盧浩成，魏 巍，成池芳，陳 武，李樹(shù)德，王曉軍，劉宗昭，王 軍,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100083；3.新疆中信國(guó)安葡萄酒業(yè)有限公司，新疆 瑪納斯 832200）

顏色是評(píng)價(jià)葡萄酒質(zhì)量最重要的指標(biāo)之一。紅葡萄酒的主要呈色物質(zhì)為花色苷，花色苷的含量、組成和比例，以及與其他類黃酮化合物的聚合作用都會(huì)影響紅葡萄酒的顏色[1]。我國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)近年發(fā)展較快，但葡萄酒顏色穩(wěn)定性差的問(wèn)題也受到越來(lái)越多的關(guān)注，一些紅色葡萄品種釀造的新鮮葡萄酒的顏色較好，呈現(xiàn)深寶石紅和紫紅色的特點(diǎn)，但隨著陳釀的進(jìn)行，會(huì)出現(xiàn)紅色色調(diào)下降和黃色色調(diào)上升速度過(guò)快的問(wèn)題，嚴(yán)重影響了葡萄酒的感官質(zhì)量[2-3]。針對(duì)此問(wèn)題，很多葡萄酒釀造企業(yè)采取的措施是將顏色表現(xiàn)好的葡萄酒混入目標(biāo)基酒中，此方法是解決葡萄酒顏色穩(wěn)定性差的有效措施[4]。應(yīng)用不同品種葡萄酒間的調(diào)配，可改善葡萄酒的顏色、香氣和口感，是葡萄酒企業(yè)保持其產(chǎn)品穩(wěn)定和開(kāi)發(fā)新風(fēng)格葡萄酒的重要措施[4-7]。

在干紅葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程中，為了改善其顏色及其穩(wěn)定性，有時(shí)加入顏色表現(xiàn)好的葡萄酒進(jìn)行調(diào)色，常用來(lái)調(diào)色的葡萄品種被稱為調(diào)色品種，應(yīng)用較多的有‘馬瑟蘭’、‘Dornfelder’等[8-9]。生產(chǎn)上有時(shí)也以染色葡萄作為調(diào)色品種，例如廣泛應(yīng)用的‘Alicante Bouschet’[10]。與大多數(shù)歐亞種葡萄品種不同，染色葡萄不僅在果皮中合成花色苷，也在果肉中合成花色苷[11]。‘煙73’、‘煙74’、‘Kolor’和‘Tintorera’是國(guó)內(nèi)較常見(jiàn)的染色葡萄品種。‘Dornfelder’原產(chǎn)于德國(guó)，雖然不是染色品種，但其所釀葡萄酒的顏色很深，是德國(guó)的主栽品種之一。關(guān)于調(diào)色品種的應(yīng)用雖然已經(jīng)在國(guó)內(nèi)很多葡萄酒企業(yè)有所嘗試，但以經(jīng)驗(yàn)為主，缺乏對(duì)調(diào)色品種酚類物質(zhì)輪廓的系統(tǒng)研究。

調(diào)色葡萄品種不僅花色苷含量較高，還有很強(qiáng)的輔色效應(yīng)。輔色效應(yīng)是指葡萄酒中的花色苷與其他有機(jī)物或金屬離子發(fā)生輔色作用，形成呈色的輔色復(fù)合體，這種效應(yīng)不僅可以增加溶液中呈色花色苷的比例，還可以通過(guò)改變花色苷分子的構(gòu)象，增加其在可見(jiàn)光光譜吸收（增色效應(yīng)），和/或增加其最大吸收波長(zhǎng)（紅移效應(yīng)）[12]。黃酮醇和黃烷醇等酚類物質(zhì)作為常見(jiàn)的輔色素，其含量和輔色效應(yīng)呈正相關(guān)[13]。黃酮醇作為應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)物質(zhì)，可以吸收280～330 nm波長(zhǎng)范圍的光，防止葡萄漿果組織受紫外線的損傷[14-16]。黃酮醇的輔色效果良好，被認(rèn)為是最有效的輔色素[17]。黃烷醇在釀酒葡萄果皮和種子中均有存在，主要存在方式為游離單體和分子質(zhì)量大的單寧。單寧是賦予葡萄和葡萄酒收斂感的主要物質(zhì)，對(duì)葡萄酒的感官有重要影響。黃烷醇能夠與花色苷形成輔色聚合體，雖其輔色效應(yīng)弱于黃酮醇，但其在果實(shí)中的含量較高，對(duì)葡萄酒顏色穩(wěn)定同樣具有重要作用[18-20]。

