王光宇，邱偉芬，徐幸蓮，周光宏

（1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

肉品腐敗變質(zhì)導(dǎo)致了全世界范圍大量的食品浪費(fèi)，了解肉品中常見腐敗微生物并探明其致腐機(jī)制是有效控制肉品腐敗的前提[1]。假單胞菌（Pseudomonasspp.）能夠?qū)е掠醒鮾?chǔ)藏條件下肉類的腐敗，主要表現(xiàn)在使肉品組織軟化、產(chǎn)黏和產(chǎn)生異味[2-4]。其中莓實(shí)假單胞菌（P. fragi）是肉品中最常見的假單胞菌，尤其是有氧儲(chǔ)藏條件下的冷鮮肉[1]。從屠宰場(chǎng)一直到市場(chǎng)的冷鏈環(huán)境中，該菌均能大量生長并且分泌多種胞外酶[5-7]。目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道莓實(shí)假單胞菌是有氧條件下冷鮮牛肉[8-9]、禽肉[10-11]和海產(chǎn)品[12]中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，且隨著時(shí)間的推移，莓實(shí)假單胞菌的優(yōu)勢(shì)地位更加明顯[13-14]。

在本團(tuán)隊(duì)前期研究中，將從屠宰場(chǎng)與超市采集的黃羽肉雞樣品在冷藏條件下存放至腐敗，從腐敗樣品中分離到1 株莓實(shí)假單胞菌NMC25，與實(shí)驗(yàn)組的其他腐敗菌相比，該分離株在體外具有較強(qiáng)的蛋白酶活性，進(jìn)行原位培養(yǎng)時(shí)生長速度較快，肉的揮發(fā)性鹽基氮值和pH值變化最為顯著，并伴有異味和產(chǎn)黏[15]。該分離株對(duì)冷鮮肉表現(xiàn)出較強(qiáng)的致腐能力，有必要針對(duì)其致腐機(jī)制進(jìn)行深入研究。

肉品的腐敗通常與腐敗菌的酶功能或代謝活動(dòng)相關(guān)，而這些腐敗菌在代謝活動(dòng)中的一系列表型變化又受到它們體內(nèi)諸多功能基因的操控。因此，首先需要掌握腐敗菌基因組的組成和功能信息，進(jìn)而明確這些基因在特定條件下的變化規(guī)律，才能深入了解這種腐敗菌的致腐機(jī)制。然而在本研究之前，莓實(shí)假單胞菌的全基因組完成圖序列僅公布了1 株極地環(huán)境下的分離株[16]，該環(huán)境分離株可能在基因組結(jié)構(gòu)組成和代謝活性等方面與肉源性強(qiáng)致腐莓實(shí)假單胞菌分離株存在很大不同，不利于進(jìn)一步深入研究莓實(shí)假單胞菌在肉品腐敗中的作用。

因此，本研究通過對(duì)冷鮮雞肉中分離到的強(qiáng)致腐莓實(shí)假單胞菌NMC25進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得其基因組的組成和功能信息，同時(shí)與其他常見假單胞菌進(jìn)行初步比較基因組分析，旨在深入了解莓實(shí)假單胞菌的基因功能與代謝特征，為明確其致腐機(jī)制、開發(fā)針對(duì)性保鮮技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株莓實(shí)假單胞菌NMC25分離自腐敗的冷鮮雞肉；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP302 天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

B1-150A生化培養(yǎng)箱 施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；HVE-50高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；BCM-1600A超凈工作臺(tái) 蘇州安泰AIRTECH公司；J2-MI高速冷凍離心機(jī) 美國Beckmen公司；Nano Drop 2000蛋白核酸微量定量儀 美國Thermo Scienific公司；DYCP-32B型瓊脂糖水平電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng)條件

將凍存于-80 ℃的莓實(shí)假單胞菌NMC25菌株在TSA平板上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，挑單菌落接種于TSB中進(jìn)行第2次活化。取二次活化的菌液再次接種到TSB中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)末期菌液備用。

