榮紹豐，伍 進，管世敏，蔡寶國，張 碩，李茜茜

（上海應用技術(shù)大學香料香精技術(shù)與工程學院，上海 201418）

2-苯乙醇因具有令人愉悅的香甜味，不僅可以作為食品添加劑對發(fā)酵食品中的其他風味物質(zhì)起到協(xié)調(diào)及增效的作用[1]，而且在藥品、化妝品等領(lǐng)域的應用也十分廣泛。目前, 2-苯乙醇主要通過化學合成法制備，但此法原料具有致癌風險，而且產(chǎn)物中常含有一些難以去除的副產(chǎn)物，嚴重影響了產(chǎn)品質(zhì)量，極大限制了產(chǎn)品的使用范圍[2]。物理提取法可從植物中提取天然2-苯乙醇，但由于植物資源有限、提取效率低等原因不能滿足市場的大規(guī)模需求[3-4]。微生物轉(zhuǎn)化法[5]生產(chǎn)天然2-苯乙醇不僅可以滿足市場需求，而且得到的產(chǎn)品安全天然[6]，是合成天然2-苯乙醇工業(yè)化新趨勢。

微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然2-苯乙醇的菌種主要有酵母菌、真菌和細菌[7-8]。合成2-苯乙醇代謝途徑主要有3 條，即艾氏途徑、苯乙胺途徑和從頭合成途徑（圖1）[9]。目前，研究和應用最廣泛的是酵母菌，如釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母、乳酸克魯維酵母、異常威克漢姆酵母等[10-13]。酵母菌通常以L-苯丙氨酸為底物，通過艾氏途徑合成2-苯乙醇。此外，真菌如米曲霉等可通過艾氏途徑和苯乙胺途徑合成2-苯乙醇[14]。細菌合成2-苯乙醇的報道較少，有研究顯示腸桿菌屬（Enterobactersp.）細菌能通過從頭合成途徑合成2-苯乙醇[15]。由于細菌具有生長速率快、無需以L-苯丙氨酸為底物合成2-苯乙醇等優(yōu)點，可降低生產(chǎn)成本，因此具有應用潛力[16]。

圖1 微生物合成2-苯乙醇的代謝途徑Fig. 1 Metabolic pathway for biosynthesis of 2-phenylethanol in microorganisms

本研究從土樣中分離篩選出1 株腸桿菌，該菌株不僅對2-苯乙醇有一定耐受，且可合成2-苯乙醇。從基因序列分析和生物轉(zhuǎn)化實驗兩個層面對該菌株合成2-苯乙醇的代謝途徑進行研究?？蔀樘烊?-苯乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良的出發(fā)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤樣品采集自上海海灣森林公園不同種類花的根部。

細菌基因組DNA快速抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；HBI腸桿菌科細菌生化鑒定試劑盒 青島海博生物技術(shù)有限公司；L-苯丙氨酸、2-苯乙醇、苯乙醛、苯丙酮酸 美國Sigma公司；其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC6890-5973MS氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、4890氣相色譜儀、1260液相色譜儀 美國Agilent公司；Nicolet 670傅里葉紅外光譜分析儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；UNIC7200紫外-可見分光光度計 上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選與鑒定

1.3.1.1 菌株的篩選

在超凈工作臺上稱取采集的土樣各5 g，分別加入含有100 mL無菌水的三角瓶中，在30 ℃、250 r/min條件下富集培養(yǎng)48 h。用無菌生理鹽水將富集菌液稀分別釋至10-4、10-5、10-6、10-7、10-8五個梯度，每個稀釋度取500 μL涂布于肉膏蛋白胨（Luria-Bertani，LB）固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)至長出菌落。挑單菌落反復劃線培養(yǎng)至菌落形態(tài)單一。將各單菌落轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h，取500 μL分別涂布于含6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 g/L 2-苯乙醇的LB固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑取能在含2-苯乙醇LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，按1.3.3節(jié)方法發(fā)酵培養(yǎng)并按1.3.4所述方法提取發(fā)酵產(chǎn)物。通過GC-MS檢測樣品中2-苯乙醇含量，方法見1.3.5節(jié)。所有實驗重復3 次。

1.3.1.2 16S rDNA鑒定

篩選獲得的菌株接種至LB培養(yǎng)基，37 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)24 h。用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取基因組，用細菌16S rDNA通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）進行PCR擴增[17]。擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成16S rDNA測序。測序結(jié)果上傳至美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）進行BLAST比對，并用MEGA 5.1軟件通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.1.3 革蘭氏染色和生理生化鑒定

