王莉 王華 周潔 翟曉翔

(1.上海市第七人民醫(yī)院皮膚科，上海 200137；2.上海浦東公利醫(yī)院急診科，上海 200135)

近年來，為應(yīng)對真菌耐藥率的增加，我們嘗試篩選出一些對常用抗真菌藥物具有協(xié)同作用且易獲取的藥物。先前的研究已經(jīng)觀察到28種非經(jīng)典抗真菌藥，如他克莫司、舍曲林和利福噴丁與適當(dāng)濃度的氟康唑聯(lián)用對白念珠菌的體外抑制作用，其中他克莫司(FK506)和環(huán)孢菌素A(CyA)對氟康唑表現(xiàn)出最顯著的體外協(xié)同抗白念珠菌作用[1]。我們采用棋盤式微量液基稀釋法對他克莫司與部分常用抗真菌劑的體外協(xié)同作用進行了比較，進而篩選出藥物組合的最佳方案。研究結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

藥物 他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K506)原料藥購自麥克林生化科技有限公司；兩性霉素B(amphotericin B，AmB)購自西安南斯科技有限公司；咪康唑(miconazole，MCZ)、伊曲康唑(itraconazole，ITZ)、酮康唑(ketoconazole，KCZ)及特比萘芬(terbinafine，TBNF)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

主要試劑 RPMI1640粉末購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

受試菌株 對氟康唑耐藥的白念珠菌臨床分離株(FCZ-resistant isolates ofCandidaalbicans)，共3株，由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院保存和提供。 經(jīng)過形態(tài)和生化鑒定并篩選用于體外藥物敏感性測試后，獲取了MIC80> 256 μg / mL的耐氟康唑菌株。同時，為確保藥物測試可靠性，選擇了CLSI推薦的ATCC菌株作為標準菌株：近平滑念珠菌ATCC22019(CandidaparapsilosisATCC22019)。

培養(yǎng)基配制 SDA培養(yǎng)基：900 mL三蒸餾水中加入葡萄糖40 g、瓊脂18 g、蛋白胨10 g，攪拌加熱至完全溶解；用氯霉素水溶液(2 mg/mL)將其pH調(diào)節(jié)至7.0±0.1(常溫)，將該溶液稀釋至1000 mL，分管密封包裝，經(jīng)高壓滅菌，并在4℃下保存、備用。 YEPD培養(yǎng)液：900 mL三蒸餾水中加入葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母提取物10g，充分攪拌至完全溶解；用氯霉素水溶液(2 mg/mL)調(diào)整pH，將該溶液稀釋至1000 mL，分管密封包裝，經(jīng)高壓滅菌，并在4℃下保存、備用。 RPMI1640培養(yǎng)基：900 mL三蒸餾水中加入嗎啡啉丙磺酸34.5 g，碳酸氫鈉2.0 g、 RPMI1640粉末10 g，攪拌至完全溶解；用NaOH溶液(1 mol / L )將其pH調(diào)節(jié)至7.0±0.1(常溫)；將該溶液稀釋至1000 mL使用直徑為0.22 μm的微孔膜(廣東環(huán)凱生物科技有限公司生產(chǎn)，Ф50水系)進行過濾，等分并高壓滅菌后在4℃下保存、備用。

主要儀器設(shè)備 96孔平底帶蓋平板購自上海艾研生物科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS)購自上海申安醫(yī)療器械廠；智能型真菌培養(yǎng)箱(MJX-150L)購自上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司；單人雙面凈化工作臺(SW-CJ-1F)購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HZ-9211K恒溫振蕩器、BSA1245-CW電子天平以及Multiskan MK3型酶標檢測儀均購自蘇州賽恩斯儀器有限公司。

1.2 方法

他克莫司原液的配制 取1.5 mL EP管1根，將1 mL二甲基亞砜作為溶劑、1 mg他克莫司原料藥為溶質(zhì)，配制成藥物原液，其溶度為1 mg/mL，并在4℃條件下，避光干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

抗真菌藥物母液的配制 以二甲亞砜(DMSO)作為溶劑，將酮康唑、伊曲康唑、特比萘芬、咪康唑及兩性霉素B等多種原料藥作為溶質(zhì)，各自配制成6.4 mg/mL的母液并-20℃條件下保存?zhèn)溆?，兩性霉素B母液應(yīng)注意避光。

