苑 寧,張?zhí)N哲,張海娟,于 澤,盧 鑫,張 偉,,3,*
(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院,河北 滄州 061100;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北 保定 071000;3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071000)
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)能引起人類患病[1]。世界衛(wèi)生組織將單核細(xì)胞增生李斯特氏菌列為僅次于大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌的世界第四大食源性病原菌[2]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是胞內(nèi)致病菌,易交叉污染[3],感染后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的癥狀[4-6]。感染李斯特氏菌的嬰幼兒會(huì)患上腦膜炎、敗血癥等,被感染的孕婦則會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)或死胎的癥狀[7]。調(diào)查顯示,我國(guó)各地均存在程度不同的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染食品的情況[8-13]。
傳統(tǒng)檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的方法過(guò)程繁瑣、檢驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng),對(duì)于一些菌含量較少的樣品不易檢出,容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果[14]。免疫學(xué)的檢測(cè)方法比較繁瑣,而且抗體的獲取需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作[15]。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的不斷發(fā)展,各種分子生物學(xué)檢測(cè)方法逐漸建立起來(lái),主要是以變溫核酸擴(kuò)增技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)[16]、實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)[17]為代表的定性和定量檢測(cè)方法,需要較昂貴的溫度循環(huán)控制設(shè)備PCR儀和特別昂貴的real-time PCR儀,限制了其在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)中的推廣和應(yīng)用。此外,還存在因擴(kuò)增效率不高導(dǎo)致的靈敏度較低等問(wèn)題。為了解決這些問(wèn)題,人們發(fā)明了無(wú)需昂貴的擴(kuò)增儀器、擴(kuò)增效率較高的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。Lizardi等[18]建立了滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification,RCA)檢測(cè)人類基因組DNA中的點(diǎn)突變,并得到了一定的應(yīng)用[19-20]。近年來(lái),RCA技術(shù)在食品病原菌的檢測(cè)中得到了一定發(fā)展[21],但RCA要求模板為環(huán)狀DNA,若擴(kuò)增線性DNA,需要鎖式探針和連接酶,操作步驟繁瑣、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、成本很高,因此限制了RCA技術(shù)的推廣。
本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BstDNA聚合酶擴(kuò)增DNA的一種新特性,該酶在一對(duì)引物的作用下,通過(guò)添加堿基的方式跨越靶序列兩端的缺口,形成非閉合環(huán)狀DNA,并進(jìn)行開環(huán)式的滾環(huán)擴(kuò)增,完成對(duì)線性DNA的擴(kuò)增,以此為基礎(chǔ),與熒光染料相結(jié)合,采用可視化跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)技術(shù)。SRCA擴(kuò)增原理如圖1所示,預(yù)變性后雙鏈DNA變成單鏈DNA,由于單鏈DNA自身結(jié)構(gòu)形成非閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu),在60~65 ℃,正向引物(forward primer,F(xiàn)WP)結(jié)合到模板上互補(bǔ)的位置。然后,F(xiàn)WP在BstDNA聚合酶的作用下進(jìn)行擴(kuò)增(步驟(4))。當(dāng)FWP沿模板的3’末端擴(kuò)增到5’末端,在BstDNA聚合酶的作用下不依賴模板添加一個(gè)或多個(gè)堿基跨過(guò)缺口[22],同時(shí)置換先前合成的DNA鏈(步驟(5)、(6))。隨著單鏈DNA延伸,反向引物(reverse primer,RVP)的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)暴露,RVP結(jié)合到目標(biāo)單鏈DNA上在BstDNA聚合酶的作用下繼續(xù)擴(kuò)增(步驟(7)、(8))。之前的擴(kuò)增產(chǎn)物被不斷置換下來(lái)(步驟(9))。FWP與相應(yīng)的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合并進(jìn)行鏈的延伸,周而復(fù)始,最終形成由大量不同長(zhǎng)度的線性雙鏈DNA組成的產(chǎn)物(步驟(10)、(11))。
圖1 SRCA反應(yīng)原理圖Fig. 1 Schematic diagram of the SRCA assay
SRCA只需要利用一對(duì)引物即可實(shí)現(xiàn)線狀DNA的擴(kuò)增,不需要鎖式探針和連接酶,而是利用線狀模板的自身結(jié)構(gòu)與BstDNA聚合酶的特性進(jìn)行反應(yīng)。與RCA相比,SRCA操作大大簡(jiǎn)化,成本降低約90%,耗時(shí)縮短3 h以上,突破了滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用的瓶頸。
