李俊菲 唐梅艷 陳歡 徐丹

湘南學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，湖南省郴州市 423000

異紫堇堿（isocorydine，ICD）是一種阿樸啡類生物堿，廣泛存在于禿瘡花[Dicranostigma leptopodum（Maxim.）Fedde]、紫金龍[Dactylicapnos scandens（D.Don）Hutchins]等多種罌粟科植物中，臨床用于治療痙攣和血管舒張，以及抗瘧原蟲和抗心律失常等治療[4]。既往研究結(jié)果表明，ICD可以通過誘導(dǎo)宮頸癌SiHa細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)揮抗癌活性的作用[5]。

最近的研究結(jié)果顯示，微小RNA（microRNA，miRNA）參與調(diào)節(jié)不同癌細(xì)胞的輻射敏感性，并在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[6]；miR-129-5p在宮頸癌組織中低表達(dá)，其表達(dá)的上調(diào)可以抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲、遷移以及荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和血管生成能力[7]；知母皂苷A-Ⅲ抑制腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的特性，有助于抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路，提高miR-129-5p的表達(dá)，以及下調(diào)組織蛋白酶C的表達(dá)[8]。然而ICD在宮頸癌輻射敏感性中的作用及其是否通過上調(diào)miR-129-5p和抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來發(fā)揮作用尚未可知。

本研究探討ICD對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、輻射敏感性的影響及其潛在的分子機(jī)制，為宮頸癌治療藥物的研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

宮頸癌SiHa細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國(guó)Hyclone公司，ICD購自深圳愛拓公司，MTT購自美國(guó)Sigma公司，RIPA裂解液購自上海碧云天公司，Lipofectamine 2000試劑、Trizol試劑購自美國(guó)Invitrogen公司，cDNA合成試劑盒購自日本TaKaRa公司，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自美國(guó)EMD Millipore公司，二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自美國(guó)Pierce公司，磷酸化組蛋白H2AX（phosphorylated histone H2AX，γ-H2AX）抗體購自上海Abcam公司，磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化Akt（p-Akt）、β肌動(dòng)蛋白（β-actin）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）抗體購自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）購自武漢博士德生物有限公司，miR-NC、miR-129-5p、anti-miR-NC、anti-miR-129-5p均購自上海GenePharma公司。Multiscan MK3酶標(biāo)儀購自美國(guó)Thermo Scientific公司，7500 PCR儀購自美國(guó)ABI公司，Neulife醫(yī)用電子直線加速器購自沈陽東軟醫(yī)療系統(tǒng)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

在宮頸癌SiHa細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周換液2～3次。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞，分別采用25、50、100、200 μmol/L的ICD處理72 h（簡(jiǎn)稱ICD處理組，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用100 μmol/L的ICD處理72 h），同時(shí)將正常培養(yǎng)未經(jīng)ICD處理的SiHa細(xì)胞設(shè)為對(duì)照（normal control，NC）組。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)

將密度為5×104個(gè)/mL的SiHa細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)72 h后加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，37℃培養(yǎng)4 h，加入150 μL二甲基亞砜，搖床震蕩10 min，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A490值），計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（1?ICD處理組吸光度/NC組吸光度）×100%。

1.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

收集ICD處理的SiHa細(xì)胞500個(gè)，分別使用0、2、4、6、8 Gy X射線照射，劑量率為300 cGy/min。待觀察到明顯的細(xì)胞克隆時(shí)，吸棄原有的培養(yǎng)液，分別使用甲醇固定和結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察，以細(xì)胞數(shù)>50個(gè)作為1個(gè)克隆，計(jì)算細(xì)胞的克隆形成率。其中，細(xì)胞克隆形成率（%）=細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（%）=受照射細(xì)胞克隆形成率/未照射細(xì)胞克隆形成率×100%。通過應(yīng)用GraphPad Prism7軟件（美國(guó)GraphPad Software公司）進(jìn)行單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，分析放射生物學(xué)參數(shù)，包括平均致死劑量（D0）、準(zhǔn)閉劑量（Dq）、外推值（N），計(jì)算SER，SER=NC組D0/ICD處理組D0。