菌懸液的配制 取1 mL的 YEPD培養(yǎng)液，把挑取自4℃的SDA培養(yǎng)基的少量菌株接種至該培養(yǎng)液中，并在30℃,200 r/min環(huán)境參數(shù)下進行震蕩培養(yǎng)。經(jīng)過24 h活化后(“一次活化”)，該真菌處于指數(shù)生長的后期；“一次活化”完成后，取10μL該種“一次活化”真菌溶液，并將其加入1 mL YEPD培養(yǎng)液中，繼而以相同環(huán)境參數(shù)及方法活化16 h(“二次活化”)；“二次活化”完成后，取10 μL的該種“二次活化”真菌培養(yǎng)液加入到10 mL RPMI1640培養(yǎng)液中，使用血細胞計數(shù)器設(shè)定其濃度為5×103CFU/mL并定為實驗用菌懸液。 任一菌株的接種必須限定在15 min內(nèi)，同時，確保用于繼代和培養(yǎng)的培養(yǎng)基不會污染實驗中使用的培養(yǎng)基。

他克莫司的抑菌濃度(MIC80)值判定 依據(jù)2002年美國臨床實驗室標準協(xié)會(CLSI)發(fā)布的M27-A2程序?qū)嵤┧幬颩IC值的測定。實驗使用96孔板作為培養(yǎng)板；第1列每孔中添加RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL，作為陰性對照孔；第2列至第12列每孔中添加菌懸液100 μL，作為實驗孔；然后在第2列每孔中添加100 μL他克莫司藥物溶液，此時他克莫司的濃度為500 μg / mL，待在充分混合后從第2列的孔中吸取100 μL含藥菌液并添加入第3列對應(yīng)孔中，待再次充分混合后同樣吸取100 μL含藥菌液并添加入第4列，依次操作直至第11列；最后從第11列中吸取100 μL含藥菌液并丟棄； 第12列為無藥真菌溶液，作為無藥對照孔。此時，第2列至第11列中的藥物濃度分別為500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.63 μg/mL、7.81 μg/mL、3.91 μg/mL、1.95 μg/mL、0.98 μg/mL。將培養(yǎng)板置于35℃的恒溫箱中進行培養(yǎng)，48 h后取出培養(yǎng)板，通過酶標記分析儀測量每孔在波長為630 nm的OD值，并記錄為MIC80值(真菌生長被抑制80%時的藥物濃度，下同)，如果MIC80值超出可測范圍：當(dāng)MIC80值在最大濃度500 μg/ mL之上，則記錄為“>500 μg/mL”；當(dāng)MIC80值等于或低于最小濃度0.98 μg/mL，則記錄為“≤0.98 μg/mL”。重復(fù)2～3次上述實驗過程，當(dāng)MIC80值多次僅差一個藥物濃度差或相同時即止。在觀測記錄該藥物的MIC80值之前，必須查看第1列的培養(yǎng)液是否透明、第12列的真菌生長是否正常，以此判斷實驗過程有無被污染，確保實驗數(shù)據(jù)的準確可靠。

抗真菌藥物的抑菌濃度(MIC)值判定 抗真菌藥物的抑菌濃度(MIC)值判定方法基本同上。以伊曲康唑為例：在第1列和第12列中分別加入陰性對照RPMI 1640培養(yǎng)基和陽性對照菌懸液200 μL，第2列每孔中添加32 μL伊曲康唑藥液和168 μL菌懸液，即伊曲康唑的起始濃度為1024 μg/ mL。從第2列到第11列依次倍比稀釋，最后從第11列中吸取100 μL含藥菌液并丟棄。將培養(yǎng)板置于恒溫箱中培養(yǎng)48 h后取出，在確定實驗過程無污染的情況下測定OD值及MIC80值。通過該方法分別測定特比萘芬、酮康唑、咪康唑?qū)嶒灳甑腗IC80值及兩性霉素B的MIC值。

他克莫司與抗真菌藥合用后的分數(shù)抑菌濃度指數(shù)(FICI)值判定 以3株耐氟康唑的白念珠菌臨床分離株為實驗菌株，使用棋盤微液稀釋法，測算他克莫司(FK506)分別聯(lián)合兩性霉素B、特比萘芬、酮康唑、咪康唑和伊曲康唑等藥物的FICI值。具體方法如下：實驗使用96孔板作為培養(yǎng)板；組合使用的他克莫司與抗真菌藥物分別在培養(yǎng)板的第A至H行及第2至11列縱、橫兩個方向依次進行4倍的倍比稀釋；抗真菌藥物稀釋范圍：伊曲康唑：256～0 μg/mL；酮康唑：64～0 μg/ mL；兩性霉素B：8～0 μg/mL；咪康唑：64～0 μg/mL；特比萘芬：64～0 μg/mL。他克莫司的初始藥物濃度為其對相應(yīng)受試菌株MIC80值的1/4；同樣在培養(yǎng)板的第1行和第12行設(shè)置陰性對照組(培養(yǎng)基對照)和無藥對照組(真菌生長對照)。將培養(yǎng)板置于恒溫箱中培養(yǎng)48 h后取出，在保證實驗過程無污染的情況下測定每孔在630 nm下的OD值，以確定幾種藥物合用后的MIC并逐個計算出FICI。所有實驗平行進行3次，取3次的平均值作為最終的FICI。

