第3列對(duì)應(yīng)孔中，待再次充分混合后同樣吸取100 μL含藥菌液并添加入第4列，依次操作直至第11列；最后從第11列中吸取100 μL含藥菌液并丟棄； 第12列為無(wú)藥真菌溶液，作為無(wú)藥對(duì)照孔。此時(shí)，第2列至第11列中的藥物濃度分別為500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.63 μg/mL、7.81 μg/mL、3.91 μg/mL、1.95 μg/mL、0.98 μg/mL。將培養(yǎng)板置于35℃的恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后取出培養(yǎng)板，通過(guò)酶標(biāo)記分析儀測(cè)量每孔在波長(zhǎng)為630 nm的OD值，并記錄為MIC80值(真菌生長(zhǎng)被抑制80%時(shí)的藥物濃度，下同)，如果MIC80值超出可測(cè)范圍：當(dāng)MIC80值在最大濃度500 μg/ mL之上，則記錄為“>500 μg/mL”；當(dāng)MIC80值等于或低于最小濃度0.98 μg/mL，則記錄為“≤0.98 μg/mL”。重復(fù)2～3次上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程，當(dāng)MIC80值多次僅差一個(gè)藥物濃度差或相同時(shí)即止。在觀測(cè)記錄該藥物的MIC80值之前，必須查看第1列的培養(yǎng)液是否透明、第12列的真菌生長(zhǎng)是否正常，以此判斷實(shí)驗(yàn)過(guò)程有無(wú)被污染，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠。

抗真菌藥物的抑菌濃度(MIC)值判定 抗真菌藥物的抑菌濃度(MIC)值判定方法基本同上。以伊曲康唑?yàn)槔涸诘?列和第12列中分別加入陰性對(duì)照RPMI 1640培養(yǎng)基和陽(yáng)性對(duì)照菌懸液200 μL，第2列每孔中添加32 μL伊曲康唑藥液和168 μL菌懸液，即伊曲康唑的起始濃度為1024 μg/ mL。從第2列到第11列依次倍比稀釋，最后從第11列中吸取100 μL含藥菌液并丟棄。將培養(yǎng)板置于恒溫箱中培養(yǎng)48 h后取出，在確定實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)污染的情況下測(cè)定OD值及MIC80值。通過(guò)該方法分別測(cè)定特比萘芬、酮康唑、咪康唑?qū)?shí)驗(yàn)菌株的MIC80值及兩性霉素B的MIC值。

他克莫司與抗真菌藥合用后的分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)(FICI)值判定 以3株耐氟康唑的白念珠菌臨床分離株為實(shí)驗(yàn)菌株，使用棋盤(pán)微液稀釋法，測(cè)算他克莫司(FK506)分別聯(lián)合兩性霉素B、特比萘芬、酮康唑、咪康唑和伊曲康唑等藥物的FICI值。具體方法如下：實(shí)驗(yàn)使用96孔板作為培養(yǎng)板；組合使用的他克莫司與抗真菌藥物分別在培養(yǎng)板的第A至H行及第2至11列縱、橫兩個(gè)方向依次進(jìn)行4倍的倍比稀釋；抗真菌藥物稀釋范圍：伊曲康唑：256～0 μg/mL；酮康唑：64～0 μg/ mL；兩性霉素B：8～0 μg/mL；咪康唑：64～0 μg/mL；特比萘芬：64～0 μg/mL。他克莫司的初始藥物濃度為其對(duì)相應(yīng)受試菌株MIC80值的1/4；同樣在培養(yǎng)板的第1行和第12行設(shè)置陰性對(duì)照組(培養(yǎng)基對(duì)照)和無(wú)藥對(duì)照組(真菌生長(zhǎng)對(duì)照)。將培養(yǎng)板置于恒溫箱中培養(yǎng)48 h后取出，在保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)污染的情況下測(cè)定每孔在630 nm下的OD值，以確定幾種藥物合用后的MIC并逐個(gè)計(jì)算出FICI。所有實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次，取3次的平均值作為最終的FICI。

他克莫司與抗真菌聯(lián)合使用后的效果評(píng)價(jià) 他克莫司與5種抗真菌藥物兩兩組合后各藥的MIC值除以各藥獨(dú)用時(shí)的MIC值的商之總和為FICI，即FICI =MICA合/ MICA單+MICB合/ MICB單。判斷標(biāo)準(zhǔn)：若FICI≤0.5，則可判定兩藥間具有協(xié)同作用，并且FICI值與協(xié)同作用負(fù)相關(guān)；若0.5 4，則兩藥是相互拮抗的。

