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        牛肉、牛奶中可的松和氫化可的松含量分析

        2021-08-31 02:34:52楊蘊(yùn)嘉
        食品科學(xué) 2021年16期
        關(guān)鍵詞:氫化產(chǎn)地平均值

        楊 奕,尹 杰,楊蘊(yùn)嘉,張 晶

        (北京市疾病預(yù)防控制中心,北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100013)

        激素類物質(zhì)是調(diào)節(jié)機(jī)體正常生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖等重要生命活動(dòng)的關(guān)鍵生物活性成分。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同,激素可分為肽類、氨基酸類、胺類和類固醇類。類固醇類激素又包括腎上腺皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇、醛固酮等)和性激素(雌激素、孕激素及雄激素等)。在動(dòng)物食品安全領(lǐng)域,激素類藥物的殘留是消費(fèi)者最為關(guān)注的議題;另一方面,動(dòng)物組織中會(huì)天然存在一些自身細(xì)胞合成和分泌、調(diào)節(jié)生理活動(dòng)的內(nèi)源性激素物質(zhì),如同屬于糖皮質(zhì)激素的氫化可的松和可的松[1-3]。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定可的松可以在馬、牛、豬、羊4 種動(dòng)物的飼養(yǎng)過程中使用,氫化可的松可以在所有動(dòng)物飼養(yǎng)中使用但僅限于外用,并且可的松和氫化可的松均不需要制定最大殘留限量[4]。然而,歐盟和加拿大規(guī)定牛奶和羊奶中氫化可的松的殘留限量為10 μg/kg[5-6]。在我國(guó)的進(jìn)出口食品國(guó)際貿(mào)易中,食品中農(nóng)獸藥法規(guī)限量的差異可能導(dǎo)致食品退運(yùn)等問題,給我國(guó)食品出口企業(yè)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7-9]。有研究表明,盡管皮質(zhì)醇激素在生物體的正常生理活動(dòng)中起到重要的調(diào)節(jié)作用,但是長(zhǎng)期大劑量地使用皮質(zhì)醇激素會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、高血壓、肥胖、急性心肌梗死、感染等不良反應(yīng)[10-12]。因此,開展可的松和氫化可的松在主要食品中的含量水平研究,獲得這2 種化合物在牛奶等動(dòng)物性食品中的存在水平,不僅對(duì)于保護(hù)消費(fèi)者健康具有重要意義,同時(shí)也對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易具有重要的價(jià)值[13-15]。

        現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中,有關(guān)激素類藥物的檢測(cè)技術(shù)報(bào)道較多[16-27],部分文獻(xiàn)也涉及到可的松和氫化可的松,但是這些研究多集中于分析方法本身,樣本監(jiān)測(cè)相對(duì)較少。Ma Lili等[28]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)牛奶中氫化可的松的含量水平在2 μg/kg以下;Chiesa等[29]分析了原料乳樣品中多種激素的含量,得到可的松和氫化可的松的平均值分別為1.06 μg/L和2.56 μg/L。但是,以上研究均存在樣本量少等問題,不足以獲得動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源性激素含量水平的閾值[30]。此外,由于不同產(chǎn)地牛在養(yǎng)殖過程中投喂的飼料不同,且飼養(yǎng)習(xí)慣也有所差異,可能會(huì)導(dǎo)致牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松含量不同。因此,本研究擬通過大量樣本采集,分析市售牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松的含量水平,初步獲得兩類產(chǎn)品中可的松和氫化可的松的含量范圍,對(duì)不同產(chǎn)地的牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松含量進(jìn)行分析,旨在為動(dòng)物性食品的安全保障提供技術(shù)支持及數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑與儀器

        可的松、氫化可的松、同位素內(nèi)標(biāo)氫化可的松-D3德國(guó)Dr. Ehrenstoffer公司;甲酸、乙酸、乙酸鈉(均為分析純) 美國(guó)百靈威公司;甲醇、乙腈(均為色譜級(jí))美國(guó)Fisher公司;β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶溶液美國(guó)羅氏公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;石墨化碳黑固相萃取柱(ENVI-CarbTM) 安譜集團(tuán)有限公司;氨基固相萃取柱、Acquity UPLC超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

