苑 寧，張?zhí)N哲，張海娟，于 澤，盧 鑫，張 偉,,3,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北 滄州 061100；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000）

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）能引起人類患病[1]。世界衛(wèi)生組織將單核細(xì)胞增生李斯特氏菌列為僅次于大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌的世界第四大食源性病原菌[2]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是胞內(nèi)致病菌，易交叉污染[3]，感染后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的癥狀[4-6]。感染李斯特氏菌的嬰幼兒會(huì)患上腦膜炎、敗血癥等，被感染的孕婦則會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)或死胎的癥狀[7]。調(diào)查顯示，我國(guó)各地均存在程度不同的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染食品的情況[8-13]。

傳統(tǒng)檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的方法過(guò)程繁瑣、檢驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)于一些菌含量較少的樣品不易檢出，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果[14]。免疫學(xué)的檢測(cè)方法比較繁瑣，而且抗體的獲取需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作[15]。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的不斷發(fā)展，各種分子生物學(xué)檢測(cè)方法逐漸建立起來(lái)，主要是以變溫核酸擴(kuò)增技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[16]、實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）[17]為代表的定性和定量檢測(cè)方法，需要較昂貴的溫度循環(huán)控制設(shè)備PCR儀和特別昂貴的real-time PCR儀，限制了其在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)中的推廣和應(yīng)用。此外，還存在因擴(kuò)增效率不高導(dǎo)致的靈敏度較低等問(wèn)題。為了解決這些問(wèn)題，人們發(fā)明了無(wú)需昂貴的擴(kuò)增儀器、擴(kuò)增效率較高的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。Lizardi等[18]建立了滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（rolling circle amplification，RCA）檢測(cè)人類基因組DNA中的點(diǎn)突變，并得到了一定的應(yīng)用[19-20]。近年來(lái)，RCA技術(shù)在食品病原菌的檢測(cè)中得到了一定發(fā)展[21]，但RCA要求模板為環(huán)狀DNA，若擴(kuò)增線性DNA，需要鎖式探針和連接酶，操作步驟繁瑣、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、成本很高，因此限制了RCA技術(shù)的推廣。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BstDNA聚合酶擴(kuò)增DNA的一種新特性，該酶在一對(duì)引物的作用下，通過(guò)添加堿基的方式跨越靶序列兩端的缺口，形成非閉合環(huán)狀DNA，并進(jìn)行開環(huán)式的滾環(huán)擴(kuò)增，完成對(duì)線性DNA的擴(kuò)增，以此為基礎(chǔ)，與熒光染料相結(jié)合，采用可視化跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增（saltatory rolling circle amplification，SRCA）技術(shù)。SRCA擴(kuò)增原理如圖1所示，預(yù)變性后雙鏈DNA變成單鏈DNA，由于單鏈DNA自身結(jié)構(gòu)形成非閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在60～65 ℃，正向引物（forward primer，F(xiàn)WP）結(jié)合到模板上互補(bǔ)的位置。然后，F(xiàn)WP在BstDNA聚合酶的作用下進(jìn)行擴(kuò)增（步驟（4））。當(dāng)FWP沿模板的3’末端擴(kuò)增到5’末端，在BstDNA聚合酶的作用下不依賴模板添加一個(gè)或多個(gè)堿基跨過(guò)缺口[22]，同時(shí)置換先前合成的DNA鏈（步驟（5）、（6））。隨著單鏈DNA延伸，反向引物（reverse primer，RVP）的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)暴露，RVP結(jié)合到目標(biāo)單鏈DNA上在BstDNA聚合酶的作用下繼續(xù)擴(kuò)增（步驟（7）、（8））。之前的擴(kuò)增產(chǎn)物被不斷置換下來(lái)（步驟（9））。FWP與相應(yīng)的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合并進(jìn)行鏈的延伸，周而復(fù)始，最終形成由大量不同長(zhǎng)度的線性雙鏈DNA組成的產(chǎn)物（步驟（10）、（11））。

圖1 SRCA反應(yīng)原理圖Fig. 1 Schematic diagram of the SRCA assay

SRCA只需要利用一對(duì)引物即可實(shí)現(xiàn)線狀DNA的擴(kuò)增，不需要鎖式探針和連接酶，而是利用線狀模板的自身結(jié)構(gòu)與BstDNA聚合酶的特性進(jìn)行反應(yīng)。與RCA相比，SRCA操作大大簡(jiǎn)化，成本降低約90%，耗時(shí)縮短3 h以上，突破了滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用的瓶頸。