質(zhì)控菌 依據(jù)CLSI提出的M27-A2方案，本實(shí)驗(yàn)采用的質(zhì)控菌是近平滑念珠菌ATCC22019(CandidaparapsilosisATCC22019)，每次實(shí)驗(yàn)需準(zhǔn)備藥敏面板若干和一個(gè)質(zhì)控菌面板。部分抗真菌劑對(duì)質(zhì)控菌的MIC80值：酮康唑：0.125～0.5 μg/mL；伊曲康唑：0.06～0.25 μg/mL；兩性霉素B的MIC值：0.25 μg/mL～1.0 μg/mL。 僅當(dāng)抗真菌劑對(duì)質(zhì)控菌的MIC值在標(biāo)準(zhǔn)值內(nèi)且菌株生長(zhǎng)良好時(shí)，才能判定為實(shí)驗(yàn)過(guò)程準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。

2 結(jié) 果

2.1 他克莫司對(duì)常用抗真菌藥體外抗耐藥白念珠菌協(xié)同作用

在實(shí)驗(yàn)的這一部分中，我們使用棋盤(pán)法觀察了他克莫司和5種常用的抗真菌藥(兩性霉素B、特比萘芬、咪康唑、伊曲康唑和酮康唑)聯(lián)合使用對(duì)3株白念珠菌株(Candidaalbicans103、Candidaalbicans100及Candidaalbicans115)的體外協(xié)同抑制作用。結(jié)果表明：他克莫司和所有5種候選抗真菌藥的組合在這3株測(cè)試菌株中顯示出不同程度的協(xié)同作用，尤以兩性霉素B和他克莫司的組合最為明顯，具體表現(xiàn)為兩種藥物組合后的FICI值最低(FICI為0.05至0.06)，并且菌株之間無(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)；其次是咪康唑，兩者組合后的FICI值為0.09至0.13(見(jiàn)表2)；他克莫司-伊曲康唑組對(duì)3株被測(cè)耐藥菌的FICI值為0.25(見(jiàn)表3)；酮康唑—他克莫司組和特比萘芬—他克莫司組的體外抗耐藥真菌協(xié)同作用相對(duì)較弱：酮康唑—他克莫司組的FICI值在0.31到0.38間(見(jiàn)表4)，特比萘芬—他克莫司組的FICI值均為0.50(見(jiàn)表5)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)藥物同他克莫司聯(lián)合使用中均未發(fā)生拮抗作用。質(zhì)控菌株ATCC22019生長(zhǎng)良好，對(duì)所有受試藥物的MIC值均在標(biāo)準(zhǔn)值內(nèi)，故可判定該實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)方法準(zhǔn)確，結(jié)果可靠。

