張曉玲，嚴(yán) 謹(jǐn)，張 群△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)院研究中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014；2.兒童感染免疫重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014;3.重慶市渝北區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物科，重慶 401120)

大腸埃希菌為正常寄居在人及多種動(dòng)物腸道中的寄居菌，新生兒及新生動(dòng)物一般在出生后幾小時(shí)，便會(huì)有大腸埃希菌進(jìn)入消化系統(tǒng)，寄居于消化道后段并大量繁殖，成為消化系統(tǒng)正常菌群的組成部分，伴隨終生。傳統(tǒng)的生化反應(yīng)檢測，包括硫化氫檢測，是鑒定大腸埃希菌的常見方法。但越來越多的報(bào)道發(fā)現(xiàn)產(chǎn)硫化氫大腸埃希菌的存在[1-3]，因此在臨床工作中僅依靠生化反應(yīng)對產(chǎn)硫化氫大腸埃希菌進(jìn)行鑒定，可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的鑒定結(jié)果。且多篇報(bào)道顯示，產(chǎn)硫化氫的大腸埃希菌均為致瀉性大腸埃希菌，如腸致病性大腸埃希菌[4]、產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌的鑒定[5]。因此，正確鑒定產(chǎn)硫化氫大腸埃希菌對腹瀉病原菌的尋找至關(guān)重要。本文歸納總結(jié)了從1例腹瀉患兒大便中分離出的產(chǎn)硫化氫大腸埃希菌的鑒定方法。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 菌株來源于1例3月齡腹瀉患兒大便標(biāo)本，患兒臨床表現(xiàn)為腹瀉，大便不成形、偏稀、黃色。臨床初步診斷為急性腸胃炎，大便常規(guī)可見白細(xì)胞(++)、潛血(+)、還原糖(++)。

1.1.2儀器、培養(yǎng)基與試劑

1.1.2.1儀器 法國梅里埃Vitek 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)、質(zhì)譜(MS)儀器。

1.1.2.2培養(yǎng)基 哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司，規(guī)格：直徑90 mm×5塊，豫械注準(zhǔn)：20172400631)、XLD平板(上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司，規(guī)格：直徑90 mm×10塊，滬械注準(zhǔn)：20172400184)、中國藍(lán)平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司，規(guī)格：直徑90 mm×5塊，豫械注準(zhǔn)：20172400765)、沙門氏菌增菌液(上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司，規(guī)格：90 mL/支×40支，滬虹械備：20160013)、SS瓊脂平板(鄭州安圖生物工程股份有限公司，規(guī)格：直徑90 mm×5塊，豫械注準(zhǔn)：20172400766)。

1.1.2.3試劑 沙門氏菌/志賀氏菌雙通道核酸檢測試劑(48反應(yīng)/盒)由廣州達(dá)安基因生物科技有限公司生產(chǎn)；五種致瀉大腸桿菌核酸檢測預(yù)分裝試劑(熒光PCR法，24T/盒)由深圳生科原生物股份有限公司生產(chǎn)；克氏雙糖鐵培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.1.2.4診斷血清 沙門氏菌診斷血清O多價(jià)(A-F)(寧波天潤生物藥業(yè)有限公司，規(guī)格：1 mL/瓶×60瓶，國械注準(zhǔn)：20173404479)、志賀氏菌診斷血清22種(寧波天潤生物藥業(yè)有限公司，規(guī)格：1 mL/瓶×26瓶，國械注準(zhǔn)：20173404480)、腸道致病性大腸埃希菌診斷血清15種(寧波天潤生物藥業(yè)有限公司，規(guī)格：1 mL/瓶×18瓶，國械注準(zhǔn)：20173404335)；侵襲性大腸埃希氏菌診斷血清11種、產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌診斷血清10種(均購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司)。上述血清用已知陽性菌株鑒定合格，且在有效期內(nèi)，血清凝集試驗(yàn)按照操作說明進(jìn)行。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大便培養(yǎng) 分別將大便標(biāo)本，置于哥倫比亞血瓊脂平板、XLD平板、中國藍(lán)平板、沙門氏菌增菌液培養(yǎng)基中，37 ℃中培育18～24 h，挑取沙門氏菌增菌液適量，劃線接種SS瓊脂，37 ℃中培育18～24 h后作分純培養(yǎng)。

