張景 姜斌 彭娜 歐陽鵬文 徐文 寧興旺 劉瓊 謝良伊

[1.湖南省人民醫(yī)院(湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院)檢驗科，長沙 410005；2.湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心，長沙 410007]

侵襲性絲狀真菌是引起免疫功能不全或有基礎(chǔ)疾病的患者呼吸道感染和死亡的重要原因，且具有病情危重、發(fā)展迅速、臨床預(yù)后差以及病死率高等特點，應(yīng)引起高度重視[1]。傳統(tǒng)絲狀真菌鑒定方法主要依靠形態(tài)學(xué)的觀察，有時難以得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是近年來發(fā)展起來的一種非常重要的病原微生物鑒定的新方法[2]，除了有較高的準(zhǔn)確性外，其最大優(yōu)點是能在很短時間內(nèi)完成病原微生物的鑒定，具有操作簡便、鑒定迅速、準(zhǔn)確率高和成本低的特點，近年來開始用于細菌、酵母菌及絲狀真菌的鑒定，可替代常規(guī)鑒定方法，降低周轉(zhuǎn)時間[3-4]。

本文對從臨床患者分離了91株常見絲狀真菌，用MALDI-TOF MS和傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法同時進行鑒定，采用分子測序方法作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，驗證質(zhì)譜技術(shù)的鑒定結(jié)果，探討質(zhì)譜技術(shù)在絲狀真菌鑒定中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2017年4月—2019年7月本院各種類型臨床標(biāo)本中分離培養(yǎng)的65株絲狀真菌(已剔除同一患者多次送檢培養(yǎng)后所得同一種菌)，以及某三甲醫(yī)院惠贈的26株絲狀真菌，總共91株臨床常見的絲狀真菌。初步鑒定為絲狀真菌的菌株保存在菌種保存管里，將其置于-80℃冰箱冷凍保存。大腸埃希菌ATCC8739作為校準(zhǔn)和內(nèi)質(zhì)控菌株，ATCC16888黑曲霉及ATCC10106產(chǎn)黃青霉作為研究質(zhì)控菌株。

1.2 試劑與儀器

沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(含氯霉素)(Sabouraud gentamicin chloramph agar, SGC)、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(Columbia agar+5% sheep blood, COS)(法國梅里埃生物公司)；棉藍染色液(珠海貝索生物有限公司)；VITEK MS質(zhì)譜儀、VITEK MS-CHCA基質(zhì)液、質(zhì)譜儀樣品靶板(法國梅里埃生物公司)；甲酸、乙腈(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；引物合成及PCR產(chǎn)物序列測定均由上海英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.3 方法

傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定(生物安全柜中進行) 將菌庫中絲狀真菌在SGC平板上進行復(fù)蘇，用封口膜封口，置于28℃及35℃孵箱中培養(yǎng)1～5 d，至絲狀真菌長出后挑取單個菌落點種在SGC平板上，并置于28℃孵箱中培養(yǎng)1～5 d，取一清潔載玻片，在其上滴加棉藍染液1滴，然后用透明膠帶蘸取少許菌絲后貼于載玻片上，在顯微鏡下進行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察鑒定，包括其菌絲、孢子的形態(tài)及產(chǎn)孢方式等，同時結(jié)合菌落生長速度、形態(tài)、質(zhì)地和顏色等進行形態(tài)學(xué)鑒定。

分子生物學(xué)檢測 采用SGC平板上復(fù)蘇點種后的臨床菌株，利用磁珠研磨煮沸法提取其DNA，以ITS1-F/ITS2-R、β-微管蛋白(F/R)為引物，將提取的DNA進行PCR擴增，引物具體編碼為ITS1-F：TCCGTAGGTGAACCTGCGG、ITS2-R：TCCTCCGCTTATTGATATGC、β-微管蛋白-F：AATTGGTGCCGCTTTCTGG、β-微管蛋白-R：AGTTGTCGGGACGGAATAG。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并將電泳后產(chǎn)物進行核酸序列測定。測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)上進行基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)比對，確定絲狀真菌種類。