表1 他克莫司—兩性霉素B組抗耐藥白念珠菌作用

表2 他克莫司—咪康唑組抗耐藥白念珠菌作用

表3 他克莫司—伊曲康唑組抗耐藥白念珠菌作用

表4 他克莫司—酮康唑組抗耐藥白念珠菌作用

表5 他克莫司—特比萘芬組抗耐藥白念珠菌作用

3 討 論

近年來(lái)，各種因素導(dǎo)致抗真菌藥的大量使用甚至濫用，致使真菌耐藥率大幅增加。研發(fā)新的藥物需要高昂的成本，而藥物上市后的大量使用又進(jìn)一步加劇了藥物耐藥的產(chǎn)生。因此，如果能夠在常見(jiàn)藥物中篩選一些對(duì)常用抗真菌藥具有協(xié)同作用的藥物，無(wú)疑是一種低成本且行之有效的方法。在前期研究中，我們觀察到大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)免疫抑制劑他克莫司(FK506)對(duì)氟康唑具有較好的體外抗真菌增效作用[1]，故在本階段的實(shí)驗(yàn)中，我們繼續(xù)采用棋盤(pán)式微量液基稀釋法針對(duì)他克莫司同其他幾種常用抗真菌藥的體外協(xié)同作用做了進(jìn)一步的探究和比較，嘗試篩選出協(xié)同作用相對(duì)顯著的藥物組合方案。研究結(jié)果顯示：在備選5種藥物組合中，他克莫司-兩性霉素B組合表現(xiàn)出了最佳的體外協(xié)同抗耐藥白念珠菌作用，這與Gao等[2]及Kubi?a等[3]對(duì)他克莫司和兩性霉素B聯(lián)合后對(duì)曲霉菌屬和赤霉菌屬真菌的體外協(xié)同增效作用的研究結(jié)果基本一致。在后兩者的研究中，他克莫司與兩性霉素B組合后對(duì)白念珠菌以外的其他菌屬菌株也表現(xiàn)出了顯著的體外協(xié)同增效作用，故此我們推測(cè)，兩性霉素B與他克莫司聯(lián)合后，或可明顯提高兩性霉素B對(duì)諸多真菌菌株，甚至是對(duì)耐藥菌株的抗真菌活性。此外，在我們的研究中，他克莫司分別同咪康唑、伊曲康唑及酮康唑聯(lián)合使用后對(duì)受試白念珠菌也表現(xiàn)了一定的體外協(xié)同作用，無(wú)一藥物組合表現(xiàn)拮抗作用。這一協(xié)同作用在Zhang等[4]對(duì)皮膚癬菌體外分離株的研究中也得到了體現(xiàn)。Zhang等的研究發(fā)現(xiàn)：他克莫司與伊曲康唑、特比萘芬及聯(lián)苯芐唑組合后分別對(duì)53%、53%及63%的受試皮膚癬菌體外分離株表現(xiàn)了的較強(qiáng)的體外協(xié)同作用。

如青霉素提取自青霉菌一般，他克莫司同樣是從鏈霉菌屬中分離而來(lái)。在哺乳動(dòng)物中，他克莫司、結(jié)合蛋白FKBP12及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶可形成三元復(fù)合物，該復(fù)合物抑制活化T細(xì)胞的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶核因子(NFAT)通路，進(jìn)而阻止T細(xì)胞增殖。臨床上，他克莫司的全身用藥常用于預(yù)防同種異體移植器官患者的排斥反應(yīng)，而局部使用則主要用于治療白癜風(fēng)、特應(yīng)性皮炎等自身免疫相關(guān)性皮膚病，近年來(lái)也逐漸開(kāi)始用于激素依賴性皮炎及脂溢性皮炎的治療[5-6]。但作為免疫抑制劑的一種，他克莫司在臨床上一直被視為真菌性皮膚病治療的藥物禁忌。而近些年，已有研究顯示他克莫司可以局部用藥促進(jìn)頑固性體癬的恢復(fù)，甚至有研究者嘗試將他克莫司與環(huán)孢菌素A等鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑作為抗真菌藥研發(fā)的新方向和靶點(diǎn)[7-8]。我們的研究結(jié)果也提示：他克莫司與多種傳統(tǒng)抗真菌藥，包括兩性霉素與唑類(lèi)等都存在較好的體外協(xié)同抗耐藥白念珠菌作用。由于他克莫司系鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑的一種，而鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路又在多項(xiàng)研究中被證實(shí)與真菌細(xì)胞壁的完整性及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)等多種造成抗真菌藥物耐藥的因素有關(guān)，且作為與白念珠菌耐藥密切相關(guān)的基因之一，RTA2基因的表達(dá)上調(diào)也在體內(nèi)、外被證實(shí)與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路的充分激活有關(guān)[9-10]。故此，依據(jù)他克莫司和常用抗真菌藥的藥理學(xué)作用，不難解釋本次實(shí)驗(yàn)中，他克莫司與兩性霉素B及其他常用抗真菌藥所表現(xiàn)出的或強(qiáng)或弱的體外協(xié)同抗耐藥菌株作用。鑒于他克莫司在實(shí)際應(yīng)用中具有明顯的免疫抑制作用，無(wú)法作為抗真菌藥物直接使用，也有學(xué)者嘗試使用一些細(xì)胞毒性和免疫抑制活性相對(duì)較低的他克莫司類(lèi)似物，如31-O-脫甲基-FK506、9-脫氧-FK506等與抗真菌藥聯(lián)合使用，也觀察到了類(lèi)似的協(xié)同增效作用[11]，故他克莫司及類(lèi)似物與常用抗真菌藥組合使用，尤其是兩性霉素B，或可作為臨床上耐藥真菌病治療的可能方案之一。但不得不提的是，目前無(wú)論是針對(duì)他克莫司還是其類(lèi)似物的抗真菌增效作用研究仍多局限于體外試驗(yàn)，很少涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究，故其在體內(nèi)抗真菌增效作用及使用安全性尚待進(jìn)一步觀察。