        1.2 方法

        1.2.1 檢測(cè)方法

        試樣中的目標(biāo)化合物檢測(cè)采用GB/T 21891—2008《動(dòng)物源性食品中的激素多殘留檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》,主要步驟如下:稱取樣品5 g(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中。準(zhǔn)確加入100 μg/L氫化可的松-D3溶液100 μL和10 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,混勻后再加入100 μL葡萄糖酸苷肽酶/磺酸酯酶溶液于37 ℃水浴搖床中酶解過夜,取出后再加入25 mL甲醇,超聲提取30 min。提取液ENVI-Carb固相萃取柱和氨基柱凈化,洗脫液并在微弱的氮?dú)饬飨麓蹈?,? mL甲醇-水(50∶50,V/V)溶解殘?jiān)蠙C(jī)測(cè)定。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀器方法參數(shù)均參考GB/T 21891—2008。

        1.2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

        配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1、2.5、5、10、20、50 μg/L和100 μg/L,均含有氫化可的松-D3同位素內(nèi)標(biāo)各10 μg/L。經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定,以目標(biāo)化合物的定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo),待測(cè)組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制內(nèi)標(biāo)工作曲線。

        在均質(zhì)的空白樣品中加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,使樣品中可的松、氫化可的松的加標(biāo)量分別為0.1、1 μg/kg和5 μg/kg,內(nèi)標(biāo)氫化可的松-D3均為2 μg/kg。每個(gè)水平設(shè)6 個(gè)平行,計(jì)算目標(biāo)化合物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

        1.2.3 樣品收集

        采用方便抽樣的方法,在我國(guó)不同區(qū)域的城市超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等地采集市售牛肉、牛奶樣品。所有樣品采集后立即運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室,-20 ℃冷凍保存。

        1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

        應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)分析前所有計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)判斷是否符合正態(tài)分布。對(duì)于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù),以描述;不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù),用最大值、平均值、中位數(shù)和95百分?jǐn)?shù)(P95)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。采用Spearman秩相關(guān)性分析法對(duì)樣品中可的松和氫化可的松含量相關(guān)性進(jìn)行分析。P<0.05,差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

        對(duì)檢測(cè)方法開展實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法確證。結(jié)果表明,可的松和氫化可的松均在0.5~100 μg/L內(nèi)呈良好的線性,相關(guān)系數(shù)r2大于0.999 3。2 種目標(biāo)化合物的檢出限均為0.04 μg/kg,定量限均為0.1 μg/kg(表1)。3 個(gè)加標(biāo)水平下,可的松和氫化可的松的回收率在83.6%~113.5%之間,RSD為2.4%~10.5%,表明該方法具有良好的線性、準(zhǔn)確度和精密度。

        表1 可的松和氫化可的松的線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Calibration equation, LOD and LOQ for corstione and cortisol

        2.2 樣品收集

        本研究從浙江、湖南、山東、黑龍江、云南、陜西、四川、北京、寧夏等省、市、自治區(qū)的超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集牛肉樣品188 件和牛奶樣品158 件,共計(jì)346 件樣品。如圖1所示,采樣地點(diǎn)涵蓋了我國(guó)東北、華北、華東、西北、西南以及華中地區(qū)6大地理區(qū)域,具有一定代表性。此外,對(duì)本研究采集的346 件樣品的產(chǎn)地進(jìn)行分析,牛肉和牛奶的產(chǎn)地除了采集地以外,還涉及河北、安徽等地。

        圖1 牛肉和牛奶樣品采集地和產(chǎn)地分布圖Fig. 1 Regional distribution of of beef and milk samples collected in this study