本研究對(duì)5 個(gè)常見(jiàn)的調(diào)色品種果實(shí)和所釀葡萄酒中的酚類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，探究每個(gè)調(diào)色品種的酚類物質(zhì)輪廓，以期為葡萄酒的調(diào)配提供基本參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2013年栽植的‘煙73’、‘煙74’和2015年栽植的‘Kolor’、‘Tintorera’和‘Dornfelder’葡萄，樹(shù)體長(zhǎng)勢(shì)均正常。葡萄園位于新疆昌吉州瑪納斯縣中信國(guó)安葡萄酒業(yè)有限公司自建基地（北緯44°14′，東經(jīng)86°15′）。植株行向?yàn)楸逼珫|52°，株距1 m，行距2.8 m。整形方式為改良的VSP葉幕形，自根苗，主干高度60 cm。

氫氧化鈉、酚酞、無(wú)水硫酸銅、磷酸、次甲基藍(lán)、甲醇、乙醇、醋酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸鈉、間苯三酚、丙酮、抗壞血酸、鹽酸（均為分析純） 天津化工廠；甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜級(jí)），二甲花翠素-3-O-葡萄糖、兒茶素、表兒茶素、表沒(méi)食子酸兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酯標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；果膠酶 澳大利亞Optivin公司；Lalvin D254酵母菌 法國(guó)Lallemand公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PAL-1手持折光儀 日本Atago公司；PB-10 pH計(jì)德國(guó)Sartorius公司；TDL-5-A低溫離心機(jī) 上海飛鴿儀器有限公司；SG3200HBT超聲波清洗機(jī) 上海冠特超聲儀器有限公司；T6紫外分光光度計(jì) 上海普析通用儀器公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 北京必瑞克生物科技有限公司；1200系列高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄果實(shí)樣品采集

2018年9月4日采集‘Kolor’，9月5日采集‘煙73’和‘煙74’，9月11日采集‘Dornfelder’，9月19日采集‘Tintorera’。葡萄漿果的采集按對(duì)角線法[21]，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的20 株葡萄，每次每個(gè)果穗采集5 粒漿果，果穗曝光面上部、中部、下部各采1 粒漿果，果穗背光面中部采集2 粒漿果，共3 次重復(fù)，每次重復(fù)采集約500 粒漿果，其中100 粒漿果用于分析理化指標(biāo)，剩余樣品在液氮中冷凍后置于-80 ℃的冰箱中貯存，用于酚類物質(zhì)檢測(cè)。

1.3.2 葡萄果實(shí)花色苷和黃酮醇的提取

果皮或果肉中花色苷和黃酮醇提取方法如下[22]：準(zhǔn)確稱?。?.100 0±0.000 2）g葡萄果皮（肉）凍干粉于2.5 mL離心管中，加入1 mL 50%甲醇溶液，20 ℃避光超聲萃取20 min后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，隨后轉(zhuǎn)移上清液于新的2.5 mL離心管中，殘?jiān)侔凑丈鲜霾襟E重復(fù)提取一次，合并2 次提取的上清液，充分混合均勻，于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.3.3 葡萄果實(shí)黃烷醇的提取

參考Liang等[23]方法并進(jìn)行優(yōu)化。

游離黃烷醇的提?。簻?zhǔn)確稱?。?.100 0±0.000 2） g葡萄果皮凍干粉于5 mL離心管中，加入1 mL 70%丙酮溶液（含0.5%的抗壞血酸）。充分振蕩后在10 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液于新的5 mL離心管中，殘?jiān)貜?fù)提取3 次，將多次提取所得上清液合并。取400 μL提取液于1.5 mL離心管中，在常溫下進(jìn)行氮吹，用200 μL含1% HCl的甲醇溶液溶解，再加入200 μL的乙酸鈉溶液（200 mmol/L）中和，于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

聚合黃烷醇的裂解和提?。簻?zhǔn)確稱取（0.100 0±0.000 2）g葡萄果皮凍干粉于10 mL的離心管中，加入1 mL的間苯三酚緩沖液（含0.3 mol/L HCl、50 g/L間苯三酚和0.5%抗壞血酸的甲醇溶液），50 ℃水浴20 min后，加入1 mL乙酸鈉（200 mmol/L）終止反應(yīng)，4 ℃、8 000 r/min離心15 min后，取出上清液置于新的10 mL離心管中，重復(fù)操作提取3 次，將上清液合并，于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.3.4 葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)檢測(cè)