絲狀真菌質(zhì)譜鑒定 在生物安全柜中，分別挑選點種在SGC平板上，于28℃和35℃兩種溫度下孵育后生長的菌落進行兩種不同前處理。①質(zhì)譜儀推薦“甲酸乙腈法”提取絲狀真菌蛋白：利用一次性200 μLTip取直徑1～2 cm的菌落，將其懸浮于75%無水乙醇中，充分震蕩混勻；將混勻后的樣本高速離心2 min，盡量吸除上清液，保留沉淀，自然干燥；在沉淀中加入40 μL70%甲酸，渦旋5～8 s；再向其混合物中加入40 μL乙腈渦旋5～8 s；將按上述實驗所得混合物靜置5～10 min后高速離心2 min；立即在質(zhì)譜儀專用樣品靶板上加入1 μL離心后所得的上清液，待自然干燥后加1 μL基質(zhì)液覆蓋在樣品靶板上，室溫下干燥后上機檢測，判讀結(jié)果。② “磁珠研磨法”提取絲狀真菌蛋白：前面同“傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定”的前3步；向沉淀-甲酸混合物中加入等體積的0.1 mm磁珠進行充分研磨，并震蕩混勻；再向其所得混合物中加入40 μL乙腈渦旋5～8 s；將按上述實驗所得混合物靜置5～10 min后高速離心2 min；立即在質(zhì)譜儀專用樣品靶板上加入1 μL離心后所得的上清液，待自然風(fēng)干后加1 μL基質(zhì)液以覆蓋樣品靶板，室溫下干燥后上機檢測，判讀結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，率的比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定

91株絲狀真菌通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定后，與DNA測序結(jié)果相比，僅有74株能夠正確鑒定到種，91株能夠正確鑒定到屬。其中曲霉屬鑒定到種的正確率為87.1%(74/85)，青霉屬鑒定到種的正確率為0/4。

2.2 DNA測序

91株絲狀真菌DNA在2對引物下進行PCR擴增，將其產(chǎn)物進行電泳，其中ITS1-F/ITS2-R擴增產(chǎn)物條帶在500～700 bp，詳見圖1；而β-微管蛋白(F/R)擴增產(chǎn)物條帶為200～600 bp，詳見圖2。另外，將上述擴增產(chǎn)物送至公司測序，經(jīng)結(jié)果拼接比對后進行比對，確定菌種。

圖1 絲狀真菌基因組DNA引物為ITS1-F/ITS2-R時PCR擴增產(chǎn)物電泳圖 圖2 絲狀真菌基因組DNA引物為β-微管蛋白時PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.3 兩種溫度培養(yǎng)及兩種不同蛋白提取的前處理方法對常見絲狀真菌的鑒定結(jié)果比較

在該實驗中，探索28℃和35℃條件下培養(yǎng)的絲狀真菌在質(zhì)譜儀鑒定時的鑒定結(jié)果有無差別，將兩組樣本進行獨立樣本χ2檢驗，統(tǒng)計量χ2=0.225，P=0.813>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從實驗結(jié)果可知，兩個溫度下培養(yǎng)絲狀真菌的正確鑒定率無明顯差異，表明在應(yīng)用質(zhì)譜儀鑒定常見絲狀真菌時培養(yǎng)溫度不影響其鑒定結(jié)果，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 91株常見絲狀真菌在兩個溫度培養(yǎng)及不同蛋白提取方法質(zhì)譜鑒定結(jié)果比較

在質(zhì)譜儀鑒定絲狀真菌時，絲狀真菌菌體蛋白的提取方法不同，其鑒定準(zhǔn)確率也不同[5]。通過“磁珠研磨法”[6]與質(zhì)譜儀推薦“甲酸乙腈提取法”這兩種不同方法，提取絲狀真菌的蛋白，將兩組樣本進行獨立樣本χ2檢驗，統(tǒng)計量χ2=6.71，P=0.018<0.05，提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，從其絲狀真菌的正確鑒定率可知，“磁珠研磨法”提取蛋白后質(zhì)譜儀鑒定的正確率優(yōu)于質(zhì)譜儀推薦“甲酸乙腈提取法”，兩種不同蛋白質(zhì)提取方法的數(shù)據(jù)比較見表1。