1.3.2 細(xì)菌基因組提取

采用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期的菌液10 000×g離心1 min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2 次，收集菌體沉淀。向其中加入200 μL緩沖液GA重懸菌體，再加入220 μL緩沖液GB振蕩15 s，70 ℃放置10 min后加入220 μL無水乙醇振蕩15 s。將所得溶液和絮狀沉淀加到吸附柱CB3中，13 400×g離心30 s棄去收集管中廢液，加入500 μL緩沖液GD，相同條件離心后使用600 μL漂洗液PW漂洗2 次，棄去廢液后將吸附柱置于室溫晾干殘余漂洗液。將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，最后向吸附膜的中間部位懸空滴加200 μL Tris-EDTA洗脫緩沖液，室溫放置5 min后13 400×g離心2 min，將細(xì)菌基因組收集在離心管中。

1.3.3 細(xì)菌全基因組測(cè)序及基因功能注釋

提取好的細(xì)菌基因組使用NanoDrop 2000檢測(cè)純度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有無降解，使用Qubit熒光光度計(jì)檢測(cè)濃度與總量。DNA樣品檢測(cè)合格后采用三代測(cè)序PacBio RS II并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接組裝為1 條contig，0 個(gè)gap?；蚪M的完成圖測(cè)序在廣州基迪奧生物科技有限公司完成。測(cè)序完成后對(duì)測(cè)序產(chǎn)生的原始reads進(jìn)行評(píng)估，再通過過濾去掉長度小于100的reads，去掉平均質(zhì)量值小于0.80的reads得到高質(zhì)量的reads，然后進(jìn)行基因組的組裝和注釋。使用glimmer軟件對(duì)基因組進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，獲得基因組詳細(xì)的基因分布和結(jié)構(gòu)信息，隨后整合多個(gè)數(shù)據(jù)庫, 如Cluster of Orthologous Groups of proteins（COG）[17]、Gene Ontology（GO）[18]、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）[19]和Carbohydrate-Active Enzymes（CAZy）[20]等，通過序列比對(duì)進(jìn)行預(yù)測(cè)基因的功能注釋。

1.3.4 基因組共線性分析和進(jìn)化分析

選擇NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中已公布的幾種不同的假單胞菌，基于序列信息與NMC25進(jìn)行BLAST比對(duì)，參數(shù)E值設(shè)置為10-5，比對(duì)時(shí)查詢序列長度超過1 000 bp，序列一致性超過80%則認(rèn)為核苷酸序列同源。選擇菌株包括銅綠假單胞菌PAO1（P. aeruginosaPAO1，NCBI登錄號(hào)NC_002516.2）、惡臭假單胞菌KT2440（P. putidaKT2440，NCBI登錄號(hào)NC_002947.4）、熒光假單胞菌F113（P. fluorescensF113，NCBI登錄號(hào)NC_016830.1）、莓實(shí)假單胞菌P121（來源于極地環(huán)境，NCBI登錄號(hào)NZ_CP013861.1）和莓實(shí)假單胞菌NRRLB-727（來源未知，NCBI登錄號(hào)NZ_LT629783.1）。使用SVG將結(jié)果圖形化展示，利用MEGA 6通過鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。

最后將測(cè)得的NMC25基因組序列上傳至NCBI，獲得GenBank登錄號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組特征分析

莓實(shí)假單胞菌NMC25基因組完成圖信息公布在GenBank中，登錄號(hào)為NZ_CP021132.1。 NMC25基因組組裝為4 個(gè)Scaffold，包含1 個(gè)染色體和3 個(gè)質(zhì)粒，測(cè)得的總基因組大小為5.152 13 Mb，GC含量為59.21%。菌株基因組中包含4 725 個(gè)基因（染色體4 571 個(gè)，質(zhì)粒154 個(gè)），編碼區(qū)基因4 494 個(gè)（染色體4 366 個(gè)，質(zhì)粒128 個(gè)），結(jié)構(gòu)RNA 97 個(gè)（rRNA 25 個(gè)，tRNA 72 個(gè)）。