采用高效液相色譜儀，配備6410三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（QqQ）。Poroshell 120 EC-C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）。果實(shí)提取液測(cè)定前經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣量5 μL。洗脫流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液為A相，含0.1%甲酸的甲醇-乙腈（50∶50，V/V）溶液為B相。洗脫程序：90%～0% A，10%～100% B，持續(xù)15 min，后運(yùn)行程序5 min。流動(dòng)相流速為0.4 mL/min。柱溫箱溫度控制為55 ℃。質(zhì)譜采用AJESI離子源，正離子模式，噴霧電壓4 kV，離子源溫度150 ℃，干燥氣溫度350 ℃，流量12 L/h，霧化器壓力35 psi。檢測(cè)器為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。

葡萄果實(shí)非花色苷酚檢測(cè)所用儀器、色譜柱、流動(dòng)相、過(guò)濾方法同上。梯度洗脫程序：0～28 min，90%～54% A，10%～46% B；28～29 min，54%～90% A，46%～10% B。洗脫結(jié)束后，維持10% B相沖洗5 min，平衡色譜柱。流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜采用AJESI離子源，負(fù)離子模式，其余參數(shù)同上。

酚類物質(zhì)的定性依據(jù)為本實(shí)驗(yàn)室所建立的葡萄與葡萄酒酚類物質(zhì)HPLC-UV-MS指紋譜庫(kù)[24]。定量采用外標(biāo)法，花色苷及其衍生物含量以含有相同花色素基元-3-O-葡萄糖苷單體含量計(jì)算，單位為mg/kg，以果實(shí)鮮質(zhì)量計(jì)。黃酮醇以槲皮素為外標(biāo)物，黃烷醇以兒茶素、表兒茶素、表?xiàng)攦翰杷睾捅韮翰杷貨](méi)食子酸酯為外標(biāo)物，單位為mg/kg，以果實(shí)鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.5 規(guī)模發(fā)酵

2018年9月4日采收‘Kolor’和‘Dornfelder’，9月5日采收‘煙73’和‘煙74’，9月19日采收‘Tintorera’。每個(gè)品種采樣30 kg果實(shí)（每個(gè)生物學(xué)重復(fù)10 kg果實(shí)），人工破碎除梗后入玻璃罐（10 L），入罐同時(shí)加入40 mg/L H2SO3和20 mg/L果膠酶。入罐24 h后添加活化好的Lalvin D254酵母。用干凈紗布蓋住罐口，每天早晚各壓帽一次，測(cè)定發(fā)酵液的密度和溫度。乙醇發(fā)酵結(jié)束（密度降到1.000以下且不再變化）后進(jìn)行皮渣分離，自流汁和壓榨汁移至10 L密閉玻璃容器，添加乳酸菌進(jìn)行蘋-乳發(fā)酵，水封隔絕氧氣。蘋-乳發(fā)酵結(jié)束后加入60 mg/L的H2SO3后裝瓶，置于公司酒窖瓶?jī)?chǔ)。

1.3.6 果汁和葡萄酒樣品基本理化指標(biāo)測(cè)定

葡萄破碎后果汁的可溶性固形物含量用手持折光儀測(cè)定，pH值用pH計(jì)測(cè)定，總酸（以酒石酸計(jì)）含量參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定[25]。

葡萄酒乙醇體積分?jǐn)?shù)、殘?zhí)恰⒖偹?、揮發(fā)酸、SO2含量等測(cè)定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[25]，pH值用pH計(jì)測(cè)定。

葡萄酒色度采用分光光度計(jì)法測(cè)定，取適量樣品分別在420、520 nm和620 nm波長(zhǎng)下用1 mm比色杯測(cè)定其吸光度，色度值用3 種波長(zhǎng)下的吸光度之和表示[26]。

1.3.7 葡萄酒酚類物質(zhì)檢測(cè)

葡萄酒樣品花色苷檢測(cè)同1.3.4節(jié)，檢測(cè)前經(jīng)0.22 μm水系濾膜過(guò)濾；花色苷定性和定量同1.3.4節(jié)，質(zhì)量濃度單位為mg/L。葡萄酒樣品非花色苷酚類物質(zhì)檢測(cè)、定性和定量同1.3.4節(jié)，質(zhì)量濃度單位為mg/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 8.5、Excel、SIMCA和R語(yǔ)言進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄果實(shí)中的酚類物質(zhì)