        2.3 可的松和氫化可的松含量水平分析

        采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)346 件牛肉和牛奶樣本中可的松和氫化可的松的含量,將所有檢測(cè)結(jié)果小于檢出限視為未檢出,發(fā)現(xiàn)牛肉和牛奶中可的松的檢出率分別為88.8%和86.1%,氫化可的松的檢出率分別為99.5%和100%。參照世界衛(wèi)生組織有關(guān)膳食中污染物含量的統(tǒng)計(jì)方法[31],在數(shù)據(jù)分析中對(duì)測(cè)定結(jié)果小于定量限的樣本按照0.5 倍定量限(0.05 μg/kg)進(jìn)行賦值,對(duì)測(cè)定結(jié)果小于檢出限的樣本按照0.5 倍檢出限(0.02 μg/kg)進(jìn)行賦值。

        利用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)(W檢驗(yàn))方法對(duì)賦值后的牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松的含量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),結(jié)果如表2所示。牛肉中可的松和氫化可的松,以及牛奶中可的松含量正態(tài)性檢驗(yàn)的P值均小于0.05,呈非正態(tài)分布;而牛奶中氫化可的松含量的正態(tài)性檢驗(yàn)的P值大于0.05,呈正態(tài)分布。因此,本研究對(duì)牛肉中可的松和氫化可的松,以及牛奶中可的松含量的統(tǒng)計(jì)描述采用最大值、平均值、中位數(shù)和P95;對(duì)牛奶中氫化可的松含量的統(tǒng)計(jì)描述除采用上述指標(biāo)外,還計(jì)算了標(biāo)準(zhǔn)差。

        表2 牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松含量的Shapiro-Wilk檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of Shapiro-Wilk test of cortisone and cortisol contents in beef and milk

        如表3所示,在188 件牛肉樣品中可的松含量的最大值為12.71 μg/kg,最小值為0.02 μg/kg,其平均值和中位值分別為1.69 μg/kg和1.14 μg/kg,P95為5.15 μg/kg。牛肉中氫化可的松含量在0.02~74.88 μg/kg之間,其平均值和中位值分別為12.16 μg/kg和8.14 μg/kg,P95為34.18 μg/kg。牛奶中可的松最高含量為1.80 μg/kg,最低含量為0.02 μg/kg,其平均值和中位值均為0.23 μg/kg,P95為0.40 μg/kg。然而,對(duì)于牛奶中的氫化可的松而言,由于其濃度值符合正態(tài)分布,因此用均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。結(jié)果表明,牛奶中氫化可的松含量為(0.72±0.35) μg/kg,P95為1.31 μg/kg。

        表3 牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松的含量水平Table 3 Cortiaone and cortisol contents in beef and milk samples μg/kg

        由于激素是生物體內(nèi)天然存在的物質(zhì),具有多種生理功能與生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān),因此肉和奶等動(dòng)物性食品中通常會(huì)含有一定量的皮質(zhì)醇激素等內(nèi)源性激素[21-25]。Ma Lili等[28]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)牛奶中12 種皮質(zhì)醇激素,在10 份牛奶樣本中只檢測(cè)到了氫化可的松,其含量為0.69~1.82 μg/kg。在另一項(xiàng)研究中,Chiesa等[29]分析了50 份牛奶樣品種多種激素的含量,得到可的松和氫化可的松在牛奶中含量的平均值分別為1.06 μg/L和2.56 μg/L。Goyon等[32]監(jiān)測(cè)了來自荷蘭3 家農(nóng)場(chǎng)的多份牛奶樣品,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自荷蘭的牛奶中可的松和氫化可的松含量平均值分別為112 ng/kg和235 ng/kg。在本課題組前期的研究中,測(cè)定了牛肉、雞肉等可食用肌肉組織中可的松和氫化可的松含量為0.3~14.7 μg/kg[19]。通過比較發(fā)現(xiàn),本研究測(cè)得的牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松的含量水平與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相當(dāng)。