1.5 Western blot

采用RIPA裂解液提取ICD處理+6 Gy X射線照射后12 h的SiHa細(xì)胞蛋白（檢測(cè)γ-H2AX蛋白的表達(dá)）和ICD處理的SiHa細(xì)胞蛋白（檢測(cè)p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)），經(jīng)二喹啉甲酸（BCA）法定量后，吸取30 μg蛋白樣品進(jìn)行10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)PVDF膜，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，依次加入γ-H2AX、p-PI3K和p-Akt一抗（稀釋比例為1∶1000），用TBST（tris buffered saline with tween）緩沖溶液充分漂洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（稀釋比例為1∶5000），置于化學(xué)發(fā)光液中曝光顯影。以β-actin作為對(duì)照，分析γ-H2AX、p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)。

那么，即使藝術(shù)AI能夠產(chǎn)生在第三人稱經(jīng)驗(yàn)上與人類作品無法區(qū)分的作品，但因?yàn)锳I并不具有真正的意向能力，所以AI是不能進(jìn)行真正的藝術(shù)創(chuàng)作的。AI利用隨機(jī)性算法產(chǎn)生的“作品”本身并不具有藝術(shù)品地位，而是像自然界的奇石一樣，有待具有藝術(shù)意向能力的意識(shí)主體的揀選。當(dāng)且僅當(dāng)一個(gè)藝術(shù)家用藝術(shù)發(fā)現(xiàn)的眼光將一個(gè)“現(xiàn)成物”——一塊奇石、一個(gè)小便池或一件AI產(chǎn)生的作品——揀選出來并命名為藝術(shù)品時(shí)，這個(gè)物件才有了藝術(shù)表達(dá)的含義。相比之下，AI本身卻沒有做出這種判斷的能力和資格，所以基于深度學(xué)習(xí)算法的AI無論什么時(shí)候都不可能進(jìn)行真正的藝術(shù)“創(chuàng)作”。

1.6 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）

采用Trizol試劑提取ICD處理的SiHa細(xì)胞總RNA，按照cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行操作，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行qRT-PCR。miR-129-5p的上游引物序列為5′-GATCCGCAAGCCCAGACCG CAAAAAGTTTTTA-3′，下游引物序列為5′-AGCT TAAAAACTTTTTGCGGTCTGGGCTTGCG-3′。內(nèi)參蛋白β-actin的上游引物序列為5′-CTACAAT GAGCTGCGTGTGG-3′，下游引物序列為5′-TAGC TCTTCTCTCCAGGGAGGA-3′。根據(jù)2?ΔΔCt法計(jì)算miR-129-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將密度為1×105個(gè)/mL的SiHa細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%匯合度時(shí)，嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000試劑說明書上的操作，分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-129-5p、anti-miR-NC、anti-miR-129-5p到SiHa細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，在轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-129-5p的細(xì)胞中分別加入100 μmol/L的ICD。參照1.3～1.6節(jié)中所述方法進(jìn)行SiHa細(xì)胞的增殖和輻射敏感性、γ-H2AX蛋白的表達(dá)、PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)、miR-129-5p的相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定；參照1.5 節(jié)中所述方法檢測(cè)cyclinD1蛋白的表達(dá)，其一抗稀釋比例為1∶1000。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以xˉ±s表示，2組間數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（方差齊）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度ICD對(duì)SiHa細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組SiHa細(xì)胞的增殖抑制率[（0.05±0.01）%]相比，25、50、100、200 μmol/L ICD處理組能夠明顯提高SiHa細(xì)胞的增殖抑制率[（10.26±1.03）%、（22.16±2.21）%、（44.09±4.41）%、（70.88±7.09）%]，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）（圖1）。

圖1 不同濃度異紫堇堿對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的影響 a表示與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=29.736、30.013、29.959、29.970，均P<0.05）Figure 1 Effect of different concentrations of isocorydine on the proliferation of cervical cancer SiHa cells

2.2 ICD對(duì)SiHa細(xì)胞輻射敏感性的影響

與NC組比較，100 μmol/L ICD處理組能夠明顯降低2、4、6、8 Gy X射線照射的SiHa細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)（均P<0.05，圖2A），且提高γ-H2AX蛋白的相對(duì)表達(dá)量（P<0.05，圖2B），細(xì)胞的SER為1.12（表1）。