2.4 形態(tài)學(xué)鑒定、質(zhì)譜儀鑒定與DNA測序鑒定結(jié)果的比較

與DNA測序結(jié)果相比，91株常見絲狀真菌通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定，其鑒定到種的正確率為81.3%(74/91)；通過梅里埃質(zhì)譜儀鑒定，絲狀真菌鑒定到種的正確率為97.8%(89/91)。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 形態(tài)學(xué)和MALDI-TOF MS和DNA測序鑒定結(jié)果的比較

3 討 論

MALDI-TOF MS是目前臨床微生物鑒定領(lǐng)域的一項新技術(shù)，具有成本低、耗時短、客觀、準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點，有強大的鑒定能力?，F(xiàn)階段，它不僅在細菌與酵母菌檢測上得到較高的應(yīng)用，在細菌的同源性分析、耐藥性上也有一定的研究，而且在血培養(yǎng)陽性率的檢測以及鑒定上也有很好的應(yīng)用前景。由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，侵襲性絲狀真菌需要在對菌落進行預(yù)處理，提取充足的蛋白質(zhì)后才能進行質(zhì)譜鑒定。本研究采用MALDI-TOF MS技術(shù)對分離自臨床的91株常見絲狀真菌分離株進行鑒定，并與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法和基因測序鑒定結(jié)果進行比對，評價MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床絲狀真菌鑒定中的應(yīng)用價值；并通過“質(zhì)譜儀推薦方法”與“磁珠研磨法”提取絲狀真菌蛋白進行比較，評價兩種方法在臨床工作的應(yīng)用價值；同時，探索MALDI-TOF MS在鑒定絲狀真菌時的菌株前處理的方法，以及培養(yǎng)條件與鑒定結(jié)果的相關(guān)性。

本研究數(shù)據(jù)顯示，使用質(zhì)譜儀鑒定絲狀真菌時，運用“磁珠研磨法”提取蛋白時，不管是28℃還是35℃時的鑒定結(jié)果，均無差異；而推薦方法“甲酸乙腈法”提取絲狀真菌時，其在28℃和35℃時的鑒定結(jié)果雖然稍有區(qū)別，但是28℃和35℃兩種溫度條件下培養(yǎng)的菌株鑒定正確率，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明在臨床常規(guī)工作中使用質(zhì)譜儀鑒定常見絲狀真菌時，培養(yǎng)溫度不會影響其鑒定結(jié)果。絲狀真菌細胞壁的厚度為100～200 nm，具有較強的細胞壁韌性和穩(wěn)定性，所以一般的破壁方式難以得到較好的蛋白質(zhì)圖譜[7]。然而，Vermeulen等[8]在使用MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定時，細胞裂解法得到的鑒定結(jié)果明顯優(yōu)于完整細胞法。在進行本研究時，不斷摸索提取絲狀真菌蛋白的方法，優(yōu)化實驗條件，總結(jié)使用質(zhì)譜儀推薦的“甲酸乙腈提取法”及改良的“磁珠研磨法”在提取絲狀真菌蛋白后，對絲狀真菌鑒定率的影響。