本研究以hlyA基因?yàn)榘谢?,通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選出了一對(duì)適宜的引物,建立一種檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的新型滾環(huán)擴(kuò)增方法,即可視化SRCA,并對(duì)此方法進(jìn)行評(píng)價(jià),旨在為開發(fā)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌SRCA檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ),為食品中致病菌的快速檢測(cè)提供新的思路。
1.1.1 菌株
本研究所用菌株如表1所示。
表1 本研究所用菌種Table 1 Bacterial strains used in this study
1.1.2 試劑
細(xì)菌DNA提取試劑盒、BstDNA聚合酶(Large fragment)、SYBR Green I熒光染料、DraI限制性核酸內(nèi)切酶 大連寶生物工程有限公司;TaqDNA聚合酶、Easypure?Quick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、基因克隆T3載體試劑盒、100 bp DNA Ladder、dNTPs 北京全式金生物技術(shù)有限公司;1%鹽酸吖啶黃溶液、1%萘啶酮酸鈉鹽溶液、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化鑒定試劑盒、異丙醇、無(wú)水乙醇 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。以上試劑均為分析純。
2720 Thermal cycler核酸擴(kuò)增儀 美國(guó)Applied Biosystems公司;DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠;BILON-08無(wú)菌均質(zhì)器 西安比朗生物科技有限公司;BINDA 2020D凝膠成像儀 北京賓達(dá)英創(chuàng)有限公司;NanoDrop 2000分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司;BSC-1500IIB2-X生物安全柜 鑫貝西Biobase公司。
1.3.1 引物設(shè)計(jì)
hlyA基因的序列具有高度保守性[23],本研究選取hlyA基因?yàn)閱魏思?xì)胞增生李斯特氏菌的靶基因,根據(jù)GenBank公布的hlyA基因序列進(jìn)行BLAST同源性分析,利用DNAMAMN和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,并由北京華大公司合成引物,具體引物序列如表2所示。
表2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌hlyA基因的引物Table 2 Primers used for amplification of hlyA gene in L. monocytogenes
1.3.2 細(xì)菌的培養(yǎng)與DNA提取
將保存的各菌株(表1)接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),再轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng),挑取單菌落接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),備用。
培養(yǎng)菌液采用試劑盒法提取基因組DNA。通過(guò)Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定基因組濃度。
1.3.3 SRCA和PCR體系
優(yōu)化建立最佳的SRCA擴(kuò)增體系:5 μL dNTPs(4 種均為2.5 mmol/L),2.5 μL Mg2+(20 mmol/L),2 μL 10×ThermoPol buffer,1 μL上游引物(10 μmol/L),1 μL下游引物(10 μmol/L),1 μL模板DNA(陰性對(duì)照不添加模板),1 μLBstDNA聚合酶(320 U/mL),無(wú)菌去離子水補(bǔ)足體系至20 μL。94 ℃預(yù)變性3 min,冰浴2 min;然后62 ℃反應(yīng)60 min;最后80 ℃反應(yīng)5 min,反應(yīng)停止。
為評(píng)估SRCA方法的靈敏度和檢出限,本研究同時(shí)應(yīng)用了PCR方法。其反應(yīng)體系(25 μL)如下:2×EasyTaqPCR Super Mix 11.0 μL,正反向引物各1.0 μL,DNA模板1.0 μL,剩余體積由無(wú)菌去離子水補(bǔ)足。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s(變性-退火-延伸,25 個(gè)循環(huán)),72 ℃再延伸45 s終止。
1.3.4 SRCA產(chǎn)物可視化分析
向SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1 μL熒光染料SYBR Green I,直接肉眼觀察顏色變化,進(jìn)行可視化分析。
1.3.5 SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析和酶切分析
選取典型的梯形條帶,自最小片段起依次切取4 個(gè)條帶進(jìn)行膠回收,反應(yīng)產(chǎn)物純化測(cè)序。為進(jìn)一步驗(yàn)證SRCA產(chǎn)物是否為目的條帶,本實(shí)驗(yàn)采用DraI限制性內(nèi)切酶對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證,在37 ℃反應(yīng)2.5 h。反應(yīng)完成后進(jìn)行凝膠電泳,以觀察酶切結(jié)果。
1.3.6 SRCA引物特異性分析
為驗(yàn)證本研究中引物在SRCA反應(yīng)中的特異性,共對(duì)52 株菌株進(jìn)行分析,其中包括2 株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株,10 株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌株(實(shí)驗(yàn)室分離菌株)及40 株非單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌株(表1),并通過(guò)熒光可視法進(jìn)行結(jié)果分析。
1.3.7 SRCA靈敏度分析