表1 ICD聯(lián)合X射線照射對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞作用的單擊 多靶模型的參數(shù)值Table 1 Statistical results of single-click multi-target model of the effect of isocorydine combined with X-ray irradiation on cervical cancer SiHa cells

圖2 ICD對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞輻射敏感性的影響 A為ICD對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞輻射敏感性的影響，a表示與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.135～44.478，均P<0.05）；B為Western blot檢測(cè)γ-H2AX蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組比較，ICD處理組能提高γ-H2AX蛋白的相對(duì)表達(dá)量（t=15.041，P<0.05）。ICD為異紫堇堿；γ-H2AX為磷酸化組蛋白H2AXFigure 2 Effect of isocorydine on the radiosensitivity of cervical cancer SiHa cells

2.3 ICD對(duì)miR-129-5p表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組比較，ICD處理組能夠明顯提高SiHa細(xì)胞中miR-129-5p的相對(duì)表達(dá)量（3.22±0.32對(duì)1.00±0.11，t=19.682，P<0.05）。

2.4 高表達(dá)miR-129-5p對(duì)SiHa細(xì)胞增殖和輻射敏感性的影響

由圖3可見，與轉(zhuǎn)染miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-129-5p組能夠明顯提高SiHa細(xì)胞中miR-129-5p的相對(duì)表達(dá)量（P<0.05，圖3A），這表明高表達(dá)miR-129-5p的細(xì)胞已構(gòu)建成功；與轉(zhuǎn)染miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染（高表達(dá)）miR-129-5p組能夠明顯提高SiHa細(xì)胞的增殖抑制率[（75.06±7.51）%對(duì)（1.04±0.10）%，P<0.05，圖3B]，降低2、4、6、8 Gy X射線照射后細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)（均P<0.05，圖3C），降低cyclinD1蛋白的相對(duì)表達(dá)量（P<0.05，圖3D），并提高γ-H2AX蛋白的相對(duì)表達(dá)量（P<0.05，圖3E），細(xì)胞的SER為1.68（表2）。

表2 高表達(dá)miR-129-5p聯(lián)合X射線照射對(duì)宮頸癌SiHa細(xì) 胞作用的單擊多靶模型的參數(shù)值Table 2 Statistical results of single-click multi-target model of the effects of miR-129-5p overexpression combined with X-ray irradiation on cervical cancer SiHa cells

圖3 高表達(dá)miR-129-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖和輻射敏感性的影響 A為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-129-5p的相對(duì)表達(dá)量，a表示與轉(zhuǎn)染miR-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.192，P<0.05）；B為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率，a表示與轉(zhuǎn)染miR-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=29.566，P<0.05）；C為高表達(dá)miR-129-5p對(duì)SiHa細(xì)胞輻射敏感性的影響，a表示與轉(zhuǎn)染miR-NC組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.239～37.015，均P<0.05）；D為cyclinD1、γ-H2AX蛋白的相對(duì)表達(dá)量，a表示與轉(zhuǎn)染miR-NC組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.393、17.076，均P<0.05）；E為Western blot檢測(cè)cyclinD1、γ-H2AX蛋白的表達(dá)。NC為對(duì)照；cyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1；γ-H2AX為磷酸化組蛋白H2AXFigure 3 Effect of high expression of miR-129-5p on the proliferation and radiosensitivity of cervical cancer SiHa cells

2.5 低表達(dá)miR-129-5p對(duì)IDC處理的SiHa細(xì)胞的增殖和輻射敏感性的影響

由圖4可見，與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC+ICD處理組比較，轉(zhuǎn)染anti-miR-129-5p（低表達(dá)miR-129-5p）+ICD處理組能夠明顯降低SiHa細(xì)胞中miR-129-5p的相對(duì)表達(dá)量（P<0.05，圖4A）、細(xì)胞的增殖抑制率[（21.09±2.11）%對(duì)（71.49±7.15）%，P<0.05，圖4B]，能夠提高2、4、6、8 Gy X射線照射后細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)（均P<0.05，圖4C）、cyclinD1蛋白的相對(duì)表達(dá)量（P<0.05，圖4D），并降低γ-H2AX蛋白的相對(duì)表達(dá)量（P<0.05，圖4E），細(xì)胞的SER為0.83（表3）。