篩選獲得的菌株進行革蘭氏染色并鏡檢觀察菌體形態(tài)。按HBI腸桿菌科細菌生化[18]鑒定試劑盒使用手冊檢測，并根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》[19]進行生理生化鑒定。

1.3.2 基因組測序及序列分析

按1.3.1.2節(jié)步驟提取篩選獲得的菌株基因組并送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行基因組測序[20]。利用美吉生物云（https://www.i-sanger.com/）進行序列組裝與注釋。利用KEGG數(shù)據(jù)庫（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）分析2-苯乙醇合成途徑。

1.3.3 菌株發(fā)酵培養(yǎng)

挑取斜面保藏菌株接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，在30 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)24 h。按5%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基[21]（L-苯丙氨酸3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，磷酸氫二鉀3.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，pH 7.0），相同培養(yǎng)條件下發(fā)酵48 h。

1.3.4 2-苯乙醇的提取

發(fā)酵液于8 000 r/min離心10 min。上清液加入二氯甲烷進行萃取，體積比為1∶1。萃取30 min后取有機相，用0.22 μm有機相濾膜過濾并收集濾液。

1.3.5 2-苯乙醇檢測

GC檢測2-苯乙醇條件：色譜柱：Agilent色譜柱19091S-963（60 m×250 μm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始柱溫50 ℃，以3 ℃/min升溫至140 ℃，140 ℃保持5 min。載氣（He）流速1.0 mL/min，分流比20∶1，進樣量1 μL。

GC-MS檢測2-苯乙醇方法：GC條件：色譜柱及進樣溫度與上述方法相同；升溫程序：50 ℃保持1 min，以5 ℃/min升溫至230 ℃，230 ℃保持10 min；載氣（He）流速1.0 mL/min；進樣量1 μL；分流比20∶1。MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；母離子m/z122；激活電壓0.8 V；傳輸線溫度250 ℃；電子倍增電壓1.3 kV；掃描范圍m/z20～500。

2-苯乙醇采用外標法定量。配制不同質(zhì)量濃度的2-苯乙醇（0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 g/L）標準品，在上述GC條件下作2-苯乙醇標準曲線。

1.3.6 紅外光譜檢測

將純化的2-苯乙醇樣品置于紅外光譜儀上，在800～2 500 nm紅外光譜范圍內(nèi)進行掃描，掃描次數(shù)32，分辨率為8 cm-1，探測器為InGaAs。使用空氣作為參考，透射光程1.0 mm，對每個樣品收集3 次光譜，取其平均光譜進一步分析。檢測時環(huán)境溫度20 ℃，相對濕度60%。

1.3.7 不同碳源、底物發(fā)酵產(chǎn)2-苯乙醇

將菌株接種于50 mL LB培養(yǎng)基，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h。無菌條件下將菌液于8 000 r/min離心10 min，并收集菌體。菌體用pH 7.4磷酸鹽緩沖液洗滌3 次后以10%接種量轉(zhuǎn)接于1.3.3節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基，其中L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度分別為3.0、6.0、9.0 g/L。將發(fā)酵培養(yǎng)基中的L-苯丙氨酸依次替換為葡萄糖（10.0、20.0、30.0 g/L）或苯丙酮酸（3.0、6.0、9.0 g/L）或苯乙醛（3.0、6.0、9.0 g/L），按1.3.3節(jié)方法發(fā)酵后，按1.3.4節(jié)方法提取2-苯乙醇，并按1.3.5節(jié)方法定量檢測2-苯乙醇。實驗重復3 次，取平均值。

1.3.8L-苯丙氨酸檢測

高效液相色譜法檢測L-苯丙氨酸濃度。流動相為甲醇-水7∶3，檢測條件為：TC-C18色譜柱（250 mm×4.5 mm），流速1 mL/min，進樣量10 μL，檢測時間15 min，檢測波長254 nm。

L-苯丙氨酸的標準曲線用外標法進行測定：配制不同質(zhì)量濃度2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L的L-苯丙氨酸標準品，分別通過高效液相色譜檢測獲得相應檢測峰面積。以L-苯丙氨酸峰面積為縱坐標、L-苯丙氨酸標準品質(zhì)量濃度為橫坐標繪制L-苯丙氨酸標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸桿菌的分離鑒定

