周欽育，許喜林，趙 珊，黃燕燕，鄺嘉華，胡金雙，劉冬梅

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

人體腸道菌群位于胃腸道中，是復(fù)雜且動態(tài)平衡共生的微生物群落，包含約1 000 種不同的共生物種（古細菌、細菌、真菌、酵母菌和病毒）[1]。在健康的腸道菌群中，有益微生物占主導(dǎo)地位，并具有多種功能，如促進宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、增強機體代謝能力、調(diào)控維生素和激素的合成、抑制病原體生長等[2]。腸道菌群失衡會使腸道功能紊亂，并帶來與此相關(guān)的多種慢性疾病，包括癌癥、炎癥、心血管疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和精神疾病等。補充含益生菌的飲食可重新調(diào)節(jié)菌群失調(diào)，排除潛在危害并加強身體的自然防御機制[3]。

益生菌被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，其對宿主健康起到的作用也被許多學(xué)者研究。García-Ruiz等[4]發(fā)現(xiàn)乳酸菌屬益生菌會產(chǎn)生B族維生素，分泌乳酸鏈球菌素或有機酸等抗病原體的代謝產(chǎn)物。Yadav等[5]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌MTCC 5957和發(fā)酵乳桿菌MTCC 5898可下調(diào)氧化應(yīng)激作用，膽固醇降低，具有抗糖尿病的特性。Kim等[6]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌K 10具有抗肥胖的作用。益生菌的治療效果和應(yīng)用技術(shù)特征隨菌株種類改變，且具有很大差異，因而挖掘新型益生菌具有重要意義。同時，新益生菌應(yīng)被證明無毒，且在宿主的胃腸道中有良好定殖性后，才有可能發(fā)揮功效[7-8]。?panová等[9]發(fā)現(xiàn)人源性菌株更適宜在人體胃腸道中生存，哺乳嬰兒腸道及母乳中分離的乳桿菌屬是乳品益生菌的重要來源，具有更特異性的健康促進作用。

格氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri），又稱為加氏乳桿菌，是同型發(fā)酵乳酸菌[10]，天然存在于胃腸道、陰道或母乳中，被美國FDA定義為一般公認安全類添加劑（generally recognized as safe，GRAS）狀態(tài)微生物[11]。Kullen等[12]在2001年首次分離出格氏乳桿菌，對其DNA雜交模式研究后，明確了格氏乳桿菌與其他乳桿菌的16S rRNA基因區(qū)別。由于我國菌種研究起步較晚，且格氏乳桿菌的發(fā)現(xiàn)也較晚，目前國內(nèi)對于格氏乳桿菌的報道多集中在陰道、腸道菌群的分離、篩選、鑒定及生長特性的研究中[13-15]。國外學(xué)者對格氏乳桿菌的益生性研究在近幾年已經(jīng)成為熱點，發(fā)現(xiàn)其在食品、醫(yī)藥行業(yè)具有廣大應(yīng)用前景[16-18]，但對嬰兒腸道源格氏乳桿菌的研究仍然有限，大多數(shù)被研究的格氏乳桿菌來自于人類陰道。

本實驗從廣州1 月齡嬰兒腸道中分離、鑒定出1 株格氏乳桿菌，將其命名為格氏乳桿菌LGZ 1029，對其進行安全性評價，包括溶血檢測、耐藥性實驗以及動物急性毒理實驗。以具有良好黏附性能和益生功能的商業(yè)菌株鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）ATCC 7469為對照，對格氏乳桿菌LGZ 1029的益生特性進行探究，包括胃腸道定殖能力、抑菌能力及抗氧化能力的測定，旨在發(fā)掘格氏乳桿菌LGZ 1029作為新型益生菌的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級KM小鼠20 只，體質(zhì)量18～22 g，4 周，小鼠及飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供（生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2014-0007）。

格氏乳桿菌LGZ 1029由華南理工大學(xué)食品質(zhì)量與安全實驗室從廣州1 月齡嬰兒腸道糞便中分離篩選得到，并于2019年4月29日保存于廣東微生物菌種保藏中心，保存的菌株編號為GDMCC 60641。

鼠李糖乳桿菌ATCC 7469、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 12598 廣東省微生物菌種保藏中心；細菌DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；基礎(chǔ)MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂平板廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胃蛋白酶1∶3 000、胰蛋白酶1∶250、1,1-苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海源葉生物科技有限公司；Triton X-100、乙二胺四乙酸二鈉、Tris、K-B藥敏紙片、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（均為分析純） 廣州卯林試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MK3型超凈工作臺 上海日島科學(xué)儀器有限公司；LRH-250A-II型生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；JW-3021HR型高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司；CYTATION5型紫外分光光度計 美國博騰儀器有限公司；680型多功能酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；Five Easy Plus型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MHY-28473型麥?zhǔn)蠞岫扔?北京美華科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分子生物學(xué)鑒定