2.1.1 花色苷含量測(cè)定

如圖1所示，‘Kolor’、‘煙73’和‘煙74’果實(shí)的花色苷含量均超過(guò)3 000 mg/kg?！疅?3’果實(shí)的花色苷含量最高，達(dá)4 768.60 mg/kg，而‘Tintorera’（2 484.99 mg/kg）和‘Dornfelder’（1 599.79 mg/kg）的花色苷含量相對(duì)較低。雖然‘Dornfelder’的果肉中不含花色苷，但其果皮中的花色苷含量高于‘Tintorera’（1 351.12 mg/kg）。從果皮和果肉花色苷含量占花色苷總含量比例看，除‘Dornfelder’外，其余4 個(gè)品種果皮花色苷占比在50%～60%之間，略高于果肉花色苷含量（圖1）。

圖1 5 個(gè)調(diào)色品種果皮和果肉花色苷含量（A）和比例（B）Fig. 1 Concentrations (A) and proportions (B) of anthocyanins in the berry skin and pulp of five blending grape varieties

如表1所示，包括花青素、花翠素、二甲花翠素、甲基花青素和甲基花翠素的葡萄糖苷。每種花色苷均檢測(cè)到了非酰基化、乙酰化（-ac）和香豆?；?co）單葡萄糖苷。除‘煙74’果皮中的甲基花青素類花色苷含量（245.59 mg/kg）高于甲基花翠素類花色苷外，其余品種各類花色苷含量大小順序均為二甲花翠素類＞花翠素類＞甲基花翠素＞甲基花青素＞花青素。二甲花翠素作為5 個(gè)品種果皮中含量最高的物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)中B環(huán)不含有鄰位羥基，對(duì)酶類和金屬離子的氧化并不敏感，因此具有較強(qiáng)的抗氧化力[27]。在果肉中，‘Kolor’和‘Tintorera’的甲基花青素類花色苷含量最高，且花青素類花色苷的含量高于花翠素類花色苷含量。與二甲花翠素類似，甲基花青素同樣不含有B環(huán)鄰位的羥基基團(tuán)，也有較強(qiáng)的抗氧化能力[27]?！疅?3’和‘煙74’的二甲花翠素類花色苷含量最高，且花青素類花色苷的含量低于花翠素類花色苷的含量；4 個(gè)染色葡萄果肉的甲基花翠素類花色苷含量均為最低。

表1 5 個(gè)調(diào)色品種果實(shí)花色苷含量Table 1 Concentrations of anthocyanins in grape berries from five blending grape varieities mg/kg

在5 個(gè)調(diào)色葡萄的果皮和果肉中，未?；ㄉ账急壤罡撸▓D2），‘煙74’果皮和果肉的未酰化花色苷比例高于其他品種。在果肉中，未?；ㄉ毡壤哂诠ぁｕ；侵参矬w中酚類物質(zhì)最常見(jiàn)的修飾方式之一，未經(jīng)?；幕ㄉ找?yàn)闆](méi)有酰基的保護(hù)很容易在中性或弱酸性條件下脫色。酰基化不僅對(duì)花色苷的顏色起到穩(wěn)定作用，還能夠促進(jìn)花色苷顏色的加深[28]。根據(jù)B環(huán)羥基取代的不同，可以將花色苷分為兩類：F3’H羥基取代花色苷（包括花青素類花色苷和甲基花青素類花色苷）和F3’5’H羥基取代花色苷（包括花翠素類花色苷、甲基花翠素類花色苷和二甲花翠素類花色苷），兩者含量上的不同主要與類黃酮-3’,5’-羥基化酶基因（F3’5’H）和類黃酮-3’-羥化酶基因（F3’H）的相對(duì)表達(dá)量有關(guān)[29-30]。由圖2可以看出，在果皮中，F(xiàn)3’5’H羥基取代花色苷含量遠(yuǎn)高于F3’H羥基取代花色苷含量，說(shuō)明在果皮中F3’5’H基因表達(dá)量高于F3’H基因。在果肉中，F(xiàn)3’H羥基取代花色苷的比例明顯提高，甚至在‘Kolor’中超過(guò)了F3’5’H羥基取代花色苷含量。

圖2 5 個(gè)調(diào)色品種果實(shí)?；ˋ）和羥基取代（B）類型花色苷的比例Fig. 2 Proportions of anthocyanins with different acylations (A) and hydroxyl substitutions (B) in grape berries from five blending grape varieties

2.1.2 非花色苷酚類物質(zhì)

如圖3所示，‘煙74’的黃酮醇含量最高（121.24 mg/kg），其次為‘Kolor’（115.50 mg/kg），‘Dornfelder’黃酮醇含量為105.57 mg/kg，3 個(gè)品種果實(shí)黃酮醇含量均達(dá)到100 mg/kg以上，高含量的黃酮醇對(duì)花色苷的輔色效應(yīng)有積極作用。而‘煙73’（59.6 mg/kg）和‘Tintorera’（43.99 mg/kg）的黃酮醇含量較低。各品種果實(shí)的槲皮素類占黃酮醇總量比例最高，其次為楊梅酮類，異鼠李素類所占比例最低，且此類物質(zhì)在‘Tintorera’果實(shí)中未檢測(cè)到。