2.2 基因組功能注釋

2.2.1 COG注釋分析

COG是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫，將測(cè)定的序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)預(yù)測(cè)這些蛋白可能的功能并對(duì)其做功能分類統(tǒng)計(jì)。由圖1可知，在基因組的直系蛋白聚類分析中，除R（一般功能預(yù)測(cè)）蛋白之外，數(shù)量最多的是E（氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝）相關(guān)蛋白，數(shù)量超過了500 個(gè)；其次是T（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制）、P（無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝）和K（轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白），數(shù)量均超過了400 個(gè)；與氨基酸相比，碳水化合物和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝相關(guān)蛋白數(shù)量較少，均不超過200 個(gè)。

圖1 莓實(shí)假單胞菌NMC25基因組的COG功能分類Fig. 1 COG function classification of P. fragi NMC25 genome

2.2.2 GO注釋分析

使用BLAST2 GO軟件得到NMC25 基因組的GO功能注釋結(jié)果，選取基因數(shù)量最多的10 個(gè)GO功能分類見表1。GO總共有3 個(gè)大類，分別描述基因參與的生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞成分。在生物學(xué)過程分類中，參與代謝過程的基因數(shù)量最多，為1 921 個(gè)；在細(xì)胞成分分類中，與膜相關(guān)的基因數(shù)量最多，為679 個(gè)；在分子功能分類中則是催化活性基因數(shù)量最多，為1 899 個(gè)。整體來看，能夠參與細(xì)菌代謝過程和催化反應(yīng)的基因數(shù)量最多。

表1 莓實(shí)假單胞菌NMC25基因組的GO功能分類Table 1 GO terms of P. fragi NMC25 genome

2.2.3 KEGG注釋分析

KEGG是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中代謝途徑以及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫，利用KEGG 可以進(jìn)一步研究基因在生物學(xué)上的復(fù)雜行為。在NMC25基因組中共有1 474 個(gè)基因注釋到了KEGG通路中，從中選取數(shù)量最多的10 個(gè)通路展示，如表2所示。其中，富集到ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、雙組分系統(tǒng)、氨基酸合成和碳代謝通路的基因數(shù)量最多，分別為183、171、127 個(gè)和111 個(gè)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛存在于微生物體內(nèi)，在離子、單糖、氨基酸、磷脂、肽、多糖及蛋白質(zhì)等營養(yǎng)攝取的過程中扮演了重要的角色[21]；而雙組分系統(tǒng)可以調(diào)控氨基酸代謝和介導(dǎo)假單胞菌對(duì)外界環(huán)境的應(yīng)激響應(yīng)[22]。此外，參與鞭毛組裝、細(xì)菌分泌系統(tǒng)和氧化磷酸化相關(guān)通路的基因數(shù)量也較多。

表2 莓實(shí)假單胞菌NMC25基因組的KEGG注釋Table 2 KEGG pathways of P. fragi NMC25 genome

2.2.4 CAZy注釋分析

CAZy數(shù)據(jù)庫包括能催化碳水化合物降解、修飾以及生物合成的碳水化合物相關(guān)酶系家族。注釋結(jié)果顯示，在NMC25基因組中包含大量糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶，分別為1 528 個(gè)和1 324 個(gè)（圖2）。糖基轉(zhuǎn)移酶能夠催化活化的糖連接到不同受體分子上，例如參與細(xì)菌胞外多糖的生物合成[23]；糖苷水解酶作為糖類代謝的關(guān)鍵組分，能夠催化各種糖基化合物中糖苷鍵的水解。除此之外，糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶還與受體分子的糖基化有關(guān)[24]。而糖基化在膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)、穩(wěn)定及屏障等方面起到重要作用，有助于NMC25應(yīng)對(duì)外界的環(huán)境應(yīng)激。