本研究中，質(zhì)譜儀推薦的“甲酸乙腈提取法”提取蛋白的操作相對簡單方便，但其對絲狀真菌質(zhì)譜鑒定的正確率為90.1%(82/91)，低于“磁珠研磨法”的97.8%(89/91)；而“磁珠研磨法”的操作雖較質(zhì)譜儀推薦的方法繁瑣，但實驗室也能常規(guī)開展，能夠充分研磨從而達到破壁效果，且提取真菌蛋白的效果較好，其正確鑒定率遠高于質(zhì)譜儀推薦“甲酸乙腈提取法”。Bille等[9]則將64株曲霉菌的孢子或菌絲與甲酸乙腈預(yù)先混合在靶板上，然后進行裂解，通過對“甲酸乙腈提取法”進行簡化后，其檢測準(zhǔn)確率可以達到86%。而Hettick等[10]對12株曲霉菌屬和5株不同的黃曲霉菌，利用磁珠破碎法進行破壁等預(yù)處理，得到的鑒定結(jié)果表明，該方法處理后的鑒定結(jié)果可以達到菌種水平的準(zhǔn)確鑒定。此外，對12株青霉菌分析表明，該法對青霉菌鑒定的準(zhǔn)確率可達100%[11]。Lau等[12]采用相同磁珠破碎法對該方法進行重復(fù)性實驗，結(jié)果表明，421株絲狀真菌正確鑒定到種和正確鑒定到屬的正確率分別達到370(88.9%)株和388(93.2%)株。本研究通過對91株臨床菌株分別進行“甲酸乙腈提取法”和“磁珠研磨法”的預(yù)處理，其研究結(jié)果驗證了兩種方法在提取蛋白質(zhì)的不同，并且證實了“磁珠研磨法”鑒定絲狀真菌優(yōu)于常規(guī)推薦的方法?？芍谂R床工作中，我們可以通過不斷的摸索和探究找到既方便又高效的方法應(yīng)用于臨床，提高臨床工作的效率。

在該研究中，通過MALDI-TOF MS質(zhì)譜技術(shù)對91株常見菌株進行鑒定，并與DNA測序的結(jié)果進行了比較，其中有97.8%(89/91)的絲狀真菌菌株能夠正確鑒定出來，其中曲霉屬和青霉屬鑒定到種的正確率均為100%；而傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法僅有74株能夠正確鑒定到種，91株能夠正確鑒定到屬。該結(jié)果與Becker等[13]的研究結(jié)果相同，表明MALDI-TOF MS技術(shù)在對常見絲狀真菌的鑒定上有較高的應(yīng)用價值。并且質(zhì)譜技術(shù)對曲霉菌的正確鑒定率為100%(85/85)。有研究學(xué)者利用MALDI-TOF MS技術(shù)檢測44株曲霉屬，成功鑒定36株[14]。如果僅計算數(shù)據(jù)庫中包含的菌株，則可以準(zhǔn)確鑒定100%(144/144)曲霉屬，而曲霉屬93.6%(133/144)能夠準(zhǔn)確鑒定到種[15]。本研究結(jié)果驗證了這一結(jié)論。而對于2株鐮刀菌來說，其鑒定的正確率為0。上述結(jié)論的原因可能有：①本研究中此類菌種菌株的樣本少，無法在大數(shù)據(jù)庫中得出準(zhǔn)確的結(jié)果。②部分少見絲狀真菌在DNA測序中僅能鑒定到屬，無法確定其菌種。③該質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)庫中缺乏此類菌種的指紋圖譜，難以得到較準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。本研究中黃曲霉和米曲霉難以通過DNA測序區(qū)分開，可能與兩者間高度的同源性有關(guān)。且黃曲霉和米曲霉通過質(zhì)譜技術(shù)也難以鑒別，可能是產(chǎn)生了某種色素干擾鑒定結(jié)果，盡管可以得到蛋白質(zhì)圖譜，但是造成在蛋白質(zhì)圖譜中某些臨床菌株中缺乏特定峰值或峰數(shù)不足，即使與數(shù)據(jù)庫進行比對，卻無法獲得準(zhǔn)確鑒定結(jié)果[5]。

綜上所述，雖然本研究中實驗菌株數(shù)量及菌種種類較少，但是仍在一定程度上證實了MALDI-TOF MS技術(shù)的優(yōu)越性，說明其在臨床絲狀真菌鑒定中的應(yīng)用前景廣泛，具有快速、簡單、成本低及對實驗人員技術(shù)要求較低等優(yōu)點。隨著蛋白提取方法的不斷改善和絲狀真菌的數(shù)據(jù)庫的不斷完善，MALDI-TOF MS技術(shù)將為臨床早期診斷和及時用藥提供快速、有力的證據(jù)。