本研究以hlyA基因?yàn)榘谢?，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選出了一對(duì)適宜的引物，建立一種檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的新型滾環(huán)擴(kuò)增方法，即可視化SRCA，并對(duì)此方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為開發(fā)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌SRCA檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)，為食品中致病菌的快速檢測(cè)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本研究所用菌株如表1所示。

表1 本研究所用菌種Table 1 Bacterial strains used in this study

1.1.2 試劑

細(xì)菌DNA提取試劑盒、BstDNA聚合酶（Large fragment）、SYBR Green I熒光染料、DraI限制性核酸內(nèi)切酶 大連寶生物工程有限公司；TaqDNA聚合酶、Easypure?Quick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、基因克隆T3載體試劑盒、100 bp DNA Ladder、dNTPs 北京全式金生物技術(shù)有限公司；1%鹽酸吖啶黃溶液、1%萘啶酮酸鈉鹽溶液、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化鑒定試劑盒、異丙醇、無(wú)水乙醇 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2720 Thermal cycler核酸擴(kuò)增儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠；BILON-08無(wú)菌均質(zhì)器 西安比朗生物科技有限公司；BINDA 2020D凝膠成像儀 北京賓達(dá)英創(chuàng)有限公司；NanoDrop 2000分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司；BSC-1500IIB2-X生物安全柜 鑫貝西Biobase公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

hlyA基因的序列具有高度保守性[23]，本研究選取hlyA基因?yàn)閱魏思?xì)胞增生李斯特氏菌的靶基因，根據(jù)GenBank公布的hlyA基因序列進(jìn)行BLAST同源性分析，利用DNAMAMN和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由北京華大公司合成引物，具體引物序列如表2所示。

表2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌hlyA基因的引物Table 2 Primers used for amplification of hlyA gene in L. monocytogenes

1.3.2 細(xì)菌的培養(yǎng)與DNA提取

將保存的各菌株（表1）接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)，挑取單菌落接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，備用。

培養(yǎng)菌液采用試劑盒法提取基因組DNA。通過(guò)Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定基因組濃度。

1.3.3 SRCA和PCR體系

優(yōu)化建立最佳的SRCA擴(kuò)增體系：5 μL dNTPs（4 種均為2.5 mmol/L），2.5 μL Mg2+（20 mmol/L），2 μL 10×ThermoPol buffer，1 μL上游引物（10 μmol/L），1 μL下游引物（10 μmol/L），1 μL模板DNA（陰性對(duì)照不添加模板），1 μLBstDNA聚合酶（320 U/mL），無(wú)菌去離子水補(bǔ)足體系至20 μL。94 ℃預(yù)變性3 min，冰浴2 min；然后62 ℃反應(yīng)60 min；最后80 ℃反應(yīng)5 min，反應(yīng)停止。

為評(píng)估SRCA方法的靈敏度和檢出限，本研究同時(shí)應(yīng)用了PCR方法。其反應(yīng)體系（25 μL）如下：2×EasyTaqPCR Super Mix 11.0 μL，正反向引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，剩余體積由無(wú)菌去離子水補(bǔ)足。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s（變性-退火-延伸，25 個(gè)循環(huán)），72 ℃再延伸45 s終止。

1.3.4 SRCA產(chǎn)物可視化分析

向SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1 μL熒光染料SYBR Green I，直接肉眼觀察顏色變化，進(jìn)行可視化分析。

1.3.5 SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析和酶切分析

選取典型的梯形條帶，自最小片段起依次切取4 個(gè)條帶進(jìn)行膠回收，反應(yīng)產(chǎn)物純化測(cè)序。為進(jìn)一步驗(yàn)證SRCA產(chǎn)物是否為目的條帶，本實(shí)驗(yàn)采用DraI限制性內(nèi)切酶對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證，在37 ℃反應(yīng)2.5 h。反應(yīng)完成后進(jìn)行凝膠電泳，以觀察酶切結(jié)果。

1.3.6 SRCA引物特異性分析

為驗(yàn)證本研究中引物在SRCA反應(yīng)中的特異性，共對(duì)52 株菌株進(jìn)行分析，其中包括2 株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，10 株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌株（實(shí)驗(yàn)室分離菌株）及40 株非單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌株（表1），并通過(guò)熒光可視法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3.7 SRCA靈敏度分析

為評(píng)估SRCA檢測(cè)純菌DNA的靈敏度，取上述過(guò)夜培養(yǎng)的純菌液1 mL提取模板DNA，并用無(wú)菌去離子水進(jìn)行10 倍梯度稀釋，進(jìn)行擴(kuò)增后，通過(guò)熒光可視法進(jìn)行分析，確定SRCA反應(yīng)的靈敏度。同時(shí)以PCR檢測(cè)方法為對(duì)照，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，確定PCR的靈敏度。

