于淑穎 周夢蘭 孫天舒 張麗 徐英春

(1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730；2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100730；3.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學科學研究中心，北京 100730；4.侵襲性真菌病機制研究與精準診斷北京市重點實驗室，北京 100730)

近年來，真菌感染已經(jīng)成為嚴重威脅全球健康的疾病，全球約有3億人遭受了侵襲性真菌感染，造成每年約有160萬人死亡，接近結核病的死亡人數(shù)[1]。尤其隨著免疫功能低下人群的不斷增加，侵襲性真菌感染導致的死亡率高達30%～90%[2]。念珠菌屬是真菌感染的主要致病菌，白念珠菌仍然是最常見的菌種，而非白念珠菌侵襲性感染所占的比例明顯升高[3-4]。目前，念珠菌對抗真菌藥物的耐藥問題面臨嚴峻的挑戰(zhàn)，光滑念珠菌對棘白菌素類藥物的高度耐藥性在美國和歐洲地區(qū)引起了廣泛關注[5]。近年來，我國熱帶念珠菌和光滑念珠菌對唑類藥物的耐藥率顯著升高，角膜念珠菌和解脂念珠菌等少見菌種也呈現(xiàn)出極高的氟康唑和伏立康唑耐藥率[3]。此外，新興的多重耐藥病原體—耳念珠菌對全球的公共衛(wèi)生構成了威脅[6]。

在這種情況下，亟需深入理解真菌病原體的生物學和病理生理學，并闡明耐藥機制。因此，對于高效基因操作工具的需求十分迫切，然而，對真菌的基因操作通常費時且麻煩，特別是在缺乏性周期的二倍體菌種中。此外，轉化和/或同源重組效率低，缺乏天然質粒、克隆載體，或者有限的篩選標記等也是阻礙該過程的重要原因[7]。規(guī)律間隔成簇短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和CRISPR 相關基因蛋白(CRISPR-associated protein， Cas9)系統(tǒng)的突破性發(fā)現(xiàn)徹底改變了基因編輯的現(xiàn)狀。原本，CRISPR-Cas9系統(tǒng)通過成熟的crRNA(CRISPR RNA)與反式激活crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)堿基配對形成雙鏈RNA，雙鏈RNA指導Cas9在目標基因中引入雙鏈斷裂，導致入侵核酸沉默，從而為細菌和古細菌提供針對病毒的適應性免疫[8]。隨后，陸續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，通過單向導RNA(single guide RNA，sg RNA)的巧妙設計，CRISPR-Cas9系統(tǒng)也逐漸應用于哺乳細胞、植物以及真菌等真核細胞的基因編輯研究[9-10]。

本文旨在對CRISPR-Cas9系統(tǒng)的工作原理和其在念珠菌中的應用進行系統(tǒng)的綜述，希望CRISPR的發(fā)展和應用能夠有助于微生物學家解決念珠菌的致病機理和耐藥機制等多方面問題，從而進一步促進新的治療策略的開發(fā)。

1 CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的工作原理

簡單來說，CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的兩大核心組分包括：用于產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double strand breaks,DSB)的Cas9蛋白和能夠將Cas9核酸內切酶引導至具有合適原型間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif, PAM)的染色體中任何基因座的sgRNA(small guide RNA)[11]。Cas9蛋白，是Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)的核酸內切酶，受sgRNA引導在PAM上游3 bp處引入了一個雙鏈斷裂[如釀膿鏈球菌 (Streptococcuspyogenes)的 Cas9蛋白識別的PAM 結構為三核苷酸NGG序列]。sgRNA同時具有靶向特異性和Cas9結合活性，在天然細菌系統(tǒng)中由crRNA 和tracrRNA組成。tracrRNA能夠與前體crRNA轉錄的重復序列互補配對緊密結合，隨后被RNA聚合酶Ⅲ識別并加工為成熟的crRNA: tracrRNAs復合體(即sgRNA，功能性雙鏈RNA二級結構)，直接引導Cas9核酶結合外源DNA并進行剪切破壞。因此，通過將包含靶向引導序列的crRNA與tracrRNA融合，構建sgRNA，然后結合Cas9蛋白便可致使目標基因發(fā)生雙鏈斷裂(見圖1)[7-8,12-13]。DSB可以通過兩種不同的方式修復：非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源定向修復(homology-directed repair，HDR)。NHEJ的修復方式容易出錯，通常會在DSB處隨機引入堿基的插入或者缺失，從而導致目標基因發(fā)生移碼突變或終止密碼子提前出現(xiàn)。如果存在具有同源性區(qū)域的供體DNA(donor DNA)作為模板，如二倍體基因組中的等位基因或者外源DNA，則可以通過HDR進行修復，以引入特定點突變或者插入所需序列[12,14]。而CRISPR系統(tǒng)介導的HDR中，具有DSB側翼同源性的外源修復模板可以精確地將突變引入基因組[15]。