從上海海灣森林公園采集的10 份土樣中初篩獲得44 株具2-苯乙醇耐受性菌株。各菌株2-苯乙醇耐受性結(jié)果見表1。其中，編號為1～35的單菌落2-苯乙醇耐受質(zhì)量濃度為1.0 g/L，編號為36～44的單菌落2-苯乙醇耐受質(zhì)量濃度為2.0 g/L。

表144 株菌株對2-苯乙醇耐受結(jié)果Table 1 Tolerance to 2-phenylethanol in 44 strains isolated in this study

進一步通過將初篩獲得的44 株菌置于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行復篩實驗。在30 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)48 h后。取樣通過GC分別檢測L-苯丙氨酸和2-苯乙醇含量，以此評估44 株菌株產(chǎn)2-苯乙醇能力。其中40號菌2-苯乙醇質(zhì)量濃度最高，達到0.52 g/L（表2）。

經(jīng)過比較分析各菌株產(chǎn)2-苯乙醇能力，最終選擇篩選獲得的40號菌株產(chǎn)2-苯乙醇0.52 g/L且對2-苯乙醇耐受質(zhì)量濃度達到2.0 g/L的細菌菌株。顯微鏡鏡檢結(jié)果表明，該菌細胞呈直短桿狀，大小0.6～1.0 μm×1.5～3.0 μm，革蘭氏染色陰性（圖2A）?？寺≡摼?6S rDNA（GenBank No. MG554655），并對測序結(jié)果進行BLAST分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹（圖2B），結(jié)果表明該菌株與腸桿菌屬相似性達到99.0%[22]，初步確定該菌株屬于腸桿菌屬。

圖2 腸桿菌革蘭氏染色顯微圖（A）及其系統(tǒng)發(fā)生樹（B）Fig. 2 Gram staining (A) and phylogenetic analysis (B) of Enterobacter sp. MF024

進一步根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》[19]進行生理生化鑒定，包括碳源同化、氮源同化和其他特征等實驗。以大腸桿菌DH5α為對照，結(jié)果顯示該菌具有典型的腸桿菌屬細菌生理生化特征（表3），因此確定該菌屬于腸桿菌屬，命名為Enterobactersp. MF024。

表3 生理生化實驗結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical experiment results

2.2 Enterobacter sp. MF024菌株合成2-苯乙醇產(chǎn)物的鑒定

對篩選獲得的Enterobactersp.MF024以3.0 g/LL-苯丙氨酸為唯一氮源生物轉(zhuǎn)化48 h后，提取發(fā)酵液中2-苯乙醇進行GC-MS分析。如圖3所示，在相同檢測條件下，Enterobactersp.MF024發(fā)酵液中提取的2-苯乙醇出峰時間為29.705 min（圖3A），與2-苯乙醇標準品（圖3C）的出峰時間一致。由MS結(jié)果可知，Enterobactersp.MF024發(fā)酵液中提取的樣品在m/z122出現(xiàn)吸收峰，為2-苯乙醇的碎片峰；在m/z91出現(xiàn)強吸收峰，為苯甲基的碎片峰（圖3B）[4]。該結(jié)果與2-苯乙醇標準品（圖3D）的各個峰一致。該發(fā)酵條件下2-苯乙醇產(chǎn)量為1.15 g/L。

圖3 發(fā)酵液GC-MS鑒定結(jié)果Fig. 3 GC chromatograms and mass spectra of 2-phenylethanol standard and 2-phenylethanol in fermentation broth

進一步利用紅外光譜法分析Enterobactersp. MF024發(fā)酵液中提取的2-苯乙醇樣品（圖4）。醇C—O鍵在1 260～1 000 cm-1有強吸收峰；在1 650～2 000 cm-1出現(xiàn)C—H和C＝C鍵的面內(nèi)振動的泛頻峰強度都很弱，可以判斷是苯環(huán)的一取代物。在3 650～3 200 cm-1處為2-苯乙醇中O—H鍵的低頻峰；2 940～2 970 cm-1處為—CH2—的吸收峰。該結(jié)果都與2-苯乙醇標準品特征峰一致。

圖42 -苯乙醇紅外光譜檢測結(jié)果Fig. 4 Infrared spectra of 2-phenylethanol standard and 2-phenylethanol in fermentation broth