純菌液經(jīng)Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)量濃度為8.9×107fg/μL。

1.3.8 SRCA人工污染涼拌菜中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出限分析

稱取經(jīng)驗(yàn)證未受到單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染的涼菜25 g，加入單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LB1增菌液中均質(zhì)，取過(guò)夜培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CMCC 54001）的純菌液1 mL，加入含有9 mL均質(zhì)液的試管中，吹吸混勻，然后進(jìn)行10 倍梯度的連續(xù)稀釋。每個(gè)稀釋度菌懸液均取1 mL，提取基因組DNA，SRCA方法擴(kuò)增，通過(guò)熒光可視化法確定SRCA方法的檢出限。

以PCR方法為對(duì)照，通過(guò)凝膠電泳法確定PCR方法的檢出限。

與此同時(shí)，另取1 mL上述純菌液，用0.85%的生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度的連續(xù)稀釋，每個(gè)稀釋度各取1 mL加入李斯特氏菌顯色平板，36 ℃培養(yǎng)48 h，記錄單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽(yáng)性菌落數(shù)。根據(jù)平板計(jì)數(shù)法獲得人工污染的涼拌菜中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌濃度范圍2.8×108～2.8×10-1CFU/mL。

1.3.9 SRCA方法的實(shí)際應(yīng)用與評(píng)估

為檢驗(yàn)SRCA方法對(duì)實(shí)際樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出情況，在當(dāng)?shù)馗鞔蟪屑笆袌?chǎng)隨機(jī)購(gòu)買70 份易被單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染的樣品，包括成品果蔬22 種、生食果蔬23 種、豆制品6 種、熟肉制品13 種、其他類型6 種，利用GB 4789.30—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》[24]、PCR及SRCA 3 種方法對(duì)以上樣品進(jìn)行檢測(cè)。

以GB 4789.30—2016檢測(cè)結(jié)果為基準(zhǔn)，采用敏感性、特異性及符合率3 個(gè)指標(biāo)對(duì)SRCA方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。計(jì)算公式[25-28]如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光可視化法觀察SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物

SRCA反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)管中加入1 μL的熒光染料SYBR Green I，結(jié)果如圖2所示。添加了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的陽(yáng)性反應(yīng)管1顏色由橙色變?yōu)榫G色，而陰性對(duì)照2仍為橙色。

圖2 SRCA熒光可視化結(jié)果Fig. 2 Visual results of the SRCA products

2.2 SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序和酶切結(jié)果分析

如圖3A所示，SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)DraI限制性內(nèi)切酶切消化后，其酶切片段為109 bp左右，與理論計(jì)算值一致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SRCA產(chǎn)物，對(duì)圖3A中的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶（1～4）進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果如圖3B所示，發(fā)現(xiàn)SRCA的反應(yīng)產(chǎn)物含有多個(gè)重復(fù)的特異性靶序列，且隨著靶序列拷貝數(shù)目增加，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度隨之增加。利用兩條具有特異性的引物，通過(guò)SRCA反應(yīng)可以特異性的擴(kuò)增目的片段，因此，可以驗(yàn)證本研究中建立的SRCA方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌原理的正確性。

圖3 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌SRCA反應(yīng)的酶切和測(cè)序結(jié)果分析Fig. 3 Enzymatic digestion and sequencing analysis of the SRCA products of L. monocytogenes

2.3 SRCA方法的特異性

本研究針對(duì)52 株菌株進(jìn)行特異性分析，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。其中，12 株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌發(fā)生了SRCA反應(yīng)，而其他40 株非單核細(xì)胞增生李斯特氏菌均未發(fā)生SRCA反應(yīng)。說(shuō)明該引物具有良好的特異性。SRCA檢測(cè)方法的特異性取決于引物的設(shè)計(jì)和篩選，需要從設(shè)計(jì)出的大量引物中通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選出一對(duì)合適的引物，這也是本研究的難點(diǎn)。

圖4 SRCA特異性分析Fig. 4 Specificity of SRCA evaluated by fluorescence staining

2.4 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌純培養(yǎng)的靈敏度

以1.3.7節(jié)中提取的基因組DNA作為模板進(jìn)行SRCA反應(yīng)，向得到的反應(yīng)產(chǎn)物中添加1 μL熒光染料SYBR Green I。如圖5A所示，在模板DNA質(zhì)量濃度范圍為8.9×107～8.9×100fg/μL時(shí)，反應(yīng)管中出現(xiàn)綠色，質(zhì)量濃度小于8.9×100fg/μL時(shí)仍然為橙色，因此，SRCA熒光可視法基因組靈敏度為8.9×100fg/μL。