為評(píng)估SRCA檢測(cè)純菌DNA的靈敏度,取上述過(guò)夜培養(yǎng)的純菌液1 mL提取模板DNA,并用無(wú)菌去離子水進(jìn)行10 倍梯度稀釋,進(jìn)行擴(kuò)增后,通過(guò)熒光可視法進(jìn)行分析,確定SRCA反應(yīng)的靈敏度。同時(shí)以PCR檢測(cè)方法為對(duì)照,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析,確定PCR的靈敏度。
純菌液經(jīng)Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)量濃度為8.9×107fg/μL。
1.3.8 SRCA人工污染涼拌菜中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出限分析
稱取經(jīng)驗(yàn)證未受到單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染的涼菜25 g,加入單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LB1增菌液中均質(zhì),取過(guò)夜培養(yǎng)的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CMCC 54001)的純菌液1 mL,加入含有9 mL均質(zhì)液的試管中,吹吸混勻,然后進(jìn)行10 倍梯度的連續(xù)稀釋。每個(gè)稀釋度菌懸液均取1 mL,提取基因組DNA,SRCA方法擴(kuò)增,通過(guò)熒光可視化法確定SRCA方法的檢出限。
以PCR方法為對(duì)照,通過(guò)凝膠電泳法確定PCR方法的檢出限。
與此同時(shí),另取1 mL上述純菌液,用0.85%的生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度的連續(xù)稀釋,每個(gè)稀釋度各取1 mL加入李斯特氏菌顯色平板,36 ℃培養(yǎng)48 h,記錄單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽(yáng)性菌落數(shù)。根據(jù)平板計(jì)數(shù)法獲得人工污染的涼拌菜中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌濃度范圍2.8×108~2.8×10-1CFU/mL。
1.3.9 SRCA方法的實(shí)際應(yīng)用與評(píng)估
為檢驗(yàn)SRCA方法對(duì)實(shí)際樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出情況,在當(dāng)?shù)馗鞔蟪屑笆袌?chǎng)隨機(jī)購(gòu)買70 份易被單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染的樣品,包括成品果蔬22 種、生食果蔬23 種、豆制品6 種、熟肉制品13 種、其他類型6 種,利用GB 4789.30—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》[24]、PCR及SRCA 3 種方法對(duì)以上樣品進(jìn)行檢測(cè)。
以GB 4789.30—2016檢測(cè)結(jié)果為基準(zhǔn),采用敏感性、特異性及符合率3 個(gè)指標(biāo)對(duì)SRCA方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。計(jì)算公式[25-28]如下:
SRCA反應(yīng)結(jié)束后,向反應(yīng)管中加入1 μL的熒光染料SYBR Green I,結(jié)果如圖2所示。添加了單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的陽(yáng)性反應(yīng)管1顏色由橙色變?yōu)榫G色,而陰性對(duì)照2仍為橙色。
圖2 SRCA熒光可視化結(jié)果Fig. 2 Visual results of the SRCA products
如圖3A所示,SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)DraI限制性內(nèi)切酶切消化后,其酶切片段為109 bp左右,與理論計(jì)算值一致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SRCA產(chǎn)物,對(duì)圖3A中的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶(1~4)進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果如圖3B所示,發(fā)現(xiàn)SRCA的反應(yīng)產(chǎn)物含有多個(gè)重復(fù)的特異性靶序列,且隨著靶序列拷貝數(shù)目增加,產(chǎn)物片段長(zhǎng)度隨之增加。利用兩條具有特異性的引物,通過(guò)SRCA反應(yīng)可以特異性的擴(kuò)增目的片段,因此,可以驗(yàn)證本研究中建立的SRCA方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌原理的正確性。
圖3 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌SRCA反應(yīng)的酶切和測(cè)序結(jié)果分析Fig. 3 Enzymatic digestion and sequencing analysis of the SRCA products of L. monocytogenes
本研究針對(duì)52 株菌株進(jìn)行特異性分析,檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。其中,12 株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌發(fā)生了SRCA反應(yīng),而其他40 株非單核細(xì)胞增生李斯特氏菌均未發(fā)生SRCA反應(yīng)。說(shuō)明該引物具有良好的特異性。SRCA檢測(cè)方法的特異性取決于引物的設(shè)計(jì)和篩選,需要從設(shè)計(jì)出的大量引物中通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選出一對(duì)合適的引物,這也是本研究的難點(diǎn)。
圖4 SRCA特異性分析Fig. 4 Specificity of SRCA evaluated by fluorescence staining