圖1 細菌適應性免疫中CRISPR-Cas9介導的DNA干擾[13]

2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在念珠菌中的應用

2.1 白念珠菌

白念珠菌是真菌感染最主要的致病菌，因該菌種是雙倍體、生殖周期不完整、缺乏質粒系統(tǒng)以及使用非典型密碼子等原因，一直以來亟需便捷的分子遺傳工具用于深入探索白念珠菌的致病機制。

得益于具有交配能力的白念珠菌單倍體的發(fā)現(xiàn)，Shapiro等開發(fā)了一種基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的“基因驅動陣列”(gene drive array，GDA)，在白念珠菌中進行基因相互作用的分析。Shapiro等構建了能夠表達Cas9并具有一對sgRNA轉錄框的質粒，sgRNA轉錄框的兩側連接目標基因上下游的同源序列。sgRNA轉錄框引導Cas9在目標基因中引入雙鏈斷裂后，細胞利用該質粒進行HDR，從而用sgRNA轉錄框替換掉目標基因，進一步形成“驅動基因”。當帶有“驅動基因”的單倍體細胞與野生型單倍體細胞交配時，野生型細胞中的等位基因將會被Cas9剪切，并通過HDR的方式被替換為sgRNA轉錄框，二倍體純合雙基因敲除菌株就此產(chǎn)生。利用GDA平臺，研究人員構建了白念珠菌的雙敲除純合細胞文庫，并揭示了藥物耐藥性和生物膜形成相關的基因間相互作用[16]。

Vyas等[17]開發(fā)了經(jīng)過密碼子優(yōu)化后在念珠菌中穩(wěn)定表達的CAS9等位基因，首次實現(xiàn)了CRISPR-Cas9系統(tǒng)直接在白念珠菌基因編輯中的成功應用。他們構建了能夠表達CAS9和sgRNA的“solo system”和“duet system”兩種質粒系統(tǒng)。在“solo system”中整個線性化的質粒整合至ENO1位點，在“duet system”中表達CAS9和sgRNA的兩條線性化質粒分別整合至ENO1位點和RP10位點。CAS9的表達由整合位點的啟動子驅動，而RNA聚合酶Ⅲ啟動子CaSNR52啟動sgRNA的表達。質粒上構建有NAT基因，因此使用諾爾絲菌素進行轉化菌株的篩選。此外，通過提供帶有同源臂的供體DNA，以HDR的修復方式在ADE2基因中提前引入終止密碼子，從而破壞該基因。然而，CAS9基因在基因組中的穩(wěn)定整合可能會增加脫靶效應的發(fā)生[7]。

在此基礎上，Min等[18]開發(fā)的瞬時表達的CRISPR-Cas9系統(tǒng)解決了對脫靶問題的擔憂，無需將各元件穩(wěn)定整合至基因組，即可在白念珠菌中進行有效的基因刪除。隨后，Ng等[19]發(fā)現(xiàn)sgRNA的細胞內水平顯著限制了Cas9介導的DNA切割效率，因此，他們嘗試分析不同啟動子(SNR52、ADH1和tRNA)，以及不同的RNA轉錄后加工方案對CRISPR-Cas9系統(tǒng)編輯效率的影響。結果發(fā)現(xiàn)使用RNA聚合酶Ⅱ(ADH)啟動子驅動sgRNA的表達，并分別在sgRNA的5’端和3’端連接tRNA(轉運核糖核酸)和自我裂解型肝炎病毒(hepatitis delta virus，HDV)核酸酶，可以將CRISPR-Cas9系統(tǒng)在白念珠菌中的編輯效率提高10倍。