圖2 莓實(shí)假單胞菌NMC25基因組的CAZy分類Fig. 2 CAZy classification of P. fragi NMC25 genome

2.3 共線性分析

一般來說，如果兩個(gè)物種之間的親緣關(guān)系很近，那么基因的序列和順序都會(huì)非常接近，這種現(xiàn)象稱為共線性現(xiàn)象[25]。共線性主要反映基因組間的結(jié)構(gòu)性變異，反映出基因組之間的編碼順序和結(jié)構(gòu)的同源性。從圖3可以看出，NMC25菌株與KT2440、F113和PAO1相比，基因組更小且存在共線性的序列比例均小于50%；對(duì)于另外兩株莓實(shí)假單胞菌，雖然在基因組內(nèi)部存在顛換現(xiàn)象，3 株莓實(shí)假單胞菌的基因組更為相似，其中NMC25菌株與NRRL B-727菌株有共線性的序列達(dá)到了90%以上，但與P121菌株的共線性不足70%。

圖3 莓實(shí)假單胞菌NMC25與惡臭假單胞菌KT2440（a）、熒光假單胞菌F113（b）、銅綠假單胞菌PAO1（c）、莓實(shí)假單胞菌NRRL B-727（d）和莓實(shí)假單胞菌P121（e）基因組共線性分析Fig. 3 Synteny analysis of genomes between P. putida KT2440 (a),P. fluorescens F113 (b), P. aeruginosa PAO1 (c), P. fragi NRRL B-727 (d),P. fragi P121 (e) and P. fragi NMC25

2.4 進(jìn)化分析

使用不同菌株之間的單拷貝同源基因繪制進(jìn)化樹。從圖4可以看出，NMC25與NRRL B-727菌株的進(jìn)化關(guān)系最近，其次是P121。而在其他3 種假單胞菌中，與F113的進(jìn)化關(guān)系最近，與PAO1最遠(yuǎn)。同時(shí)驗(yàn)證各分支的可信度百分比，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌PAO1與其他5 株假單胞菌差異較大。對(duì)6 株假單胞菌的進(jìn)化分析結(jié)果與共線性分析的結(jié)果一致。

圖4 不同假單胞菌的進(jìn)化分析Fig. 4 Phylogenetic trees of different Pseudomonas species

3 討論與結(jié)論

假單胞菌屬內(nèi)有多個(gè)種，廣泛存在于土壤、水及各種植物體中。其屬內(nèi)菌種表現(xiàn)出了豐富的代謝多樣性和廣泛的定殖環(huán)境[26]。目前對(duì)冷鮮肉腐敗菌的研究已逐漸深入到基因水平，本團(tuán)隊(duì)在前期利用宏基因組測(cè)序測(cè)定了托盤包裝下冷鮮雞肉的菌落組成多樣性，發(fā)現(xiàn)其中豐度最高的是莓實(shí)假單胞菌，其次是熒光假單胞菌[27]。然而假單胞菌屬中不同種、不同分離株之間的腐敗能力會(huì)存在較大差異。莓實(shí)假單胞菌的優(yōu)勢(shì)腐敗菌地位與其基因組結(jié)構(gòu)組成密切相關(guān)，要對(duì)其致腐過程有深入了解需要全面明確其基因組信息。但由于目前已公布基因組完成圖的莓實(shí)假單胞菌僅有1 株，且菌株來源為極地環(huán)境，不一定能準(zhǔn)確反映具有強(qiáng)致腐能力的肉源性莓實(shí)假單胞菌分離株的基因組特征，因此對(duì)分離到的肉源性強(qiáng)致腐菌株NMC25進(jìn)行了全基因組完成圖測(cè)序。隨后為探究造成這些菌株腐敗能力差異的原因，選擇已公布序列的銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌代表菌株以及另外兩株莓實(shí)假單胞菌分離株進(jìn)行了初步的比較基因組的分析。