1.2.2生化鑒定

1.2.2.1雙糖鐵轉(zhuǎn)種試驗(yàn) 試驗(yàn)前須首先進(jìn)行菌株質(zhì)控，大腸埃希菌ATCC25922，雙糖鐵瓊脂上、下層均為黃色，福氏志賀菌CMCC51573，雙糖鐵瓊脂上層不變色，下層為黃色。具體操作步驟為：挑取純菌落接種與雙糖鐵瓊脂上，37 ℃中培育18～24 h。

1.2.2.2使用Vitek 2 Compact進(jìn)行微生物菌種鑒定 先用0.45%的氯化鈉(NaCl)配制0.5 McF的菌懸液，選取GP卡放入Compact鑒定，具體操作按照Vitek2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)說明書進(jìn)行。

1.2.3血清學(xué)試驗(yàn) 血清學(xué)試驗(yàn)前需首先進(jìn)行菌株質(zhì)控，沙門氏菌血清學(xué)質(zhì)控菌株中傷寒沙門菌ATCC14028為陽性，大腸埃希菌ATCC25922為陰性；志賀氏菌血清學(xué)質(zhì)控菌株中志賀氏菌ATCC12022為陽性，大腸埃希菌ATCC25922為陰性；致病性大腸埃希菌血清學(xué)質(zhì)控菌株中EQA1112大腸埃希菌為陽性，大腸埃希菌ATCC25922為陰性。

1.2.4蛋白質(zhì)鑒定 先將校準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC8739涂于校準(zhǔn)點(diǎn)位，再選取本菌株涂于靶板，加1 μL基質(zhì)干燥后上機(jī)鑒定，具體操作步驟按照Vitek2 MS全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)說明書進(jìn)行。

1.2.516S rDNA測序?qū)Ρ?提取菌株的DNA，外送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行DNA測序，完成測序后，將序列在美國國家生物技術(shù)中心(NCBI)上采用BLAST 程序進(jìn)行DNA對比分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，從而判定細(xì)菌種類。

1.2.6核酸檢測試驗(yàn) 采用沙門氏菌/志賀氏菌雙通道核酸檢測試劑[聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)-熒光探針法]檢測[6-7]。采用實(shí)時(shí)熒光PCR原理的5種致瀉性大腸桿菌核酸檢測試劑，分A、B、C 3種不同PCR反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增進(jìn)程中，反光基因與淬滅基因分離，產(chǎn)生熒光信號，利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)測和輸出，實(shí)現(xiàn)結(jié)果的定性分析。

2 結(jié) 果

2.1培養(yǎng)特性 經(jīng)37 ℃培養(yǎng)18～24 h，XLD平板上觀察到有產(chǎn)硫化氫的中心黑色的菌落，SS瓊脂平板呈現(xiàn)黑色中心的半透明菌落，符合沙門氏菌典型菌落的特點(diǎn)。XLD平板與SS瓊脂平板培養(yǎng)結(jié)果分別見圖1、2。

圖1 XLD平板培養(yǎng)結(jié)果

圖2 SS瓊脂平板培養(yǎng)結(jié)果

2.2生化鑒定結(jié)果

2.2.1雙糖鐵轉(zhuǎn)種試驗(yàn)結(jié)果 產(chǎn)氣、斜面呈現(xiàn)紅色、底部呈現(xiàn)黑色，符合沙門氏菌的生化特性。見圖3。

圖3 菌株雙糖鐵轉(zhuǎn)種試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2Vitek 2 Compact生化鑒定結(jié)果 Vitek 2 Compact生化鑒定結(jié)果見表1，生化鑒定結(jié)果為大腸埃希菌。

表1 Vitek 2 Compact生化鑒定結(jié)果

2.3MS鑒定結(jié)果 Vitek MS蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果見圖4，鑒定結(jié)果為大腸埃希菌。

圖4 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

2.4血清凝集試驗(yàn)結(jié)果 培養(yǎng)菌株與沙門氏菌診斷血清、致病性大腸埃希菌診斷血清、志賀氏菌診斷血清、侵襲性大腸埃希菌診斷血清、產(chǎn)毒性大腸埃希菌診斷血清進(jìn)行玻片凝集，結(jié)果均不凝集。

2.516S rDNA測序?qū)Ρ冉Y(jié)果 在GenBank中基因?qū)Ρ?若其結(jié)果同源超過98%可以確立為同一種屬。測序?qū)Ρ冉Y(jié)果顯示菌株DNA與弗格森埃希菌、志賀氏菌、大腸埃希菌都有較高的一致性，概率均在99%以上。菌株DNA測序?qū)Ρ冉Y(jié)果見表2。

