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        激光誘導熒光結合磁分離檢測CP4-EPSPS基因

        2021-08-31 02:34:48龐月紅王逸盈孫夢夢沈曉芳
        食品科學 2021年16期
        關鍵詞:戊二醛探針轉基因

        龐月紅,王逸盈,孫夢夢,沈曉芳,張 毅

        (江南大學食品學院,江蘇 無錫 214122)

        在過去的20 a中據(jù)統(tǒng)計全球轉基因作物的播種面積空前增長,到2018年達到1.917億 公頃,為全球大豆總種植面積的78%,約占全球轉基因作物總種植面積的50%[1]。CP4-5-烯醇丙酮酸酯-3-磷酸合酶基因(CP4-5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase gene,CP4-EPSPS)是從土壤農桿菌CP4菌株中克隆的EPSPS基因,是轉基因大豆中使用最早、最普遍的抗除草劑性的轉基因[2]。轉基因大豆的檢測主要有兩類,一類是基于外源基因表達蛋白的檢測,包括分子印跡[3]、酶聯(lián)免疫[4-5]和試紙條法[6]等。這些基于蛋白質檢測的方法耗時,有的需要用檢測蛋白的專用儀器。另一類是基于外源基因進行的基因檢測[7]。這些基因檢測方法包括聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)結合瓊脂糖凝膠電泳[8]、real-time PCR[9-10]、表面等離振子共振[11]等。然而,這些方法儀器昂貴、操作較為復雜。因此,研究操作簡單、檢測靈敏度高、特異性強的檢測轉基因大豆分析方法十分有意義。

        磁納米粒子是一種粒徑在100 nm左右的超磁性納米粒子,可以利用其磁性,快速地從復雜體系中分離出目的分子[12]。由于磁納米粒子可以結合分離生物分子并且具有增強信號的性能,在檢測中可被用于結合適配體。特別是近年來,磁納米粒子在傳感器中被廣泛應用[13-14]。

        激光誘導熒光(laser induced fluorescence,LIF)技術用于測定激光誘導的液體中熒光[15]。由于其檢出限范圍從nmol/L到pmol/L[16],且穩(wěn)定性強,LIF已成為最靈敏的檢測方法之一。LIF已經被廣泛應用在結合毛細管電泳[17]、高效液相色譜[18]和微流控技術[19]等。此外,LIF檢測被用于提高分子靈敏度和選擇性[20]。本實驗建立一種LIF結合磁分離檢測CP4-EPSPS基因的方法。通過制備磁納米捕獲探針,利用DNA堿基配對的特異性和磁納米粒子的磁分離,通過高靈敏度和準確性的LIF,實現(xiàn)CP4-EPSPS基因的檢測。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        轉基因大豆干粉 美國分析化學家協(xié)會;氨基磁納米粒子(magnetic nanoparticles, MNPs)(10.0 nm)南京東納米生物公司;用于配制緩沖液的試劑以及戊二醛國藥集團化學試劑有限公司;親和素、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、核苷酸序列 生工生物工程(上海)股份有限公司。

        從轉基因大豆中提取用于PCR擴增的DNA樣品。使用大豆CP4-EPSPS基因的寡核苷酸引物進行PCR,核苷酸序列見表1。

        表1 本方法所用核苷酸序列Table 1 Sequences of oligonucleotides used in this work

        1.2 儀器與設備

        UV-1100紫外分光光度計 日本日立公司;F-7000熒光分光光度計 日本島津公司;XW-80A旋渦混合器上海精科實業(yè)有限公司;TriSepTM-2000 LIF檢測器上海通微有限公司;LSP02-1B注射泵 中國蘭格恒流泵有限公司;T100TMPCR儀 美國Bio-Rad公司;Nicolet 10傅里葉變換紅外光譜儀 中國賽默飛世爾科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 制備捕獲探針修飾的MNPs

        首先將200.0 μL 4.0 mg/mL的MNPs溶液加入到1.6 mL含25%的戊二醛-磷酸緩沖液(pH 8.0)中,室溫下避光混合振蕩2 h,磁分離后得到戊二醛修飾的MNPs。然后加入0.5 mg/mL的親和素,室溫下避光混合振蕩6 h,沖洗3 次后得到親和素化的MNPs。將生物素化的捕獲探針(cDNA)加入上述溶液,混合振蕩孵育30 min,通過生物素-親和素系統(tǒng)固定在MNPs表面[21]。然后加入1.0 mg/mL的BSA溶液封閉未結合的位點,用磷酸鹽緩沖液磁分離清洗后,得到捕獲探針修飾的磁納米粒子(cDNA-MNPs)。

        1.3.2 在線檢測方法的設計與建立

        先向50.0 μL cDNA-MNPs溶液中加入50.0 μL FAM標記的信號探針(sDNA)和50.0 μL一定濃度的CP4-EPSPS目標基因(tDNA),混合液95 ℃加熱5 min后,冰浴5 min。然后將所得混合液在室溫下孵育30 min形成穩(wěn)定結構sDNA-tDNA-MNPs,并通過注射泵以一定速度注入毛細管。毛細管下方帶有磁場,在磁場和流體動力阻力的作用下,將混合物與毛細管中未結合的雜質分離。通過LIF檢測器,不與cDNA-MNPs雜交的FAM探針形成熒光信號平臺。當熒光信號降低到零時,即無邊界的FAM探針被完全沖洗掉。然后去除磁場,以高流速沖洗毛細管,被磁場富集的FAM-tDNA-MNPs夾心結構快速通過LIF檢測器,出現(xiàn)一個熒光信號峰。

