吳小霞，趙 莉，王冰潔，班萬里，穆尼拉·特列吾汗，馬長麗，烏云花，布于其其格，陳云英，段蘭利，岳 城，徐 晶，艾沙江，張壯志*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000; 2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆烏魯木齊 830011; 3.新疆塔城地區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，新疆塔城 834300; 4.新疆博爾塔拉蒙古自治州博樂市畜牧獸醫(yī)站，新疆博樂 833400; 5.新疆博爾塔拉蒙古自治州溫泉縣畜牧獸醫(yī)站，新疆博州 833000)

泡型棘球蚴病(alveolar echinococcosis，AE)是由多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis，Em)的幼蟲階段引起的嚴(yán)重威脅生命的人獸共患疾病[1-3]，造成了嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)問題。人體感染主要原發(fā)于肝臟(病變呈腫瘤樣生長)，潛伏期長，致死率高，又被稱為“蟲癌”[4]。在我國主要流行于北部、西北部和西南部的農(nóng)牧區(qū)以及高寒地區(qū)或凍土地帶[5-7]，其中又以四川、青海、西藏、甘肅等省(區(qū))最為嚴(yán)重[8]。因此，免疫預(yù)防手段切斷病原循環(huán)成為控制該病研究的方向[9]。

本試驗(yàn)探索了Em蟲體抗原雙抗體夾心ELISA免疫檢測技術(shù)的拓展應(yīng)用，其能夠快速、安全、明確地檢測感染區(qū)食肉動(dòng)物Em感染情況，為泡型包蟲病的預(yù)警預(yù)報(bào)等流行病學(xué)調(diào)查提供數(shù)據(jù)。本試驗(yàn)的技術(shù)和取得的相關(guān)數(shù)據(jù)可為以后獲得Em蟲體感染糞抗原雙抗夾心ELISA檢測試劑盒提供候選抗體，也為今后開展相關(guān)免疫檢測學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 Em感染試驗(yàn)比格犬來源 試驗(yàn)用犬購自常州貝樂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司，7月齡～8月齡，體重8 kg～9.5 kg；使用丙硫咪唑和吡喹酮驅(qū)蟲1周后，每只犬經(jīng)口人工感染Em原頭蚴，共感染5只犬，設(shè)陰性對照犬1只。Em原頭蚴由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所國家動(dòng)物包蟲病參考實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)兔 健康成年的雄性新西蘭大白兔，體重2 kg，購自新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 雜交瘤細(xì)胞株5E10H5 多房棘球絳蟲成蟲可溶性抗原免疫Balb/c鼠制備的雜交瘤細(xì)胞株，由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所國家動(dòng)物包蟲病參考實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4 主要試劑與儀器 BCA蛋白含量分析試劑盒，美國Thermo公司產(chǎn)品；弗式完全佐劑(CFA)、弗式不完全佐劑(IFA)，美國Sigma公司產(chǎn)品；R2驢抗兔二抗(HRP)IgG抗體，美國HyClone公司產(chǎn)品；大型離心機(jī)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；Infinite F50型全波長酶標(biāo)儀，眾志翔有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Em蟲體可溶性抗原制備及蛋白濃度測定 將上述1.1.1中收集的Em蟲體用無菌的PBS緩沖液沖洗數(shù)遍，加入等體積的Triton X-100超聲破碎，3 500 r/min離心10 min，收集上清液(Em蟲體可溶性抗原)，經(jīng)BCA蛋白含量分析試劑盒進(jìn)行抗原含量測定，分裝后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高效價(jià)抗體制備、測定、動(dòng)態(tài)監(jiān)測及高效價(jià)血清收集 首免取CFA將1.2.1中獲得的Em蟲體可溶性抗原制成免疫物，即200 μg Em蟲體可溶性抗原混懸液加等體積CFA混合，充分乳化后0.2 mL/只頸背部皮下多點(diǎn)注射接種新西蘭大白兔；每間隔14 d后進(jìn)行二免和三免，取IFA 200 μg將Em蟲體可溶性抗原制成免疫物，同首免接種免疫。首免開始，每周定期收集血清。按照間接ELISA方法檢測多克隆抗體效價(jià)；多抗血清按1∶200稀釋進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測。結(jié)果判定：當(dāng)P/N≥2，即按梯度稀釋后多克隆抗體血清效價(jià)與0周陰性對照血清OD450 nm值的比值在2倍以上。依據(jù)高免血清效價(jià)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測結(jié)果，對高免兔仍需進(jìn)行加免(IFA)，收集高效價(jià)血清，置-20℃保存，備用。

1.2.3 Em犬糞樣品的收集與處理 根據(jù)1.1.1所述自Em原頭蚴感染起每天定期采集糞樣。感染25 d后安樂處死，根據(jù)常規(guī)方法剖檢后收集腸內(nèi)容物，1×PBS洗滌并獲得蟲體和糞抗原于-70℃冷凍保存。共獲得Em感染犬糞154份，陰性對照犬糞25份。每份糞樣必須清楚標(biāo)記犬號、采集日期置-70℃凍存1周。隨后稱取1 g～2 g糞便與4 mL離心管中，加入1×PBST 2 mL～4 mL充分混勻，置4℃冰箱沉淀過夜。第2天以3 500 r/min離心10 min，吸取上清至新的離心管中，上清即糞抗原。