他克莫司與抗真菌聯(lián)合使用后的效果評價 他克莫司與5種抗真菌藥物兩兩組合后各藥的MIC值除以各藥獨用時的MIC值的商之總和為FICI，即FICI =MICA合/ MICA單+MICB合/ MICB單。判斷標準：若FICI≤0.5，則可判定兩藥間具有協(xié)同作用，并且FICI值與協(xié)同作用負相關(guān)；若0.5 4，則兩藥是相互拮抗的。

質(zhì)控菌 依據(jù)CLSI提出的M27-A2方案，本實驗采用的質(zhì)控菌是近平滑念珠菌ATCC22019(CandidaparapsilosisATCC22019)，每次實驗需準備藥敏面板若干和一個質(zhì)控菌面板。部分抗真菌劑對質(zhì)控菌的MIC80值：酮康唑：0.125～0.5 μg/mL；伊曲康唑：0.06～0.25 μg/mL；兩性霉素B的MIC值：0.25 μg/mL～1.0 μg/mL。 僅當(dāng)抗真菌劑對質(zhì)控菌的MIC值在標準值內(nèi)且菌株生長良好時，才能判定為實驗過程準確，實驗數(shù)據(jù)可靠。

2 結(jié) 果

2.1 他克莫司對常用抗真菌藥體外抗耐藥白念珠菌協(xié)同作用

在實驗的這一部分中，我們使用棋盤法觀察了他克莫司和5種常用的抗真菌藥(兩性霉素B、特比萘芬、咪康唑、伊曲康唑和酮康唑)聯(lián)合使用對3株白念珠菌株(Candidaalbicans103、Candidaalbicans100及Candidaalbicans115)的體外協(xié)同抑制作用。結(jié)果表明：他克莫司和所有5種候選抗真菌藥的組合在這3株測試菌株中顯示出不同程度的協(xié)同作用，尤以兩性霉素B和他克莫司的組合最為明顯，具體表現(xiàn)為兩種藥物組合后的FICI值最低(FICI為0.05至0.06)，并且菌株之間無顯著差異(見表1)；其次是咪康唑，兩者組合后的FICI值為0.09至0.13(見表2)；他克莫司-伊曲康唑組對3株被測耐藥菌的FICI值為0.25(見表3)；酮康唑—他克莫司組和特比萘芬—他克莫司組的體外抗耐藥真菌協(xié)同作用相對較弱：酮康唑—他克莫司組的FICI值在0.31到0.38間(見表4)，特比萘芬—他克莫司組的FICI值均為0.50(見表5)。相關(guān)實驗藥物同他克莫司聯(lián)合使用中均未發(fā)生拮抗作用。質(zhì)控菌株ATCC22019生長良好，對所有受試藥物的MIC值均在標準值內(nèi)，故可判定該實驗的檢測方法準確，結(jié)果可靠。