        2.4 不同產(chǎn)地牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松含量水平

        本研究對(duì)不同產(chǎn)地的牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松的含量水平進(jìn)行了比較。188 份牛肉樣品的產(chǎn)地來自于安徽、北京、河北、黑龍江、湖南、內(nèi)蒙古、寧夏、山東、陜西、上海、四川、云南和浙江13 個(gè)省市自治區(qū),其中安徽、北京、上海、河北、陜西和浙江6 產(chǎn)地的樣本量均小于10,不再納入統(tǒng)計(jì)分析。同樣的,158 份牛奶樣品也來自安徽、北京、廣東等12 個(gè)省市自治區(qū),其中安徽、廣東、江蘇、河北、內(nèi)蒙古、寧夏以及天津產(chǎn)地的樣本量均小于10,不再納入統(tǒng)計(jì)分析。從圖2可以看出,不同產(chǎn)地牛肉樣品中可的松含量的平均值在0.29~3.44 μg/kg之間,中位數(shù)在0.02~2.87 μg/kg之間,氫化可的松含量平均值在5.94~0.33 μg/kg之間,中位數(shù)為5.58~16.68 μg/kg。不同產(chǎn)地牛奶中可的松含量平均值在0.13~0.32 μg/kg之間,中位數(shù)為0.15~0.31 μg/kg;氫化可的松含量平均值在0.43~1.07 μg/kg之間,中位數(shù)為0.46~1.06 μg/kg。從圖2可以看出,不同產(chǎn)地的牛肉、牛奶中可的松和氫化可的松的含量水平存在一定差異,提示地理環(huán)境因素可能會(huì)對(duì)肉牛和乳牛的激素分泌產(chǎn)生影響。但是由于本研究不同產(chǎn)地的樣本數(shù)量不完全一致,且未考慮品種、牛齡、采樣時(shí)間等因素的影響,因此目標(biāo)化合物濃度水平與樣品產(chǎn)地的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

        圖2 不同產(chǎn)地牛肉和牛奶中可的松、氫化可的松的含量分布Fig. 2 Distribution of cortisone and cortisol in beef and milk from different regions

        2.5 可的松和氫化可的松含量相關(guān)性分析

        利用相關(guān)性檢驗(yàn)考察樣品中2 種目標(biāo)化合物含量的相關(guān)性,計(jì)算2 種化合物含量的比值。分析結(jié)果顯示,牛肉和牛奶中可的松和氫化可的松的含量均呈顯著正相關(guān)(圖3),相關(guān)系數(shù)分別為0.735(P<0.001)和0.809(P<0.001)。牛肉中氫化可的松與可的松的含量比值范圍為1.0~44.5,平均值為8.58,中位數(shù)為7.05。牛奶中氫化可的松與可的松含量比值的范圍為1.1~25.4,平均值為4.33,中位數(shù)為3.40。上述結(jié)果表明,2 種內(nèi)源性激素在肉牛和乳牛體內(nèi)可能具有相同的合成、分泌和代謝途徑。

        圖3 牛肉(A)和牛奶(B)中可的松和氫化可的松相關(guān)性Fig. 3 Correlations between cortisone and cortisol contents in beef (A) and milk (B)

        3 結(jié) 論

        本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法分析采自我國(guó)9 個(gè)省、市、自治區(qū)的346 份牛肉和牛奶樣品中可的松和氫化可的松的含量水平。在牛肉和牛奶樣品中可的松和氫化可的松普遍檢出,檢出率均超過80%,可的松和氫化可的松的含量水平均小于100 μg/kg,且存在一定的地域差異。牛肉中可的松和氫化可的松,以及牛奶中可的松含量呈非正態(tài)分布,中位值分別為1.14、8.14 μg/kg和0.23 μg/kg。牛奶中的氫化可的松含量呈正態(tài)分布,其含量平均值為(0.72±0.35) μg/kg。以含量的P95評(píng)估牛肉可的松和氫化可的松含量范圍分別為小于5.15 μg/kg和34.18 μg/kg,牛奶可的松和氫化可的松含量范圍分別為小于0.40 μg/kg和1.31 μg/kg。此外,相關(guān)性檢驗(yàn)分析結(jié)果表明牛肉和牛奶2 類樣品中可的松和氫化可的松的含量均呈顯著正相關(guān),為食品中激素殘留的科學(xué)監(jiān)管提供了新思路。

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