1.2.4 雙抗體夾心ELISA方法的建立 依據(jù)雙抗體夾心ELISA原理，利用棋盤法開展包被抗體，對多克隆抗體、單克隆抗體以及二抗工作濃度進(jìn)行測定，確定其工作濃度，參照犬科動(dòng)物感染細(xì)粒棘球絳蟲糞抗原的抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測技術(shù)國家標(biāo)準(zhǔn)[10]，建立以多房棘球絳蟲蟲體抗原單克隆抗體為包被抗體、高效價(jià)血清作為檢測抗體的糞抗原雙抗夾心ELISA方法。將單克隆抗體(5E10H5腹水)通過包被液按照優(yōu)化稀釋度稀釋，0.1 mL/孔包板，4℃冰箱過夜。PBST洗3次，3 min/次；加入50 g/L脫脂奶粉0.2 mL/孔，置于37℃溫箱60 min，PBST洗3次，3 min/次；檢測不同濃度的多房棘球絳蟲蟲體蛋白(EmsfAg)與Em犬糞樣，并設(shè)置陰性對照和空白對照，0.1 mL/孔，37℃溫箱孵育1 h，PBST洗3次，3 min/次；用工作濃度為1∶5 000的多克隆抗體與工作濃度為1∶5 000的驢抗兔反應(yīng)。多克隆抗體0.1 mL/孔，置于37℃溫箱孵育1 h，PBST洗3次，3 min/次；二抗驢抗兔，37℃溫箱孵育1 h，PBST洗7次，3 min/次；加入TMB 0.1 mL/孔，遮光顯色10～15 min，加入終止液，50 μL/孔，通過酶標(biāo)儀測值作對比分析。建立方法見表1。結(jié)果判定：以陽性/陰性(P/N≥2)即抗體梯度與陰性對照OD450 nm值相比在2倍以上。

表1 雙抗體夾心ELISA方法建立

1.2.5 雙抗體夾心ELISA靈敏度檢測 用1.2.4建立的糞抗原雙抗夾心ELISA方法檢驗(yàn)糞樣，測試出蛋白和糞樣的最低檢測值。靈敏度檢測加樣示意見表2。

表2 靈敏度檢測加樣示意

1.2.6 Em感染犬糞抗原動(dòng)態(tài)檢測 對1.2.3中采集的154份感染Em犬糞樣和25份陰性犬糞樣，用1.2.4建立的雙抗體夾心ELISA方法對感染犬的糞抗原動(dòng)態(tài)進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 Em成蟲可溶性抗原的含量

結(jié)果見圖1。經(jīng)BCA法測定得出Em成蟲提取物可溶性抗原含量為8.7 mg/mL。

圖1 BCA抗原含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 多克隆抗體效價(jià)測定及動(dòng)態(tài)監(jiān)測結(jié)果

三免后按照間接ELISA方法檢測實(shí)驗(yàn)兔血清中的抗體效價(jià)。如表3結(jié)果顯示，抗體效價(jià)為1∶320 000。圖2動(dòng)態(tài)監(jiān)測結(jié)果表明，第3次免疫后多克隆抗體血清效價(jià)逐漸上升，且補(bǔ)免后動(dòng)態(tài)監(jiān)測圖顯示依然呈平穩(wěn)趨勢?？沙掷m(xù)采集高效價(jià)血清(1∶320 000)用于雙抗體夾心ELISA方法以及靈敏度檢測。

表3 兔多克隆抗體效價(jià)測定

圖2 兔多克隆抗體血清效價(jià)動(dòng)態(tài)趨勢

2.3 雙抗體夾心ELISA方法建立

表4結(jié)果表明，最終建立以濃度為2 μg/mL 5E10H5腹水包板，Em蟲體多抗血清工作濃度為1∶5 000與二抗驢抗兔工作濃度為1∶5 000的反應(yīng)作為糞抗原檢驗(yàn)方法。

表4 雙抗體夾心ELISA方法檢測結(jié)果

2.4 靈敏度檢測結(jié)果分析及效果評價(jià)

通過對3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品倍比稀釋，全部OD450 nm值均 ≥ 0.9，如表5表和6結(jié)果表明，陽性糞抗原最終稀釋至1∶10 000倍時(shí)仍顯示為陽性。

表5 靈敏度檢測結(jié)果

2.5 感染犬動(dòng)態(tài)檢測結(jié)果分析

檢測結(jié)果見圖3。感染犬最早72 h后，最遲6 d后可檢測出多房棘球絳蟲糞抗原。C犬和2#犬的監(jiān)測趨勢走向相一致，而A犬前5 d糞抗原相對較低，整體而言，人工感染5只犬其7 d后雖有幅度，但通過與陰性對照犬D犬相比，均呈陽性。檢出的陽性犬糞樣OD值/陰性犬糞樣OD值均≥2.0(P/N)。