表1 他克莫司—兩性霉素B組抗耐藥白念珠菌作用

表2 他克莫司—咪康唑組抗耐藥白念珠菌作用

表3 他克莫司—伊曲康唑組抗耐藥白念珠菌作用

表4 他克莫司—酮康唑組抗耐藥白念珠菌作用

表5 他克莫司—特比萘芬組抗耐藥白念珠菌作用

3 討 論

近年來，各種因素導(dǎo)致抗真菌藥的大量使用甚至濫用，致使真菌耐藥率大幅增加。研發(fā)新的藥物需要高昂的成本，而藥物上市后的大量使用又進一步加劇了藥物耐藥的產(chǎn)生。因此，如果能夠在常見藥物中篩選一些對常用抗真菌藥具有協(xié)同作用的藥物，無疑是一種低成本且行之有效的方法。在前期研究中，我們觀察到大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑他克莫司(FK506)對氟康唑具有較好的體外抗真菌增效作用[1]，故在本階段的實驗中，我們繼續(xù)采用棋盤式微量液基稀釋法針對他克莫司同其他幾種常用抗真菌藥的體外協(xié)同作用做了進一步的探究和比較，嘗試篩選出協(xié)同作用相對顯著的藥物組合方案。研究結(jié)果顯示：在備選5種藥物組合中，他克莫司-兩性霉素B組合表現(xiàn)出了最佳的體外協(xié)同抗耐藥白念珠菌作用，這與Gao等[2]及Kubi?a等[3]對他克莫司和兩性霉素B聯(lián)合后對曲霉菌屬和赤霉菌屬真菌的體外協(xié)同增效作用的研究結(jié)果基本一致。在后兩者的研究中，他克莫司與兩性霉素B組合后對白念珠菌以外的其他菌屬菌株也表現(xiàn)出了顯著的體外協(xié)同增效作用，故此我們推測，兩性霉素B與他克莫司聯(lián)合后，或可明顯提高兩性霉素B對諸多真菌菌株，甚至是對耐藥菌株的抗真菌活性。此外，在我們的研究中，他克莫司分別同咪康唑、伊曲康唑及酮康唑聯(lián)合使用后對受試白念珠菌也表現(xiàn)了一定的體外協(xié)同作用，無一藥物組合表現(xiàn)拮抗作用。這一協(xié)同作用在Zhang等[4]對皮膚癬菌體外分離株的研究中也得到了體現(xiàn)。Zhang等的研究發(fā)現(xiàn)：他克莫司與伊曲康唑、特比萘芬及聯(lián)苯芐唑組合后分別對53%、53%及63%的受試皮膚癬菌體外分離株表現(xiàn)了的較強的體外協(xié)同作用。

如青霉素提取自青霉菌一般，他克莫司同樣是從鏈霉菌屬中分離而來。在哺乳動物中，他克莫司、結(jié)合蛋白FKBP12及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶可形成三元復(fù)合物，該復(fù)合物抑制活化T細胞的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶核因子(NFAT)通路，進而阻止T細胞增殖。臨床上，他克莫司的全身用藥常用于預(yù)防同種異體移植器官患者的排斥反應(yīng)，而局部使用則主要用于治療白癜風(fēng)、特應(yīng)性皮炎等自身免疫相關(guān)性皮膚病，近年來也逐漸開始用于激素依賴性皮炎及脂溢性皮炎的治療[5-6]。但作為免疫抑制劑的一種，他克莫司在臨床上一直被視為真菌性皮膚病治療的藥物禁忌。而近些年，已有研究顯示他克莫司可以局部用藥促進頑固性體癬的恢復(fù)，甚至有研究者嘗試將他克莫司與環(huán)孢菌素A等鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑作為抗真菌藥研發(fā)的新方向和靶點[7-8]。我們的研究結(jié)果也提示：他克莫司與多種傳統(tǒng)抗真菌藥，包括兩性霉素與唑類等都存在較好的體外協(xié)同抗耐藥白念珠菌作用。由于他克莫司系鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑的一種，而鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路又在多項研究中被證實與真菌細胞壁的完整性及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)等多種造成抗真菌藥物耐藥的因素有關(guān)，且作為與白念珠菌耐藥密切相關(guān)的基因之一，RTA2基因的表達上調(diào)也在體內(nèi)、外被證實與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路的充分激活有關(guān)[9-10]。故此，依據(jù)他克莫司和常用抗真菌藥的藥理學(xué)作用，不難解釋本次實驗中，他克莫司與兩性霉素B及其他常用抗真菌藥所表現(xiàn)出的或強或弱的體外協(xié)同抗耐藥菌株作用。鑒于他克莫司在實際應(yīng)用中具有明顯的免疫抑制作用，無法作為抗真菌藥物直接使用，也有學(xué)者嘗試使用一些細胞毒性和免疫抑制活性相對較低的他克莫司類似物，如31-O-脫甲基-FK506、9-脫氧-FK506等與抗真菌藥聯(lián)合使用，也觀察到了類似的協(xié)同增效作用[11]，故他克莫司及類似物與常用抗真菌藥組合使用，尤其是兩性霉素B，或可作為臨床上耐藥真菌病治療的可能方案之一。但不得不提的是，目前無論是針對他克莫司還是其類似物的抗真菌增效作用研究仍多局限于體外試驗，很少涉及動物實驗及臨床研究，故其在體內(nèi)抗真菌增效作用及使用安全性尚待進一步觀察。