鄭佳琳，饒子亮，黃小紅，武 昕，黃小瓊，許惠英，鄺少松

（廣東省醫(yī)學實驗動物中心，廣東佛山 528248）

目前，急性肝損傷在諸多急性臨床病例中屢見不鮮，且呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢，嚴重威脅著人類的健康。柴胡疏肝丸主要用于治療肝氣郁滯證，而骨髓間充質(zhì)干細胞療法在肝臟疾病治療領(lǐng)域中占據(jù)了非常重要的位置。因此，本課題研究急性肝損傷藥物四氯化碳（CCl4）誘導大鼠急性肝損傷模型，以MSCs 聯(lián)合柴胡疏肝丸對急性肝損傷進行治療，觀察是否具有改善大鼠肝功能的作用，初步探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

SPF級SD大鼠，雄性，100只，體重200～250 g，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心[SCXK（粵）2018-0002]。動物飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學實驗動物中心SPF級動物房[SYXK（粵）2018-0002]。動物飼養(yǎng)條件：5 只/箱，群養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度與濕度：20℃～26℃，40%～70%，采用10 h:14 h 晝夜間斷照明；飼養(yǎng)室條件始終保持穩(wěn)定，以保證試驗結(jié)果的可靠性。自由進食飲水，飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

柴胡舒肝丸、四氯化碳（CCl4）、EA3001 系列電子天平、7020 型全自動生化分析儀。

1.3 細胞培養(yǎng)

體外大量培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，選擇處于對數(shù)生長期及狀態(tài)良好的細胞進行給藥治療。

1.4 動物造模

將檢疫合格的100 只SPF 級雄性SD 大鼠按照體重隨機分為空白對照組、模型對照組、柴胡疏肝丸組、MSCs 組、聯(lián)合用藥組，每組20 只。除空白對照組外，其余大鼠以 2 mL/kg 劑量腹腔注射CCl4溶液（CCl4按1:1 比例與橄欖油混合配制成CCl4溶液）1 次，誘導大鼠產(chǎn)生急性肝損傷。

1.5 動物給藥

造模后次日，MSCs 和聯(lián)合用藥組大鼠一次性尾靜脈注射1.0×107個/ml 的MSCs；柴胡疏肝丸組和聯(lián)合用藥組大鼠灌胃給予70 g/kg 柴胡疏肝丸，空白對照組和模型對照組灌胃給予等量純凈水，每天1 次，連續(xù)給藥7 d。

1.6 肝功能檢測

開始治療后的第1 天、第2 天、第3 天和第7 天，各組隨機選取5 只大鼠，稱重，CO2處死，采血分離血清，全自動生化分析儀測定肝功能指標，即谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）；收集肝臟組織并稱重，計算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝濕重/體重×100%。

1.7 統(tǒng)計方法

實驗所得數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計，結(jié)果用（±s）表示，各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，同時進行單因素方差分析，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 治療后大鼠肝指數(shù)變化

結(jié)果顯示，對模型對照組大鼠注射CCl4后，模型對照組大鼠肝指數(shù)顯著高于空白對照組（P＜0.05），說明造模成功。柴胡疏肝丸組、MSCs組和聯(lián)合用藥組大鼠肝指數(shù)在4 個時間點上均低于模型對照組。聯(lián)合用藥組大鼠肝指數(shù)顯著低于模型對照組（P ＜0.05）。聯(lián)合用藥組肝指數(shù)與柴胡疏肝丸組、MSCs 組比較均有所降低，說明MSCs、柴胡疏肝丸對肝臟重量指數(shù)均起到緩解作用；聯(lián)合治療效果優(yōu)于MSCs 和柴胡疏肝丸單獨治療的效果。隨著時間的延長，各組肝指數(shù)都有所回落（表1）。