表3 低表達(dá)miR-129-5p聯(lián)合X射線照射對(duì)ICD處理的宮頸癌SiHa細(xì)胞作用的單擊多靶模型的參數(shù)值Table 3 Statistical results of single-click multi-target model of the effect of miR-129-5p underexpression combined with X-ray irradiation on cervical cancer SiHa cells treated with isocorydine

圖4 低表達(dá)miR-129-5p對(duì)ICD處理的SiHa細(xì)胞的增殖和輻射敏感性的影響 A為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-129-5p的相對(duì)表達(dá)量，a表示與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC+ICD處理組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.655，P<0.05）；B為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率，a表示與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC+ICD處理組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.282，P<0.05）；C為低表達(dá)miR-129-5p對(duì)ICD處理的SiHa細(xì)胞輻射敏感性的影響，a表示與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC+ICD處理組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.920～28.252，均P<0.05）；D為cyclinD1、γ-H2AX蛋白的相對(duì)表達(dá)量，a表示與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC+ICD處理組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.854、10.290，均P<0.05）；E為Western blot檢測(cè)cyclinD1、γ-H2AX蛋白的表達(dá)。NC為對(duì)照；ICD為異紫堇堿；cyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1；γ-H2AX為磷酸化組蛋白H2AXFigure 4 Effect of low expression of miR-129-5p on the proliferation and radiosensitivity of cervical cancer SiHa cells treated with isocorydine

2.6 PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

由圖5可見，與NC組比較，ICD處理組能夠明顯降低SiHa細(xì)胞的p-PI3K、p-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量（均P<0.05）；與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC+ICD處理組比較，轉(zhuǎn)染anti-miR-129-5p（低表達(dá)miR-129-5p）+ICD處理組能夠顯著提高SiHa細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量（均P<0.05）。

圖5 低表達(dá)miR-129-5p反轉(zhuǎn)ICD對(duì)p-PI3K、p-Akt蛋白的抑制作用 A為p-PI3K、p-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量，a表示與NC組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.897、15.429，均P<0.05），b表示與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC+ICD處理組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.370、13.396，均P<0.05）；B為Western blot檢測(cè)p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)。NC為對(duì)照；ICD為異紫堇堿；p-PI3K為磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶；p-Akt為磷酸化蛋白激酶BFigure 5 Underexpression of miR-129-5p reverses the inhibitory effect of isocorynine on phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase and phosphorylated protein kinase B expression

3 討論

宮頸癌的發(fā)病率和病死率在女性惡性腫瘤中排名第四位，2018年全球新發(fā)宮頸癌約570 000例，死亡311 000例[9]。在發(fā)達(dá)國(guó)家，由于婦科疾病篩查率的提高和人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗使用的增加，宮頸癌的發(fā)病率有所下降[9]，大多數(shù)新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[10]，宮頸癌的治療仍然是這些國(guó)家面臨的一個(gè)重大的臨床問題。手術(shù)、化療聯(lián)合放療是目前宮頸癌的主要治療方法。近年來，隨著放療技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，其在臨床中的作用日益突出。放療不僅在局部進(jìn)展期宮頸癌中起著關(guān)鍵作用，而且在術(shù)后治療中也可作為輔助治療方法用于防止局部復(fù)發(fā)[11]。盡管隨著宮頸癌篩查率的逐漸提高和治療策略的進(jìn)步，宮頸癌患者的生存率有所提高，但仍有一些患者因腫瘤轉(zhuǎn)移或耐藥而死亡[12]，宮頸癌細(xì)胞對(duì)輻射敏感性的降低是部分患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因[13]。目前仍需要新的針對(duì)宮頸癌患者的有效治療方法。因此，有必要研究宮頸癌細(xì)胞的輻射耐受機(jī)制，開發(fā)宮頸癌輻射增敏的藥物，尋找宮頸癌放療耐受患者潛在的新的治療靶點(diǎn)。