由微生物引起的腐敗現(xiàn)象主要包括變色、異味和產(chǎn)黏，這些腐敗特征主要取決于微生物對(duì)肉中各種基質(zhì)的利用情況。全基因組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)NMC25基因組中有大量氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝相關(guān)基因，表明該菌可能較多地參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝，因此肉類等高蛋白食品可作為其適宜的生長基質(zhì)。研究表明，肉中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌可產(chǎn)生揮發(fā)性化合物導(dǎo)致異味的出現(xiàn)[28]。在細(xì)菌代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物中，醇類[29]、醛類[30]和硫化物[31]等物質(zhì)均與氨基酸代謝有關(guān)。在基因組的GO基因功能分類中發(fā)現(xiàn)有大量代謝和催化反應(yīng)相關(guān)的基因，推測(cè)NMC25的代謝活性可能比較旺盛，在合適的基質(zhì)上生長時(shí)會(huì)進(jìn)行活躍生長和代謝。KEGG分析結(jié)果表明NMC25中的基因富集到了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、雙組分系統(tǒng)、鞭毛組裝、細(xì)菌分泌系統(tǒng)和氧化磷酸化相關(guān)通路，這有助于NMC25在肉品這一富含蛋白質(zhì)的環(huán)境中生長，接觸到介質(zhì)表面時(shí)會(huì)快速黏附和擴(kuò)散，同時(shí)在分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、感受外界環(huán)境變化時(shí)做出應(yīng)激響應(yīng)、分泌代謝產(chǎn)物和產(chǎn)生能量等方面有較大優(yōu)勢(shì)。除此之外，NMC25基因組中包含大量糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶。有研究表明，當(dāng)肉品中假單胞菌數(shù)量較少時(shí)，初級(jí)代謝的主要能量來源是葡萄糖[28]，此時(shí)NMC25可快速充分利用葡萄糖進(jìn)行代謝和生物合成；隨著葡萄糖逐漸被利用，細(xì)菌數(shù)量迅速增加，開始產(chǎn)生各種胞外酶利用蛋白質(zhì)等其他底物，產(chǎn)生氨、胺、硫化氫等物質(zhì)導(dǎo)致肉的腐敗[3]。莓實(shí)假單胞菌NMC25基因組中包含的這些功能基因使其具備在冷鮮肉上快速代謝和擴(kuò)散的能力，最終導(dǎo)致冷鮮肉腐敗。

在比較基因組分析中，莓實(shí)假單胞菌與其他3 種假單胞菌的共線性較低。一般來說，如果2 個(gè)物種之間的親緣關(guān)系很近，那么基因的序列和順序都會(huì)非常接近。結(jié)合進(jìn)化分析結(jié)果，可以表明莓實(shí)假單胞菌與假單胞菌屬的其他3 種假單胞菌尤其是銅綠假單胞菌PAO1的基因組差別較大、進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。此外，肉源性分離株NMC25與極地環(huán)境來源分離株P(guān)121基因組差別較大，說明生長環(huán)境不同，莓實(shí)假單胞菌的基因組組成結(jié)構(gòu)確實(shí)存在差異，有必要對(duì)NMC25分離株的基因組進(jìn)行測(cè)序。而NRRL B-727菌株基因組與NMC25共線性程度非常高，只是存在顛倒、易位等基因重組事件，因此推測(cè)這兩株菌在進(jìn)化過程中起源可能是一致的，NRRL B-727可能也具有較強(qiáng)的致腐能力。

綜合上述結(jié)果，莓實(shí)假單胞菌NMC25分離株作為1 株具有較強(qiáng)致腐能力的菌株，其基因組中也包含大量可能導(dǎo)致食品尤其是肉品腐敗的功能基因與代謝通路。本研究從基因水平上證明了該分離株具有較強(qiáng)的致腐潛力，對(duì)后續(xù)研究深入挖掘莓實(shí)假單胞菌的代謝特征，明確其致腐機(jī)制具有重要的意義。