2.3 Enterobacter sp. MF024菌株基因組中參與2-苯乙醇合成途徑關(guān)鍵基因分析

對Enterobactersp. MF024菌株基因組進行測序，該菌基因組大小為4 278 063 bp，共編碼4 512 個基因，基因平均長度是948.15 bp，N50值為577 909 bp （GenBank No. VCBB00000000）。通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對，在Enterobactersp. MF024菌株基因組中發(fā)現(xiàn)了參與艾氏途徑以L-苯丙氨酸為底物合成2-苯乙醇的轉(zhuǎn)氨酶（基因aspC、hisC、tyrB）、苯丙酮酸脫羧酶（基因pdc）和乙醇脫氫酶（基因adhP、adhE）[23]。此外，發(fā)現(xiàn)了該菌的aroF、aroB、aroQ、aroE、quiA、aroK、aroA、aroC、pheA和tryA等10 個基因編碼的酶參與了2-苯乙醇從頭合成途徑[24]。

2.4 Enterobacter sp. MF024菌株中2-苯乙醇合成途徑的確定

由于微生物可通過從頭合成途徑、艾氏途徑和苯乙胺途徑3 個途徑合成2-苯乙醇（圖1），本研究對Enterobactersp.MF024菌株的2-苯乙醇合成途徑進行分析。生理生化檢測結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，該菌L-苯丙氨酸脫羧酶為陰性，此酶為L-苯丙氨酸催化生成苯乙胺的關(guān)鍵酶。該酶的缺失表明Enterobactersp.MF024菌株無法通過苯乙胺途徑合成2-苯乙醇。

在艾氏途徑中，以L-苯丙氨酸為唯一氮源，依次生成苯丙酮酸和苯乙醛兩種中間產(chǎn)物，最終生成2-苯乙醇[7]。從頭合成途徑則無需添加L-苯丙氨酸，以葡萄糖為唯一碳源，通過一系列代謝途徑后，依次合成苯丙酮酸和苯乙醛，最終生成2-苯乙醇。因此，在前期以L-苯丙氨酸為底物的發(fā)酵實驗基礎(chǔ)上，分別以苯丙酮酸、苯乙醛為底物，對Enterobactersp.MF024菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，進一步驗證艾氏途徑。此外，不添加底物而以葡萄糖為唯一碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)，以驗證從頭合成途徑。由圖5 GC分析結(jié)果可知，無論是以苯丙酮酸、苯乙醛為底物發(fā)酵，還是以葡萄糖為碳源進行發(fā)酵，其產(chǎn)物均在29.704 min處有2-苯乙醇峰出現(xiàn)。MS結(jié)果進一步表明發(fā)酵產(chǎn)物都有2-苯乙醇的特征離子峰（m/z122、91）。因此，Enterobactersp.MF024菌株既能通過艾氏途徑，又能通過從頭合成途徑合成2-苯乙醇。

圖5 各底物發(fā)酵液的GC-MS鑒定結(jié)果Fig. 5 GC-MS identification of 2-phenylethanol in fermentation broths with various substrates

對Enterobactersp.MF024菌株兩條2-苯乙醇合成途徑的合成效率進行分析。當分別以10.0、20.0 g/L和30.0 g/L的葡萄糖為唯一碳源發(fā)酵48 h后（圖6A），得到2-苯乙醇質(zhì)量濃度分別為0.45、0.49 g/L和0.56 g/L。因此，在一定范圍內(nèi)，隨著葡萄糖初始質(zhì)量濃度的提高，2-苯乙醇產(chǎn)率相應提高。當分別以3.0、6.0 g/L或9.0 g/L的L-苯丙氨酸為唯一氮源發(fā)酵48 h后（圖6B），2-苯乙醇質(zhì)量濃度分別為1.02、1.07 g/L和1.15 g/L。因此，在一定范圍內(nèi)，隨著L-苯丙氨酸初始質(zhì)量濃度的提高，2-苯乙醇的產(chǎn)率相應提高。當分別以3.0、6.0 g/L或9.0 g/L的苯丙酮酸為底物發(fā)酵48 h后（圖6C），2-苯乙醇質(zhì)量濃度分別達到0.35、0.39 g/L和0.41 g/L。當分別以3.0、6.0 g/L或9.0 g/L的苯乙醛為底物發(fā)酵48 h后（圖6D），2-苯乙醇質(zhì)量濃度分別達到1.63、1.68 g/L和1.75 g/L。由于苯丙酮酸與苯乙醛為從頭合成途徑和艾氏途徑的中間產(chǎn)物，分別以兩者為底物發(fā)酵時Enterobactersp. MF024菌株均能合成2-苯乙醇，且隨著底物濃度的提高，2-苯乙醇產(chǎn)量相應提高，進一步表明該菌具備兩種合成途徑產(chǎn)2-苯乙醇的能力。