表6 靈敏度檢測效果評價(jià)

D犬為陰性對照犬；2#、3#、A犬、B犬、C犬均為人工感染Em犬

3 討論

當(dāng)前，AE早期診斷仍然面臨著艱巨的挑戰(zhàn)。針對人體的感染，以手術(shù)治療為主，但是經(jīng)常伴有術(shù)后復(fù)發(fā)和繼發(fā)感染[11]。針對動(dòng)物以往使用剖檢法[12]檢測犬棘球絳蟲，發(fā)現(xiàn)該蟲卵形態(tài)與其他絳蟲蟲卵形態(tài)相似，很難區(qū)分，結(jié)果容易出現(xiàn)誤差；現(xiàn)普遍采用剖檢法，對家畜出欄屠宰后進(jìn)行棘球蚴感染的流行病學(xué)調(diào)查，對可疑病灶或包囊、一種宿主可感染多種棘球蚴等有時(shí)無法鑒定[13]；氫溴酸檳榔堿下瀉法反應(yīng)率低、錯(cuò)檢或漏檢率高且容易造成環(huán)境污染等問題。截止2016年8月，全球報(bào)道的AE患者占棘球蚴病的5.78%，而我國2012年-2016年報(bào)道的占棘球蚴病的19.64%[14-15]。與此同時(shí)，制定有效的能夠快速、準(zhǔn)確、高效檢測多房棘球絳蟲糞抗原檢測方法就變得非常重要。張壯志等[10,12]報(bào)道利用重組抗原制備了兔多抗，建立的雙抗夾心ELISA方法特異性為95.7%。本次試驗(yàn)制備的兔多克隆抗體經(jīng)過3免后定期加強(qiáng)，效價(jià)達(dá)1∶320 000以上，隔周采集血清，通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測OD值均達(dá)2以上。

本研究建立的定量檢測方法具有良好的特異性、準(zhǔn)確性、和靈敏度。近年來，夾心ELISA法已廣泛應(yīng)用于腸道寄生蟲病的診斷，且不會對犬造成任何損傷。根據(jù)有關(guān)資料顯示，糞抗原檢測法敏感性高，是鏡檢的2.6倍，在檢測時(shí)，使用該方法更為安全、快捷，彌補(bǔ)了監(jiān)測空白性，即能夠解決實(shí)踐問題，在流行病學(xué)調(diào)查方面值得應(yīng)用推廣。在雙抗體夾心ELISA法的建立中2 μg/mL或5 μg/mL單抗包板表現(xiàn)的效果相近，為了節(jié)省材料選擇2 μg/mL，經(jīng)過多克隆抗體效價(jià)測定、動(dòng)態(tài)監(jiān)測及對靈敏度的檢測，確定多克隆抗體與二抗工作濃度一致。在靈敏度方面，陽性糞樣(P3)在依次稀釋中前三比值低于1∶1 000，出現(xiàn)跳值可能操作不當(dāng)，但總體來說3個(gè)陽性樣品稀釋至1∶10 000倍時(shí)OD值均在0.9以上，仍然為陽性。結(jié)果顯示，犬感染Em最早72 h后，最遲6 d后的犬糞樣中可檢測到多房棘球絳蟲糞抗原，本試驗(yàn)Em感染5只犬中其中B犬和3#犬是最早檢測出的，由于感染犬的數(shù)量不均一性和糞樣樣品少的原因，得到的動(dòng)態(tài)檢測圖曲折變化較大，說明獲得的糞樣樣品可能為假陰性。因此建立Em糞抗原雙抗夾心ELISA檢測方法后期還需要開展大量工作。

國外曾報(bào)道采用血清診斷法檢測犬只棘球絳蟲的感染，此方法不僅敏感性變異較大，而且和其他帶科絳蟲有交叉反應(yīng)，區(qū)別不了現(xiàn)癥和既往史感染，其應(yīng)用受到限制[16]。本研究建立的方法，糞抗原雙抗夾心ELISA法提高了反應(yīng)靈敏度，糞抗原可稀釋至1∶10 000，只針對于抗原稀釋倍數(shù)來說此方法敏感性較高。表明該方法在犬多房棘球絳蟲感染中具有早期診斷的功能。本試驗(yàn)通過Em蟲體可溶性抗原免疫Balb/c小鼠制備的雜交瘤細(xì)胞株腹腔接種小鼠獲得單抗腹水(5E10H5)以及該抗原免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體，用驢抗兔二抗，檢測收集的Em感染犬糞和陰性對照犬犬糞，用雙抗夾心ELISA檢測方法評估Em蟲體可溶性抗原能夠作為多房棘球蚴病的診斷抗原候選[17]，本試驗(yàn)建立的方法，糞抗原可稀釋至1∶10000，表明本方法具有良好的靈敏度與特異性。這種雙抗體夾心檢測方法為后期各個(gè)地區(qū)做流調(diào)提供技術(shù)支持以及為后期研制Em糞抗原雙抗夾心ELISA檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。