念珠菌的基因操作工程中可供選擇的篩選標記十分有限，如果能夠重復使用單個篩選標記進行連續(xù)基因編輯將會大有裨益。Huang等[20]巧妙地設計了一種標記回收的新方法—CRISPR-Cas9誘導的標記切除系統(tǒng)(CRISPR-Cas9-induced marker excision，CRIME)，該系統(tǒng)在用于刪除目標基因的選擇標記兩側設置重復序列，刪除目標基因后，CRISPR-Cas9系統(tǒng)再次在標記本身中誘導DSB，然后通過重復序列之間的重組實現(xiàn)標記切除。Huang等[20]利用CRIME系統(tǒng)成功構建了白念珠菌的多突變菌株，并認為該系統(tǒng)可以廣泛應用于多種微生物。然而，Nguyen等[21]認為：Huang等研究者構建的CRIME體系雖然能夠快速連續(xù)的刪除基因，但是仍需要使用兩個不同的篩選標記，并且涉及標記之間的相互替換，反而使得基因編輯過程更加復雜，無法做到真正的無標記化基因編輯。基于前期研究，Nguyen等人進一步優(yōu)化了CRISPR系統(tǒng)，使其能夠在不同白念珠菌遺傳背景下進行標記回收。LEUpOUT系統(tǒng)只能在具有LEU2/leu2Δ特性的菌株中進行基因編輯，而HIS-FLP系統(tǒng)可以用于任何菌株。這兩個系統(tǒng)都能夠將包含篩選標記、CAS9基因和sgRNA的基因座瞬時整合至LEU2或者HIS位點，完成目標基因的刪除后，分別通過重復序列的同源重組(LEUpOUT系統(tǒng))或者FLP重組酶的激活將基因座再切除下來。上述系統(tǒng)不需要進行分子克隆，不會在基因組中留下永久性標記，就可以高效、快速、精確的完成白念珠菌的基因編輯[7,21]。Vyas等[15]又探索出標記回收的新方法，他們設計的質粒上包含CAS9、sgRNA、NAT和FLP等序列，質粒整合至目標基因后，通過激活FLP重組酶將CRISPR-Cas9系統(tǒng)各元件移除，這種質粒設計允許標記回收，在基因組上僅會留下盡可能少的外源序列，可以在任何遺傳背景下進行高效的連續(xù)誘變。

通過對CRISPR-Cas9系統(tǒng)的不斷改進，該方法已經(jīng)廣泛應用于白念珠菌的單基因或雙基因刪除、基因標記以及開放閱讀框的重組等基因編輯的研究[22]。

2.2 非白念珠菌

CTG進化枝(CTG clade)中的菌種將CGU密碼子翻譯成絲氨酸而不是亮氨酸，主要包括白念珠菌、近平滑念珠菌復合體、熱帶念珠菌、葡萄牙念珠菌和耳念珠菌等，而光滑念珠菌不是CTG進化枝的成員。此外，不同的念珠菌依賴于不同的DNA修復機制，白念珠菌和近平滑念珠菌復合體大多數(shù)通過HDR的方式完成DNA修復，葡萄牙念珠菌主要依賴于NHEJ，而熱帶念珠菌和光滑念珠菌同時使用HDR和NHEJ兩種方式[7]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)陸續(xù)成功應用于各種非白念珠菌的研究中，為念珠菌基因功能和代謝調控等研究提供了高效、快速和簡便的方法。

Grahl等[23]發(fā)現(xiàn)在白念珠菌中有效工作的表達構建體不能在其他念珠菌中良好表達，為了規(guī)避這種菌種特異性表達的問題，他們構建了無需表達的CRISPR基因編輯系統(tǒng)，并成功應用于葡萄牙念珠菌、光滑念珠菌和耳念珠菌。不同于以往CAS9和sgRNA需在細胞內進行表達，Grahl等將Cas9蛋白和特異性的crRNA: tracrRNA雙鏈RNA在體外組裝為核糖核蛋白復合體(ribonucleoprotein complexes，RNP)，以NAT基因作為篩選標記，目標基因兩側0.5～1 kb的區(qū)域作為標記基因的同源臂。然后將RNP和含有篩選標記的DNA一同電轉化至上述3種菌的細胞內，通過同源重組的方式便可誘導目標基因的刪除。在這3個菌種中，該方法的轉化效率都很高，達到60%～70%。然而，該方法的缺點是不能進行標記回收。

此前，對于葡萄牙念珠菌，Norton等利用瞬時表達的CRISPR-Cas9系統(tǒng)進行基因刪除，使用葡萄牙念珠菌的特異性啟動子驅動CAS9和sgRNA在該菌種中的有效表達，篩選標記NAT基因兩側連接約1 kb的目標基因的同源臂誘導HDR，可成功應用于單倍體和雙倍體菌株的多個基因的刪除，編輯效率約為36%。而研究進一步發(fā)現(xiàn)，刪除NHEJ相關基因KU70和LIG4，該系統(tǒng)的基因編輯效率明顯升高至81%[24]。