圖3 5 個(gè)調(diào)色品種果實(shí)黃酮醇含量Fig. 3 Concentrations of flavonols in grape berries from five blending grape varieties

如表2所示，游離單元檢測(cè)到兒茶素和表?xiàng)攦翰杷? 種物質(zhì)；末端單元檢測(cè)到兒茶素、表兒茶素和表?xiàng)攦翰杷? 種物質(zhì)；延伸單元檢測(cè)到兒茶素、表兒茶素、表?xiàng)攦翰杷睾捅韮翰杷貨](méi)食子酸4 種物質(zhì)，其中延伸單元占絕大部分比例?！甂olor’果皮中的黃烷醇含量最高，‘煙73’次之，‘Dornfelder’的黃烷醇含量最少。對(duì)釀酒葡萄黃烷醇類物質(zhì)進(jìn)行分析時(shí)，平均聚合度通常作為重要的分析指標(biāo)，用以反映葡萄酒體的收斂性和結(jié)構(gòu)感，一般來(lái)說(shuō)，隨著平均聚合度的升高，葡萄酒體的苦味減少而澀味有所增強(qiáng)[31-32]。平均聚合度=（延伸單元物質(zhì)的量+起始單元物質(zhì)的量）/起始單元物質(zhì)的量，其中起始單元物質(zhì)的量為游離單元減去末端單元物質(zhì)的量。5 個(gè)調(diào)色葡萄品種中，‘煙73’（47.85）的平均聚合度最高，其次為‘Dornfelder’（33.81），‘Kolor’、‘Tintorera’和‘煙74’平均聚合度接近。

表2 5 個(gè)調(diào)色品種果皮黃烷醇含量Table 2 Concentrations of flavanols in berry skin of five blending grape varieties

2.2 果實(shí)花色苷的PCA和差異物質(zhì)篩選

為了探究各調(diào)色品種果實(shí)中各花色苷含量的差異，對(duì)其進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），結(jié)果如圖4所示。PCA提取到的前2 個(gè)PC解釋了總方差的85.7%，能夠較好地代表原始數(shù)據(jù)。PC1解釋了總方差的64.7%。從x軸方向看，‘煙73’和‘Kolor’位于x軸的正半軸，‘Tintorera’和‘Dornfelder’位于x軸的負(fù)半軸，‘煙74’位于坐標(biāo)原點(diǎn)附近，PC1能夠?qū)⒄?、?fù)半軸和原點(diǎn)附近的3 個(gè)區(qū)域很好區(qū)分開(kāi)。結(jié)合圖4B可知，所有的花色苷物質(zhì)均位于x軸正半軸部分，對(duì)3 部分的區(qū)分均有貢獻(xiàn)，這說(shuō)明這些物質(zhì)在‘煙73’和‘Kolor’果實(shí)中的含量高于其他3 個(gè)品種，且在‘Tintorera’和‘Dornfelder’中的含量較低。PC2解釋了總方差的21%。從y軸方向看，‘煙73’、‘Tintorera’和‘Dornfelder’位于y軸的正半軸部分，‘煙74’和‘Kolor’位于y軸的負(fù)半軸部分，PC2能將這兩部分很好區(qū)分開(kāi)。結(jié)合圖4B，位于y軸正半軸部分的3 個(gè)品種果實(shí)中含量較高的均為二甲花翠素、花翠素、甲基花翠素和甲基花青素的乙?；咸烟擒?；位于y軸負(fù)半軸的2 個(gè)品種果實(shí)中含量較高的有花青素-3-葡萄糖苷、花青素-3-香豆酰葡萄糖苷、花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷、甲基花青素-3-葡萄糖苷和甲基花青素-3-香豆酰葡萄糖苷等物質(zhì)。

圖4 5 個(gè)調(diào)色品種果實(shí)花色苷含量的PCA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig. 4 PCA score pots (A) and loading pots (B) of anthocyanin concentrations in grape berries from five blending grape varieties