表1 治療后的大鼠肝指數(shù)結(jié)果（±s，%，n=5，♂）

表1 治療后的大鼠肝指數(shù)結(jié)果（±s，%，n=5，♂）

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05；與模型對照組比較，△P ＜0.05。

組別d1d2d3d7空白對照組3.87±0.233.94±0.16 3.87±0.213.88±0.12模型對照組5.53±0.26*5.41±0.14*5.34±0.21*4.47±0.25*柴胡疏肝丸組5.49±0.28* 5.18±0.26*5.01±0.31* 4.04±0.25△MSCs組5.38±0.21*5.10±0.23*△ 5.07±0.24*3.97±0.22△聯(lián)合用藥組5.21±0.13*△4.74±0.17*△4.52±0.27*△3.92±0.12△

2.2 治療后大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）濃度變化

結(jié)果顯示，在4 個時間點，模型對照組 ALT濃度明顯高于空白對照組（P ＜0.05），柴胡疏肝丸組、MSCs 組和聯(lián)合用藥組 ALT 濃度明顯低于模型對照組（P ＜0.05）。在 d7 時，聯(lián)合用藥組ALT 濃度與空白對照組基本持平，差異不顯著（P＞0.05），肝功能恢復較好（表2）。

表2 治療后的大鼠肝ALT 結(jié)果（±s，U/L，n=5，♂）

表2 治療后的大鼠肝ALT 結(jié)果（±s，U/L，n=5，♂）

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05；與模型對照組比較，△P ＜0.05。

組別d1d2d3d7空白對照組27±529±2 28±528±5模型對照組377±16*253±13*68±7*57±6*柴胡疏肝丸組352±10*△216±9*△46±6*△39±4*△MSCs組333±15*△195±14*△ 50±9*△38±7*△聯(lián)合用藥組252±16*△161±11*△45±8*△32±5△

2.3 治療后大鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）濃度變化

結(jié)果顯示，在4 個時間點，模型對照組 AST濃度明顯高于空白對照組（P ＜0.05）；除了d1柴胡疏肝丸組與模型對照組相比差異不顯著（P＞0.05），其余時間點，柴胡疏肝丸組、MSCs 組和聯(lián)合用藥組 AST 濃度明顯低于模型對照組（P＜0.05）。在d7 時，聯(lián)合用藥組AST 濃度與空白對照組基本持平，差異不顯著（P ＞0.05），肝功能恢復較好（表3）。

表3 治療后大鼠肝AST 結(jié)果（±s，U/L，n=5，♂）

表3 治療后大鼠肝AST 結(jié)果（±s，U/L，n=5，♂）

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05；與模型對照組比較，△P ＜0.05。

組別d1d2d3d7空白對照組120±12125±10 123±16122±13模型對照組297±11*232±21*204±18*180±13*柴胡疏肝丸組286±10* 211±7*△179±12*△161±11*△MSCs組244±19*△195±14*△ 172±15*△157±15*△聯(lián)合用藥組194±12*△146±14*△144±9*△136±14△

3 討論

MSCs 是存在于骨髓中具有自我增值和自我更新能力的一種成體干細胞，具有高增殖和多向分化潛能，易于采集、分離純化和體外擴增，是肝細胞重要的肝外來源[1]。在細胞治療、基因治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來證實，MSCs 對急性肝損傷的修復作用，已經(jīng)得到了干細胞領(lǐng)域和肝病學領(lǐng)域的公認[2]。

急性肝損傷是多因素參與的一個復雜病理過程，病變過程中多種酶、自由基以及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)均發(fā)生著較大的變化，其中氧自由基對肝細胞DNA 結(jié)構(gòu)及其他代謝過程有較大的影響，從而成為了急性肝損傷的重要致病因素[3]。

柴胡疏肝丸中的柴胡能疏肝氣、養(yǎng)肝陰，具有抗脂質(zhì)過氧化作用，對保護肝細胞和恢復肝臟某些功能有一定的作用，白芍養(yǎng)肝柔肝，對氧自由基有清除作用[4]。這一生物學特性，使柴胡疏肝丸具有了緩解急性肝損傷病程，抑制肝損傷程度，從而具有了治療急性肝損傷的應(yīng)用潛能。

綜上所述，MSCs 聯(lián)合柴胡疏肝丸對大鼠急性肝損傷進行治療，在修復肝臟組織和抑制損害程度方面實現(xiàn)對受損肝臟組織的修復和治療，呈現(xiàn)更加顯著的治療效果。