光滑念珠菌作為非CTG進化枝的一員，相比于白念珠菌，它在系統(tǒng)發(fā)育上更接近釀酒酵母。在Grahl等人的研究前，Enkler等[25]就首次將依賴于質粒的CRISPR-Cas9系統(tǒng)應用在光滑念珠菌中，并成功產(chǎn)生功能性缺失的突變體。該研究利用三重營養(yǎng)缺陷ΔHTL菌株(his3，trp1和leu2)作為實驗菌株，并分別使用來自釀酒酵母的TEF1啟動子(pTEF1)和RNA聚合酶Ⅲ啟動子(pSNR52)，以及來自光滑念珠菌CYC1啟動子(pCYC1)和RNAH1啟動子(pRNAH1)驅動CAS9和sgRNA表達。研究結果顯示當使用pCYC1和pRNAH1啟動CAS9和sgRNA表達，光滑念珠菌通過NHEJ方式對ADE2基因進行破壞的效率高達100%。Vyas等構建的游離型質粒不僅成功應用于白念珠菌，也成功實現(xiàn)了原養(yǎng)型光滑念珠菌的基因編輯。在提供和不提供修復模板的情況下，都能夠將終止密碼子提前引入ADE2基因，完成基因敲除[15]。Maroc等開發(fā)的可誘導型CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有一項新優(yōu)勢，即可以將菌株的轉化步驟和基因的切割及修復過程分開。這個系統(tǒng)仍然依賴于包含sgRNA和CAS9的質粒系統(tǒng)，使用MET3啟動子控制CAS9的表達，可以通過NHEJ和HDR的方式在光滑念珠菌中進行基因編輯。因該系統(tǒng)中CAS9的表達是可誘導的，故可以利用該系統(tǒng)鑒定光滑念珠菌中的必需基因以及研究雙鏈斷裂后的修復機制。Maroc等[26]的研究也進一步證實了NHEJ是光滑念珠菌雙鏈斷裂后的主要修復方式。

近平滑念珠菌復合體包括近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、似平滑念珠菌(Candidametapsilosis)和擬平滑念珠菌(Candidaorthopsilosis)。2017年，Lombardi等應用于近平滑念珠菌的CRISPR-Cas9系統(tǒng)依賴于自主復制質粒，可通過修復模板的巧妙設計，進行基因編輯(引入終止密碼子或特定突變)、基因刪除或者添加特定標簽等操作，將修復模板與包含CAS9、sgRNA和NAT基因的質粒共同轉化，甚至可以實現(xiàn)僅有目標基因組被破壞、無需添加任何無關序列的 “無痕性”基因編輯。這個系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠在不同遺傳背景的近平滑念珠菌中進行基因編輯，Lombardi等利用該系統(tǒng)已經(jīng)成功完成了20株臨床菌株的基因編輯。在缺乏選擇性壓力的情況下質粒容易丟失，因此可以用于同一遺傳背景菌株的連續(xù)基因編輯[14]。Zoppo等[27]使用上述CRISPR-Cas9系統(tǒng)首次成功地在擬平滑念珠菌中進行基因編輯，證實CoALS4210基因在擬平滑念珠菌對人類頰上皮細胞的黏附中發(fā)揮重要作用，但是與侵襲性感染的發(fā)生關系不大。隨后，Lombardi等又進一步改良了該質粒，將sgRNA連接的錘頭型核酸酶(hammerhead ribozymes，HH)序列改為能夠直接被酵母菌核糖核酸酶Z裂解切割的tRNA，因此僅需要替換20nt的靶序列互補區(qū)即可靶向不同的目標基因，極大的簡化了克隆過程。Lombardi等已經(jīng)將此改良的CRISPR-Cas9系統(tǒng)pCP-tRNA成功地應用于近平滑、擬平滑和似平滑念珠菌的基因編輯[28]。

同時，Lombardi等構建了另外一個質粒pCT-tRNA用于熱帶念珠菌的基因編輯，除調控序列和自主復制序列不同外，pCT-tRNA質粒的結構與pCP-tRNA基本一致。其中，驅動CAS、NAT和sgRNA表達的調控元件分別是來自季也蒙畢赤酵母、都柏林念珠菌的和Ashbyagossypii；而自主復制序列ARS2來自白念珠菌，該系統(tǒng)高效的完成了ADE2基因的敲除[7,28]。Zhang等[11]通過依賴于質粒的整合型和瞬時表達型CRISPR-Cas9系統(tǒng)，快速、可靠地進行多基因敲除或突變，該系統(tǒng)還大大提高了體內多個DNA片段的組裝效率，并僅通過一個步驟即可將他們整合至目標基因座上。

綜上所述，本文提供了CRISPR-Cas9基因編輯技術在念珠菌中應用的最新進展，靈活、有效的CRISPR-Cas9系統(tǒng)對醫(yī)學真菌學領域產(chǎn)生了巨大的影響。在實驗室方面，通過促進基因操作技術的發(fā)展，為探究真菌生物學和致病機制、剖析毒力因子的作用、調查新的藥物潛在靶點以及研究宿主和病原體間的相互作用奠定了基礎；在臨床方面，進一步改善了真菌感染的診斷策略和抗真菌耐藥的監(jiān)測手段。此外，目前該系統(tǒng)在模式真菌中應用可以進一步推廣至其他致病真菌，從而研究宿主和真菌間的相互作用或者解決念珠菌耐藥等問題[7]。