為了進(jìn)一步捕捉到果皮和果肉花色苷中特征差異物質(zhì)，利用果皮和果肉各種花色苷的含量進(jìn)行有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析，所得到的模型可以將果皮和果肉很好區(qū)分開(kāi)（圖5A），其中模型的R2X、R2Y和Q2值分別為0.956、0.968和0.936，具有較好的判別分析能力，經(jīng)過(guò)200 次置換檢驗(yàn)后，R2和Q2的縱截距分別為0.222和-0.742，無(wú)過(guò)擬合現(xiàn)象。通過(guò)變異權(quán)重參數(shù)值（variable importance in projection，VIP）預(yù)測(cè)值分布圖（圖5B），篩選出VIP大于1的物質(zhì)作為果皮和果肉的特征差異化合物，其中貢獻(xiàn)度從高到低的物質(zhì)依次為二甲花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷、甲基花青素-3-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷、甲基花翠素-3-葡萄糖苷、花翠素-3-葡萄糖苷、花翠素-3-香豆酰葡萄糖苷、甲基花翠素-3-乙酰葡萄糖苷。除甲基花青素-3-葡萄糖苷外，其余皆為F3’5’H羥基取代花色苷，推測(cè)果皮和果肉在F3’5’H路徑上可能存在差異。

圖5 5 個(gè)調(diào)色葡萄果皮和果肉花色苷含量的正交偏最小二乘判別分析（A）和差異物質(zhì)篩選（B）Fig. 5 OPLS-DA analysis (A) and screening of differential anthocyanin concentrations (B) between berry skin and pulp of five five blending grape varieties

2.3 入罐時(shí)葡萄汁和發(fā)酵結(jié)束葡萄酒的基本理化指標(biāo)

如表3所示，采收前對(duì)各品種的成熟進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以可溶性固形物含量基本不再上升、種子完全變?yōu)楹稚?、果?shí)將要皺縮為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行采收[33]。采收時(shí)‘Kolor’的可溶性含量最高（24.3 °Brix），其次為‘Dornfelder’（21.2 °Brix），‘煙73’和‘煙74’的可溶性固形物含量接近，均在18 °Brix左右，‘Tintorera’的可溶性固形物含量最低，僅為13.3 °Brix。入罐時(shí)可滴定酸質(zhì)量濃度由高到低依次為‘Tintorera’（8.25 g/L）＞‘煙73’（7.31 g/L）＞‘煙74’（6.75 g/L）＞‘Kolor’（4.88 g/L）＞‘Dornfelder’（4.87 g/L）。各品種葡萄汁和葡萄酒的pH值差異較大，其中‘Tintorera’和‘Kolor’的pH值相差可達(dá)0.6以上。色度方面，除‘Dornfelder’的色度較低外，其余4 個(gè)品種入罐時(shí)的色度均達(dá)到40以上，可見(jiàn)這4 個(gè)染色葡萄果肉中的花色苷在破碎的同時(shí)就被葡萄汁浸出，而‘Dornfelder’的花色苷只存在于果皮中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，果皮中的花色苷逐漸被浸出，蘋-乳發(fā)酵完成后，色度值大幅度增加（30.26）。入罐時(shí)，4 個(gè)染色葡萄的色度值差異并不大，而蘋-乳發(fā)酵結(jié)束后，‘Tintorera’的色度值（61.06）高于其余品種，可能原因是‘Tintorera’發(fā)酵完成的葡萄酒的pH值較低，較低的pH值有利于葡萄酒中花色苷等呈色物質(zhì)的呈色和輔色效應(yīng)[34]。

表3 入罐時(shí)葡萄汁和蘋-乳發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄酒的基本理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical indicators of musts and wines

2.4 葡萄酒中的酚類物質(zhì)

2.4.1 花色苷含量測(cè)定結(jié)果

如表4所示，‘煙73’的花色苷質(zhì)量濃度最高（1 827.87 mg/L），其次為‘煙74’（1 411.13 mg/L），‘Kolor’、‘Tintorera’和‘Dornfelder’葡萄酒中的花色苷含量相近。5 種葡萄酒的二甲花翠素類花色苷含量最高，在‘Kolor’和‘Tintorera’葡萄酒中，甲基花青素類花色苷含量高于花翠素類，而在其余3 個(gè)品種中，甲基花青素類花色苷含量低于花翠素類花色苷，花青素類花色苷含量最低。5 種葡萄酒的未?；ㄉ蘸孔罡?，其次為乙?；ㄉ眨愣辊；ㄉ蘸孔畹汀? 種葡萄酒的F3’5’H羥基取代花色苷含量顯著高于F3’H羥基取代花色苷含量。

表4 5 個(gè)調(diào)色品種所釀葡萄酒的花色苷質(zhì)量濃度Table 4 Concentrations of anthocyanins in wines made from five blending grape varieties mg/L