用相同的模板進(jìn)行PCR，得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。如圖5B所示，在模板DNA質(zhì)量濃度范圍為8.9×107～8.9×103fg/μL時(shí)，出現(xiàn)了陽(yáng)性擴(kuò)增條帶，因此，PCR方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌基因組的靈敏度為8.9×103fg/μL。

圖5 SRCA方法（A）和PCR方法（B）檢測(cè)的靈敏度Fig. 5 Sensitivity of SRCA (A) and PCR (B)

由此可知，SRCA方法檢測(cè)的靈敏度是PCR方法檢測(cè)靈敏度的1 000 倍。

2.5 人工污染涼拌菜單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出限

利用SRCA和PCR方法對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株污染的涼拌菜進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。圖6A反映了SRCA方法的檢測(cè)結(jié)果，當(dāng)人工污染的涼拌菜中菌濃度為2.8×108～2.8×100CFU/g時(shí)，反應(yīng)管中出現(xiàn)綠色，當(dāng)濃度為2.8×10-1CFU/g時(shí)反應(yīng)管中的顏色依然為橙色。因此，SRCA熒光可視法檢出限為2.8×100CFU/g。

圖6 SRCA（A）和PCR（B）方法檢出限Fig. 6 Detection limits of SRCA (A) and PCR (B)

圖6B反映了PCR方法檢測(cè)的結(jié)果，當(dāng)人工污染的涼拌菜中菌濃度為2.8×108～2.8×103CFU/g時(shí)，出現(xiàn)了陽(yáng)性擴(kuò)增條帶，菌濃度小于2.8×103CFU/g時(shí)未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，因此，PCR方法檢測(cè)人工污染涼拌菜中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出限為2.8×103CFU/g。

由此可知，SRCA方法的檢出限是傳統(tǒng)PCR方法檢出限的1/1 000。

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)與SRCA方法的評(píng)估

利用GB 4789.30—2016、PCR和SRCA三種方法對(duì)70 份食品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表3。SRCA和PCR方法均會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，主要原因在于檢測(cè)過(guò)程中無(wú)法區(qū)別死菌和活菌，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法不能檢測(cè)出死菌和不可培養(yǎng)狀態(tài)的菌株（viable but non-culturable，VBNC），而其DNA在SRCA和PCR方法中卻可擴(kuò)增，即通過(guò)SRCA和PCR方法可以檢測(cè)到死菌及VBNC狀態(tài)的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。除此之外，由于SRCA方法檢測(cè)的靈敏度更高，因此出現(xiàn)的假陽(yáng)性數(shù)量比PCR方法多。

表3 SRCA方法評(píng)價(jià)Table 3 Evaluation of the SRCA method

3 結(jié) 論

本研究篩選出了一對(duì)適宜的引物，成功建立了SRCA快速檢測(cè)食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的方法，并通過(guò)肉眼觀察熒光判斷結(jié)果，方便簡(jiǎn)單。利用SRCA技術(shù)對(duì)12 株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和40 株非單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行特異性檢測(cè)，其中12 株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌顯示為陽(yáng)性，其他均顯示陰性結(jié)果，證明該方法具有較好的特異性。SRCA技術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的靈敏度為8.9×100fg/μL，是傳統(tǒng)PCR方法的1 000 倍，人工污染涼拌菜樣品中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢出限為2.8×100CFU/g，是傳統(tǒng)PCR方法的1/1 000，因此SRCA技術(shù)具有更高的靈敏度和更低的檢出限。使用GB 4789.30—2016法、PCR和SRCA法對(duì)70 種實(shí)際樣品進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)，并以GB 4789.30—2016法為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)SRCA方法進(jìn)行評(píng)估，其敏感性為100%，特異性為97.01%，符合率為97.14%。

本研究建立的SRCA方法用于檢測(cè)食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)切實(shí)可行，SRCA方法具有操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間、成本低廉、靈敏度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)勢(shì)。說(shuō)明SRCA方法非常適合在中小型企業(yè)和基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)以及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中推廣應(yīng)用。在后期的研究中，SRCA方法可與疊氮溴化丙錠[29]、疊氮溴化乙錠等結(jié)合，區(qū)分死活菌，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性。開發(fā)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌SRCA檢測(cè)試劑盒，大力推廣該技術(shù)。