圖6 2-苯乙醇合成效率結(jié)果Fig. 6 Synthetic efficiency of 2-phenylethanol with glucose as carbon source, L-phenylalanine as nitrogen source and different substrates

自20世紀80年代艾式途徑報道以來，微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)2-苯乙醇的研究取得了很大發(fā)展。2-苯乙醇微生物合成途徑主要有3 條。其中，報道最多的是酵母菌以L-苯丙氨酸為唯一氮源，通過艾氏途徑生產(chǎn)2-苯乙醇[25]。為提高酵母菌產(chǎn)2-苯乙醇產(chǎn)量，Etschmann等[6]用馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）CBS 600發(fā)酵41 h后獲得2-苯乙醇0.89 g/L。徐崢等[26]用紫外誘變法選育釀酒酵母2-苯乙醇高產(chǎn)菌株，其2-苯乙醇產(chǎn)量達到3.55 g/L。汪琨等[27]優(yōu)化釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CWY 132的培養(yǎng)條件后，其生產(chǎn)2-苯乙醇產(chǎn)量提高至4.1 g/L。田勛[20]經(jīng)過對釀酒酵母細胞輔因子（NADH/NAD+）調(diào)控的研究，利用連續(xù)發(fā)酵85 h后積累獲得2-苯乙醇15.1 g/L。黃筱萍等[28]利用S. cerevisiaeH003雙罐連續(xù)補料發(fā)酵144 h后，通過原位產(chǎn)物分離技術(shù)獲得2-苯乙醇產(chǎn)量達29.86 g/L。綜上，增加2-苯乙醇產(chǎn)率的改進方式主要集中在合成途徑、遺傳修飾和代謝工程方面[29]。雖然酵母菌可通過艾氏途徑從L-苯丙氨酸高效合成2-苯乙醇，但L-苯丙氨酸的添加提高了生產(chǎn)成本，因此限制了其工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模。

從頭合成途徑產(chǎn)2-苯乙醇是以葡萄糖為唯一碳源，通過苯丙酮酸途徑（即莽草酸途徑）生成苯丙酮酸，苯丙酮酸再代謝為2-苯乙醇。苯丙酮酸途徑可聯(lián)系碳水化合物的代謝與芳香族化合物代謝，可直接由碳水化合物（例如葡萄糖）為底物代謝生產(chǎn)2-苯乙醇，無需添加L-苯丙氨酸，降低了生產(chǎn)成本[30]。目前報道通過該途徑合成2-苯乙醇的菌種較少，僅有Zhang Haibo等[15]篩選到Enterobactersp. CGMCC5087可通過從頭合成途徑發(fā)酵24 h后，生成0.1 g/L 2-苯乙醇。本研究分離篩選獲得了1 株具備從頭合成途徑和艾氏途徑生產(chǎn)2-苯乙醇的菌株，且從頭合成途徑產(chǎn)2-苯乙醇產(chǎn)量是目前已報道的菌株的5 倍。通過菌種誘變篩選和基因工程改造方法可進一步提高Enterobactersp. MF024菌株從頭合成途徑的2-苯乙醇產(chǎn)量，降低成本，為天然2-苯乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

本研究在環(huán)境土壤樣品中分離篩選到1 株可生產(chǎn)2-苯乙醇且對2-苯乙醇有一定耐受能力的新菌株Enterobactersp. MF024?；蚪M序列分析表明該菌存在從頭合成途徑和艾氏途徑的所有關(guān)鍵酶編碼基因。2-苯乙醇生物轉(zhuǎn)化實驗進一步驗證了Enterobactersp. MF024具備這兩種2-苯乙醇合成途徑，且2-苯乙醇產(chǎn)量分別達到0.56 g/L和1.15 g/L。研究為天然2-苯乙醇的工業(yè)生產(chǎn)提供了優(yōu)良的出發(fā)菌株。