        1.3.3 樣品中CP4-EPSPS基因的檢測

        首先根據(jù)SDS方法從轉基因大豆粉中提取DNA樣品。將0%、0.5%、1.0%和10.0%的轉基因大豆DNA摻入非轉基因大豆中,并通過PCR擴增稀釋后的DNA,以獲得相應的長片段。然后將6 μL的PCR擴增產物做瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖為1%,電壓為5 V/cm,電泳時間為40 min。最后,將PCR產物用10.0 mmol/L Tris-HCl稀釋,通過在沸水浴中加熱5 min而變性,然后在冰浴中冷凍2 min,以獲得單鏈DNA溶液。將這種方法檢測CP4-EPSPS的結果與傳統(tǒng)PCR方法進行比較。

        2 結果與分析

        2.1 LIF結合磁分離在線傳感檢測技術的構建

        構建原理如圖1所示,首先通過戊二醛反應使氨基MNPs表面結合上親和素,親和素化的MNPs與生物素化的捕獲探針進一步混合反應,并用BSA溶液封閉未結合的位點[22],得到捕獲探針修飾的MNPs(cDNAMNPs)。隨后,將得到的cDNA-MNPs溶液與信號探針和CP4-EPSPS基因溶液混合后注入毛細管,在磁場的作用下分離雜質。當熒光信號歸零時再撤去磁場,通過LIF檢測器得到熒光信號峰,峰面積可用于CP4-EPSPS基因的檢測和定量。

        圖1 LIF結合磁分離的在線傳感原理圖Fig. 1 Schematic diagram of LIF combined with magnetic separation on-line sensing detection

        2.2 MNPs修飾過程的表征

        為驗證cDNA是否成功地修飾到MNPs上,對每個修飾過程表征。如圖2A所示,戊二醛在233 nm波長處有較強的特征吸收峰,在280 nm波長處有較弱的特征吸收峰。MNPs本身沒有特征吸收峰,而與MNPs反應后的戊二醛在233 nm波長處的紫外吸收峰值有所下降,280 nm波長處的紫外吸收峰值有紅移,表明戊二醛與MNPs發(fā)生席夫堿反應,從而使MNPs活化。如圖2B所示,親和素在285 nm波長處有很強的紫外吸收峰。與MNPs反應后,上清液中的親和素在285 nm波長處的紫外吸收峰值明顯下降,說明親和素已經成功地共價結合到MNPs的表面。如圖2C所示,MNPs在586 cm-1和1 073 cm-1處均有吸收峰,586 cm-1處為Fe—O鍵的振動峰,1 073 cm-1為Si—O鍵的伸縮振動峰。而經親和素修飾后除了MNPs的特征峰外,在1 642 cm-1及1 576 cm-1處出現(xiàn)新的仲酰胺特征峰,對應為C=O鍵的伸縮振動峰。在2 928 cm-1處為—CH2的C—H鍵伸縮振動峰,3 400 cm-1處為N—H鍵的伸縮振動峰,與—OH伸縮振動峰發(fā)生重合,且在這兩處的峰均變寬變強,表明親和素已經成功地修飾到MNPs上。cDNA是一端修飾有生物素的捕獲基因,在260 nm波長處有紫外吸收峰,根據(jù)反應前后原體系中的cDNA含量可以判斷cDNA是否連接到親和素化的MNPs上。如圖2D所示,cDNA結合親和素化的MNPs后在260 nm波長處的吸收峰有明顯的下降,表明已將cDNA成功裝配到親和素化的MNPs表面上,形成了cDNA-MNPs。

        圖2 MNPs修飾過程表征Fig. 2 Characterization of MNPs modification

        2.3 檢測方法可行性分析

        制備好的cDNA-MNPs、FAM熒光標記的信號探針和CP4-EPSPS基因室溫孵育30 min。將混合液以一定的速度泵入毛細管中以沖洗雜質,并記錄色譜圖。如圖3A所示,對照組的熒光信號圖譜,當注入混合液時出現(xiàn)熒光信號平臺,繼續(xù)沖洗除去未結合的FAM探針,熒光信號降為0。撤掉毛細管下方的磁場,使用較大的流速推動混合物通過LIF檢測器,此時無熒光信號,表明沒有夾心結構即沒有檢測到CP4-EPSPS基因。如圖3B所示,當沖洗掉未結合的FAM探針并且熒光信號消失時,相對熒光單元(relative fluorescence unit,RFU)也具有一個平臺。除去磁場后,通過LIF檢測器有熒光信號峰出現(xiàn),表示有CP4-EPSPS基因存在,通過計算熒光峰的面積可以得出CP4-EPSPS基因的濃度。整個過程共用時3 min,表明該方法可以快速且有效地檢測CP4-EPSPS基因。