表2 菌株DNA測序?qū)Ρ?/p>

2.6核酸檢測試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1沙門氏菌/志賀氏菌雙通道核酸檢測結(jié)果 經(jīng)檢測，沙門氏菌和志賀氏菌均無擴(kuò)增曲線，見圖5。

圖5 雙通道熒光PCR擴(kuò)增曲線

2.6.25種致瀉性大腸桿菌核酸檢測結(jié)果 用5種致瀉性大腸桿菌核酸檢測(熒光PCR法)，采用A、B、C 3種反應(yīng)體系，分別對5種致瀉性大腸埃希菌進(jìn)行檢測，A體系用于腸侵襲性大腸埃希菌(EnteroinvasiveE.coli，EIEC)和腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)檢測，B體系用于腸致病性大腸埃希菌(EnteropathogenicE.coli，EPEC)和腸出血性大腸埃希菌(EnterohemorrhagicE.coli，EHEC)檢測，C體系用于腸黏附性大腸埃希菌 (EnteroadherentE.coli，EAEC)和大腸埃希菌種屬鑒定。A、B、C反應(yīng)體系結(jié)果顯示只有毒力基因uidA(+)有擴(kuò)增，見表3。

表3 5種致瀉性大腸埃希菌核酸檢測結(jié)果

3 討 論

致病性大腸埃希菌引起腸道疾病越來越多，5歲以下兒童為易感染人群[8-9]。致瀉性大腸埃希菌根據(jù)不同的毒性特征可將DEC分為6類，EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC及彌散黏附性大腸埃希菌(Diff～etyadherentE.coli，DAEC)。通常通過分離培養(yǎng)基、雙糖鐵試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)即可快速確定菌屬和血清型別。但當(dāng)一些菌株特有的生化特性發(fā)生改變或一些少見的血清型時(shí)，便無法獲得準(zhǔn)確的鑒定和確定其是否致病。全自動(dòng)微生物分析儀、MS技術(shù)、測序技術(shù)的應(yīng)用，雖然可以快速地鑒定大腸埃希菌，但通常仍需要血清學(xué)試驗(yàn)判斷其是否為致病性大腸埃希菌。同時(shí)由于大腸埃希菌和志賀氏菌有較高的同源性，通過生化反應(yīng)和MS鑒定仍有一定的錯(cuò)誤率[10]。

分子分型作為一種新興分型技術(shù)，與傳統(tǒng)細(xì)菌的鑒定方法、增菌后分離、生化鑒定和血清鑒定相比較，通過檢測致病毒力因子，可快速、高效地檢出致病菌，提高陽性檢出率，大大縮短了檢測時(shí)間。例如，胡安妥等[11]建立了基于多重?zé)晒釶CR的5類致瀉性大腸埃希菌的方法，有很好的針對性、準(zhǔn)確度和區(qū)分力[12-13]，且檢測可在2 h內(nèi)完成。本研究也采用該方法對目標(biāo)菌株進(jìn)行分析。5種致瀉性大腸桿菌核酸檢測(熒光PCR法)，采用A、B、C 3種反應(yīng)體系，分別對5種致瀉性大腸埃希菌進(jìn)行檢測，A體系可用于EIEC和ETEC檢測，B體系可用于EPEC和EHEC檢測，C體系可用于EAEC和大腸埃希菌種屬鑒定，但該方法無法檢出一些少見的、非5種致瀉性大腸埃希菌。

產(chǎn)硫化氫大腸埃希菌的鑒定是對傳統(tǒng)生化鑒定的挑戰(zhàn)，產(chǎn)硫化氫致病性大腸埃希菌在致病性大腸埃希菌中占有一定的比重。日常檢測中，需重視產(chǎn)硫化氫致病性大腸埃希菌的存在，關(guān)注其變異性。本文通過一株產(chǎn)硫化氫大腸埃希菌的檢出，分析了不同方法對致病性大腸埃希菌檢出的優(yōu)、缺點(diǎn)。臨床工作中，應(yīng)充分發(fā)揮傳統(tǒng)方法和先進(jìn)儀器、方法的優(yōu)勢，兩者相結(jié)合提高腸道病原菌的檢出率和鑒定的準(zhǔn)確率[14]。