2.4.2 非花色苷酚類物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

如圖6所示，‘煙74’葡萄酒的黃酮醇質(zhì)量濃度最高（101.07 mg/L），其次為‘Dornfelder’（88.52 mg/L），‘Kolor’（54.14 mg/L）和‘煙73’（51.73 mg/L）的黃酮醇質(zhì)量濃度相近，‘Tintorera’葡萄酒的黃酮醇質(zhì)量濃度最低，僅為19.87 mg/L?！甂olor’葡萄酒的黃烷醇質(zhì)量濃度（98.28 mg/L）明顯高于其余4 個(gè)品種，‘Tintorera’葡萄酒的黃烷醇質(zhì)量濃度（35.34 mg/L）最低，其余3 個(gè)品種葡萄酒的黃烷醇含量介于二者之間，且差異不大?！疅?4’葡萄酒中酚酸質(zhì)量濃度（94.89 mg/L）最高，其余4 個(gè)品種含量依次為‘Dornfelder’（89.58 mg/L）＞‘煙73’（72.32 mg/L）＞‘Kolor’（62.75 mg/L）＞‘Tintorera’（43.77 mg/L），‘Tintorera’葡萄酒的酚酸質(zhì)量濃度仍最低。

圖6 5 個(gè)調(diào)色品種所釀葡萄酒的非花色苷酚類物質(zhì)含量Fig. 6 Concentrations of non-anthocyanin phenols in wines made from five blending grape varieties

2.5 葡萄與葡萄酒的酚類物質(zhì)相關(guān)性分析

通常來(lái)說(shuō)，葡萄的品質(zhì)決定所釀葡萄酒的品質(zhì)，這已經(jīng)成為葡萄酒釀造行業(yè)普遍接受的觀點(diǎn)。挖掘葡萄和葡萄酒中次級(jí)代謝產(chǎn)物的聯(lián)系，利用所有酚類物質(zhì)含量構(gòu)建Pearson相關(guān)系數(shù)模型，并對(duì)葡萄和葡萄酒的相同物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)系數(shù)計(jì)算，結(jié)果如圖7所示。葡萄的酚類物質(zhì)含量與葡萄酒的酚類物質(zhì)含量大部分呈正相關(guān)，一般認(rèn)為兩者的相關(guān)系數(shù)大于0.5或者小于-0.5具有較強(qiáng)的相關(guān)性[35]。對(duì)花色苷來(lái)說(shuō)，葡萄和葡萄酒中相同的15 種單體花色苷中，有11 種具有較強(qiáng)的相關(guān)性；在225（15（葡萄）×15（葡萄酒））個(gè)組合中，有68 個(gè)組合表現(xiàn)出了較強(qiáng)的正相關(guān)。對(duì)黃酮醇而言，在葡萄和葡萄酒中9 種相同的黃酮醇中，有6 種達(dá)到了較強(qiáng)的正相關(guān)；在99（9（葡萄酒）×11（葡萄））個(gè)組合中，有40 個(gè)組合表現(xiàn)出了較強(qiáng)的正相關(guān)。對(duì)黃烷醇來(lái)說(shuō)，在葡萄和葡萄酒相同的3 種物質(zhì)中，有2 種達(dá)到了較強(qiáng)的正相關(guān)；在24（6（葡萄酒）×4（葡萄））個(gè)組合中，有12 個(gè)組合達(dá)到了較強(qiáng)的相關(guān)性。

圖7 基于葡萄和葡萄酒花色苷（A）和非花色苷酚類物質(zhì)（B）濃度的相關(guān)性分析Fig. 7 Correlation analysis of concentrations of anthocyanins (A) and non-anthocyanin phenols (B) between grape berriess and wines from five blending grape varieties

總體來(lái)說(shuō)，在葡萄和葡萄酒所有27 種相同的酚類物質(zhì)中，共有19 種達(dá)到了較強(qiáng)的相關(guān)性，相關(guān)性達(dá)到了70.37%，其中花色苷的相關(guān)性為73.33%，黃酮醇的相關(guān)性為66.67%，黃烷醇的相關(guān)性為66.67%。除此之外，在花色苷、黃酮醇和黃烷醇所有相同物質(zhì)和不同物質(zhì)的共348 個(gè)組合中，120 個(gè)組合達(dá)到了較強(qiáng)的相關(guān)性，相關(guān)性為34.48%。這說(shuō)明，在不同的酚類物質(zhì)組合中，相關(guān)性并不高。