        圖3 CP4-EPSPS基因熒光信號圖譜Fig. 3 Fluorescence signal spectra of the CP4-EPSPS gene

        2.4 實驗條件的優(yōu)化

        MNPs質量濃度對最終FAM-tDNA-MNPs結構的熒光強度有影響,為實現(xiàn)準確分析,研究MNPs質量濃度對實驗結果的影響。如圖4A所示,MNPs質量濃度從0.1 mg/mL增加到0.3 mg/mL,熒光峰面積也隨之增加,在0.4 mg/mL時達到最大值,之后隨著質量濃度的增加熒光峰面積下降。

        通過基因探針cDNA與MNPs特異性結合,從而實現(xiàn)信號的檢測,因此基因探針cDNA濃度直接影響實驗的結果。如圖4B所示,與MNPs偶聯(lián)后,使用cDNA從樣品中捕獲CP4-EPSPS基因。增加MNPs上的cDNA負載可以增加與CP4-EPSPS基因結合的cDNA的親和力和數(shù)量,從而提高捕獲效率。熒光峰面積隨著cDNA濃度的增加而增加,在100 nmol/L時達到最高,濃度再增加,熒光峰面積降低。

        圖4 實驗條件的優(yōu)化Fig. 4 Optimization of experimental conditions

        本實驗用BSA作為封閉劑[22],減少熒光素與MNPs的接觸,并且起到了分散MNPs的作用,有助于改善靈敏度和可重復性。如圖4C所示,隨著BSA質量濃度的增加,熒光峰面積增加,并在1.0 mg/mL達到最高。BSA過剩會影響DNA雜交實驗,因此在1.0 mg/mL之后隨著質量濃度的增高,熒光峰面積下降。綜上所述,選擇1.0 mg/mL BSA作為最佳質量濃度。

        2.5 LIF結合磁分離在線檢測

        在信號探針和cDNA-MNPs存在的情況下,通過雜交反應實現(xiàn)CP4-EPSPS基因的檢測。根據(jù)優(yōu)化條件,LIF用于檢測一系列不同濃度的CP4-EPSPS。如圖5A所示,熒光圖譜中熒光峰信號隨著CP4-EPSPS基因濃度的增加而增強。如圖5B所示,建立了熒光峰面積與CP4-EPSPS基因濃度之間的線性關系,線性方程為y=31.31lgx+69.52,R2=0.993,線性范圍為1.0×10-11~2.0×10-7mol/L,檢出限為4.0×10-12mol/L(RSN=3)。與文獻[23-29]相比(表2),本方法由于無需擴增且磁性納米粒子具有分離和富集的雙重功能,因此,具有較寬的線性范圍和較低的檢出限。

        圖5 不同濃度CP4-EPSPS基因的熒光檢測Fig. 5 Fluorescence detection of CP4-EPSPS gene at different concentrations

        表2 不同傳感器對轉基因片段檢測效果比較Table 2 Figures of merit of several different biosensors for detection of transgenic fragments

        2.6 方法特異性的檢測結果

        為了檢驗本方法的特異性,以空白試劑、CP4-EPSPS基因、2 個堿基錯配的基因序列、5 個堿基錯配的基因序列及隨機序列作為研究對象,濃度均為100 nmol/L。如圖6所示,由于錯配的基因無法有效地與探針雜交形成穩(wěn)定的雙鏈體復合物,本方法具有較高的特異性。

        圖6 不同基因的熒光信號Fig. 6 Comparison of fluorescence peak areas for different genes

        2.7 實際大豆樣品的檢測

        研究表明,生物傳感器能進一步測定PCR擴增的轉基因大豆實際樣品[30]。運用本方法檢測轉基因大豆樣品,并與傳統(tǒng)的生物技術檢測方法PCR進行比較。首先,通過PCR,對轉基因大豆的DNA序列進行擴增,對擴增樣品進行編號。如圖7A所示,隨著轉基因大豆含量的增加,熒光峰面積明顯增加,且可以成功地將其與非轉基因大豆和空白進行區(qū)分。如圖7B所示,1、2、3號的擴增樣品在207 bp處有明顯的條帶,表明含有CP4-EPSPS基因,而在非轉基因大豆和空白對照組中沒有發(fā)現(xiàn)任何條帶。通過與傳統(tǒng)PCR方法比較,兩種方法檢測到的結果一致,且檢測在3 min內即可完成,表明了LIF在線檢測方法實際可行。

        圖7 轉基因大豆擴增產物檢測Fig. 7 Detection of genetically modified soybean amplification products

        3 結 論

        本實驗成功地建立了一種LIF結合磁分離技術用于在線檢測轉基因大豆中的CP4-EPSPS基因的方法。該方法具有高特異性、低檢出限和短檢測時間,并用于檢測轉基因大豆樣品的PCR擴增產物,表明該方法可用于檢測轉基因大豆中的CP4-EPSPS基因。同時,與傳統(tǒng)PCR相比,具有更低的儀器成本,更加便捷化的前景,同時材料的批量生產也更符合工業(yè)化和快檢技術的要求。

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