以1.3.7節(jié)中提取的基因組DNA作為模板進(jìn)行SRCA反應(yīng),向得到的反應(yīng)產(chǎn)物中添加1 μL熒光染料SYBR Green I。如圖5A所示,在模板DNA質(zhì)量濃度范圍為8.9×107~8.9×100fg/μL時(shí),反應(yīng)管中出現(xiàn)綠色,質(zhì)量濃度小于8.9×100fg/μL時(shí)仍然為橙色,因此,SRCA熒光可視法基因組靈敏度為8.9×100fg/μL。
用相同的模板進(jìn)行PCR,得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。如圖5B所示,在模板DNA質(zhì)量濃度范圍為8.9×107~8.9×103fg/μL時(shí),出現(xiàn)了陽(yáng)性擴(kuò)增條帶,因此,PCR方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌基因組的靈敏度為8.9×103fg/μL。
圖5 SRCA方法(A)和PCR方法(B)檢測(cè)的靈敏度Fig. 5 Sensitivity of SRCA (A) and PCR (B)
由此可知,SRCA方法檢測(cè)的靈敏度是PCR方法檢測(cè)靈敏度的1 000 倍。
利用SRCA和PCR方法對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株污染的涼拌菜進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖6所示。圖6A反映了SRCA方法的檢測(cè)結(jié)果,當(dāng)人工污染的涼拌菜中菌濃度為2.8×108~2.8×100CFU/g時(shí),反應(yīng)管中出現(xiàn)綠色,當(dāng)濃度為2.8×10-1CFU/g時(shí)反應(yīng)管中的顏色依然為橙色。因此,SRCA熒光可視法檢出限為2.8×100CFU/g。
圖6 SRCA(A)和PCR(B)方法檢出限Fig. 6 Detection limits of SRCA (A) and PCR (B)
圖6B反映了PCR方法檢測(cè)的結(jié)果,當(dāng)人工污染的涼拌菜中菌濃度為2.8×108~2.8×103CFU/g時(shí),出現(xiàn)了陽(yáng)性擴(kuò)增條帶,菌濃度小于2.8×103CFU/g時(shí)未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,因此,PCR方法檢測(cè)人工污染涼拌菜中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出限為2.8×103CFU/g。
由此可知,SRCA方法的檢出限是傳統(tǒng)PCR方法檢出限的1/1 000。
利用GB 4789.30—2016、PCR和SRCA三種方法對(duì)70 份食品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見表3。SRCA和PCR方法均會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性,主要原因在于檢測(cè)過(guò)程中無(wú)法區(qū)別死菌和活菌,傳統(tǒng)培養(yǎng)方法不能檢測(cè)出死菌和不可培養(yǎng)狀態(tài)的菌株(viable but non-culturable,VBNC),而其DNA在SRCA和PCR方法中卻可擴(kuò)增,即通過(guò)SRCA和PCR方法可以檢測(cè)到死菌及VBNC狀態(tài)的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。除此之外,由于SRCA方法檢測(cè)的靈敏度更高,因此出現(xiàn)的假陽(yáng)性數(shù)量比PCR方法多。
表3 SRCA方法評(píng)價(jià)Table 3 Evaluation of the SRCA method
本研究篩選出了一對(duì)適宜的引物,成功建立了SRCA快速檢測(cè)食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的方法,并通過(guò)肉眼觀察熒光判斷結(jié)果,方便簡(jiǎn)單。利用SRCA技術(shù)對(duì)12 株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和40 株非單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行特異性檢測(cè),其中12 株單核細(xì)胞增生李斯特氏菌顯示為陽(yáng)性,其他均顯示陰性結(jié)果,證明該方法具有較好的特異性。SRCA技術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的靈敏度為8.9×100fg/μL,是傳統(tǒng)PCR方法的1 000 倍,人工污染涼拌菜樣品中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢出限為2.8×100CFU/g,是傳統(tǒng)PCR方法的1/1 000,因此SRCA技術(shù)具有更高的靈敏度和更低的檢出限。使用GB 4789.30—2016法、PCR和SRCA法對(duì)70 種實(shí)際樣品進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè),并以GB 4789.30—2016法為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)SRCA方法進(jìn)行評(píng)估,其敏感性為100%,特異性為97.01%,符合率為97.14%。
本研究建立的SRCA方法用于檢測(cè)食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)切實(shí)可行,SRCA方法具有操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間、成本低廉、靈敏度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)勢(shì)。說(shuō)明SRCA方法非常適合在中小型企業(yè)和基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)以及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中推廣應(yīng)用。在后期的研究中,SRCA方法可與疊氮溴化丙錠[29]、疊氮溴化乙錠等結(jié)合,區(qū)分死活菌,進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性。開發(fā)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌SRCA檢測(cè)試劑盒,大力推廣該技術(shù)。