3 討 論

顏色作為葡萄酒感官評(píng)價(jià)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，對(duì)葡萄酒的品質(zhì)至關(guān)重要。如何改善葡萄酒的顏色和提高其穩(wěn)定性是現(xiàn)在越來(lái)越多研究的重點(diǎn)方向，尤其是針對(duì)西部溫暖產(chǎn)區(qū)葡萄酒顏色穩(wěn)定性差的問(wèn)題[3]。干紅葡萄酒中花色苷質(zhì)量濃度一般在185～895 mg/L范圍內(nèi)[36]，在本研究中，5 個(gè)調(diào)色品種葡萄和葡萄酒中均具有較高的花色苷含量，其中葡萄酒中花色苷質(zhì)量濃度均高于1 000 mg/L，高于一般干紅葡萄酒的花色苷含量，均為合適的調(diào)色葡萄品種。5 個(gè)品種中，‘煙73’葡萄果實(shí)和葡萄酒中的花色苷含量均為最高，是作為提高待調(diào)配葡萄酒中花色苷含量最有效的品種。從蘋-乳發(fā)酵結(jié)束葡萄酒的色度方面看，‘Tintorera’葡萄酒中的色度最高，在顏色方面表現(xiàn)最好，雖然其花色苷含量低于‘煙73’，但較低的pH值使其具有最強(qiáng)的輔色效應(yīng)。葡萄酒的顏色與pH值的關(guān)系密切，花色苷物質(zhì)在不同pH值下存在著平衡和轉(zhuǎn)化機(jī)制，當(dāng)葡萄酒pH值在3.0左右時(shí)，輔色效應(yīng)最強(qiáng)，隨著pH值的升高，部分花色苷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)色的甲醇假堿，減色效應(yīng)加劇[12]。

調(diào)配不僅使葡萄酒有更好的顏色，調(diào)配時(shí)也應(yīng)考慮風(fēng)味物質(zhì)的變化。這就決定了進(jìn)行以顏色為目的的調(diào)配時(shí)，不僅要考慮到供調(diào)色品種的花色苷含量，還要兼顧基本理化指標(biāo)的變化，如乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH值；輔色素的多少，如非花色苷酚類物質(zhì)的含量；口感的變化，如丹寧的強(qiáng)弱以及調(diào)配后香氣的協(xié)調(diào)性等。本研究基本探明了各品種的基本理化指標(biāo)和酚類物質(zhì)輪廓特點(diǎn)?！甌intorera’葡萄酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH值均最低，可以平衡乙醇體積分?jǐn)?shù)偏高，酸度偏低的葡萄酒，但‘Tintorera’非花色苷酚類物質(zhì)含量較低，對(duì)輔色效應(yīng)的貢獻(xiàn)會(huì)低于其他品種?！疅?3’有最高的花色苷含量，pH值也處于較低的水平，也可以起到調(diào)酸的效果；‘煙73’葡萄酒中的平均聚合度最高，有最強(qiáng)的澀度和收斂感，調(diào)配時(shí)對(duì)口感的影響最大，也是擬用其進(jìn)行調(diào)配時(shí)需要注意的地方。‘煙74’、‘Kolor’和‘Dornfelder’都有較高的非花色苷酚含量，對(duì)葡萄酒的輔色效應(yīng)有較強(qiáng)的貢獻(xiàn)?！瓺ornfelder’雖然為非染色品種，但果皮中的花色苷含量較高，只選擇其皮渣進(jìn)行混合發(fā)酵也是避免調(diào)色品種對(duì)目標(biāo)葡萄基酒風(fēng)味影響的一種方案。

4 結(jié) 論

本研究以調(diào)色品種‘煙73’、‘煙74’、‘Kolor’、‘Tintorera’和‘Dornfelder’為材料，利用高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測(cè)成熟果實(shí)和蘋-乳發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒的花色苷及非花色苷酚類物質(zhì)的組成和含量。結(jié)果表明，‘Kolor’和‘煙73’果實(shí)總花色苷含量較高，‘Tintorera’和‘煙73’果實(shí)黃酮醇含量較低，‘Dornfelder’果皮黃烷醇含量最低。在5 個(gè)調(diào)色葡萄所釀的葡萄酒中，‘煙73’花色苷含量最高，‘Tintorera’黃酮醇、黃烷醇和酚酸的含量都低于其他品種。從顏色上看，5 個(gè)調(diào)色品種都可以用于調(diào)配葡萄酒的顏色?；诨ㄉ蘸康腜CA可以對(duì)不同品種的果皮和果肉區(qū)分，正交偏最小二乘判別分析可以將5 個(gè)品種的果皮和果肉區(qū)分。在Pearson相關(guān)模型中，葡萄和葡萄酒中70.37%的相同酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的相關(guān)性。