ICD是一種很有潛力的抗癌藥物，既往研究結(jié)果表明，ICD參與細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等過程，具有良好的抗癌活性[5]。ICD通過抑制肝癌細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路，抑制阿霉素誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]，并可能通過抑制核因子κB（NF-κB）通路活性抑制人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。ICD對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞的增殖、遷移具有抑制作用，對(duì)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，具體機(jī)制與抑制PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路活性緊密相關(guān)[16]。然而，有關(guān)ICD對(duì)宮頸癌輻射敏感性的影響仍不清楚。本研究結(jié)果顯示，ICD能夠明顯抑制SiHa細(xì)胞的增殖，降低2、4、6、8 Gy X射線照射后SiHa細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，提高γ-H2AX蛋白的相對(duì)表達(dá)量，細(xì)胞的SER為1.12。這些結(jié)果表明，ICD對(duì)宮頸癌細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抗增殖和輻射增敏的作用，與之前的研究結(jié)果[5]相符。

miRNA是一類小的非編碼RNA，包含18～24個(gè)核苷酸，可與靶基因的3′非編碼區(qū)特異性結(jié)合。有研究者報(bào)道，一些miRNA參與調(diào)節(jié)不同癌細(xì)胞的輻射反應(yīng)，以增加其輻射敏感性[17]。例如：miR-15a-3p通過靶向腫瘤蛋白D52增加了宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性[18]；miR-122-5p通過靶向細(xì)胞分裂周期蛋白25A提高了宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性[19]。MiR-129-5p已被證明是一種腫瘤抑制因子，具有抗癌活性[20-21]。研究結(jié)果顯示，miR-129-5p通過抑制乳腺癌細(xì)胞的自噬和高遷移率族蛋白B1的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性[22]。MiR-129-5p在宮頸癌中表達(dá)下調(diào)，可以抑制宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，然而其在宮頸癌細(xì)胞耐輻射中的功能和具體分子機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，ICD明顯提高了SiHa細(xì)胞中miR-129-5p的表達(dá)，這提示ICD增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞輻射敏感性的機(jī)制可能與miR-129-5p的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，高表達(dá)miR-129-5p能夠明顯提高SiHa細(xì)胞的增殖抑制率，降低2、4、6、8 Gy X射線照射的細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，降低cyclinD1蛋白的相對(duì)表達(dá)量，并提高γ-H2AX蛋白的相對(duì)表達(dá)量，細(xì)胞的SER為1.68，這表明miR-129-5p表達(dá)上調(diào)可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，這與之前的研究結(jié)果[7]一致。

PI3K/Akt信號(hào)通路在宮頸癌的輻射敏感性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[23]。黃濤[16]指出，ICD對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用，以及對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用是通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活來實(shí)現(xiàn)的。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)，miR-129-5p通過PI3K/Akt信號(hào)通路直接靶向同源異形盒轉(zhuǎn)錄因子6（PAX6），抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤的生長(zhǎng)，從而抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，ICD能夠明顯降低p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)，低表達(dá)miR-129-5p可以反轉(zhuǎn)ICD對(duì)SiHa細(xì)胞的增殖抑制作用、抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活性的作用和增強(qiáng)細(xì)胞輻射敏感性的作用。以上結(jié)果表明，上調(diào)miR-129-5p表達(dá)并抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活性可能是ICD抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、增強(qiáng)其輻射敏感性的重要途徑。

綜上，本研究結(jié)果表明，ICD可以抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖，并增強(qiáng)其輻射敏感性，具有一定的抗癌活性，其作用機(jī)制與上調(diào)miR-129-5p表達(dá)及抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活性有關(guān)。本研究為臨床提高宮頸癌患者放療敏感性提供了有價(jià)值的靶點(diǎn)和治療策略。

利益沖突本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨(dú)立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明李俊菲負(fù)責(zé)方法的建立、論文的撰寫；唐梅艷、陳歡負(fù)責(zé)現(xiàn)場(chǎng)的實(shí)驗(yàn)；徐丹負(fù)責(zé)論文的審閱。