調(diào)整洪穎等[19]的方法進行菌株DNA的提取。首先從純菌落平板上刮菌到已滅菌的生理鹽水中，調(diào)至麥?zhǔn)蠞岫葹?.5，吸取1.5 mL菌液至離心管，于室溫、12 000 r/min離心5 min，去除上清液，沉淀重懸于180 μL緩沖液中（20 mmol/L、pH 8.0的Tris；2 mmol/L EDTA-2Na；體積分數(shù)為1.2% Triton X-100；終質(zhì)量濃度為20 mg/mL溶菌酶），37 ℃處理30 min后，采用細菌DNA提取試劑盒提取格氏乳桿菌DNA，用核酸蛋白檢測儀確認OD260nm/OD280nm為1.8左右，然后以該DNA為模板，采用細菌16S rDNA的通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’），進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），其中PCR擴增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性15 s；55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，進行30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴增結(jié)束后，凝膠電泳檢測回收，在-20 ℃保存。將純化后的PCR產(chǎn)物送至廣州基迪奧生物技術(shù)有限公司進行測序。

將上述DNA測序得到的菌株序列導(dǎo)入基本局部比對檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）中，參考田亞晨等[20]的方法，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3.2 菌株的安全性評價

1.3.2.1 溶血實驗

將活化好的格氏乳桿菌LGZ 1029以及質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC 25922用已滅菌的接種環(huán)劃線接于血平板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察平板中菌落周圍有無溶血圈出現(xiàn)并拍照記錄。

1.3.2.2 抗生素耐藥性實驗

選用K-B藥敏紙片擴散法進行格氏乳桿菌的耐藥性評價[21]。取活化后的濃度約為1.0×108CFU/mL格氏乳桿菌菌液0.1 mL，均勻涂布于滅菌后冷卻凝固的MRS瓊脂培養(yǎng)基表面。將K-B藥敏紙片用無菌鑷子貼至瓊脂表面，室溫放置40 min，然后在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，再用精確度為0.01 mm的游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑并記錄，每種抗生素平行實驗3 組，同時以金黃色葡萄球菌ATCC 12598作為對照菌。耐藥性的判斷參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）于2015年公布的藥敏試紙標(biāo)準(zhǔn)M100—S25《抗菌藥物敏感性的性能標(biāo)準(zhǔn)》[22]。

1.3.2.3 小鼠經(jīng)口急性毒理實驗

受試物為含格氏乳桿菌LGZ 1029的菌液，濃度為1×108CFU/mL。實驗采用限量法，只設(shè)10.0 g/kg（體質(zhì)量計）劑量組，即取經(jīng)檢驗檢疫合格的小鼠20 只，雌雄各半。實驗前動物禁食過夜，不限制飲水。空腹灌胃1 次，每次灌胃容量為20.0 mL/kg。若染毒則要立即觀察并記錄中毒表現(xiàn)，以及死亡數(shù)和死亡時間，觀察期為14 d。

1.3.3 菌株的益生特性分析

1.3.3.1 胃腸液耐受性實驗

根據(jù)Maragkoudakis等[23]的方法進行胃液耐受性評價。將活化后的格氏乳桿菌LGZ 1029菌液按10%的接種量接種至pH值分別為2.0、2.5、3.0、4.0的人工胃液中，混合均勻，于37 ℃培養(yǎng)0、1、2、3 h后取樣，進行平板菌落計數(shù)，同時設(shè)添加與人工胃液等體積的蒸餾水為空白對照組。

根據(jù)Guo Zhuang等[24]方法進行腸液耐受性評價。將活化后的格氏乳桿菌LGZ 1029菌液按體積比為10%的接種量接種于人工腸液中（pH 8.0），于37 ℃培養(yǎng)0、2、4、6、8 h后取樣，進行平板菌落計數(shù)，同時設(shè)添加與人工腸液等體積的蒸餾水為空白對照組。按式（1）計算格氏乳桿菌在人工胃腸液中的存活率。

式中：Nt為乳桿菌在人工胃腸液處理th后存活的數(shù)量/（CFU/mL）；N0為0 h時乳桿菌的活菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.3.2 膽鹽耐受性實驗

根據(jù)Maragkoudakis等[23]方法進行膽鹽耐受性評價。取活化后的格氏乳桿菌菌液按體積分數(shù)為10%的接種量分別接種于含牛膽鹽（0.1、0.2、0.3、0.5 g/100 mL）的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)0、1、2、3、4 h后取樣，進行平板菌落計數(shù)，設(shè)置無膽鹽的空白對照組。按式（2）計算格氏乳桿菌在含膽鹽培養(yǎng)基中的存活率。

式中：Nt為乳桿菌在含膽鹽的MRS培養(yǎng)基中處理th后存活的數(shù)量/（CFU/mL）；N0為0 h時乳桿菌的活菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.3.3 黏附性實驗

黏附性實驗以廣泛應(yīng)用的商業(yè)菌株鼠李糖乳桿菌ATCC 7469為對照菌株，測定2 株菌的自凝聚能力及疏水能力。

自凝聚能力的測定：將乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中37 ℃孵育24 h后，于4 ℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，再用滅菌的PBS（pH 7.4）清洗2 次，離心條件同上，最后再用PBS重懸菌體，使菌懸液的初始OD600nm值為0.5±0.02。將菌懸液在37 ℃放置24 h，分別在第0、2、4、6、24小時取上清液，以無菌PBS為空白對照，于600 nm波長處檢測吸光度。按式（3）計算菌株的自凝聚能力。

式中：At為t時刻的吸光度；A0為t＝0時的吸光度。

疏水性的測定：同自凝聚能力測試中菌液處理，使乳桿菌的菌懸液初始OD600nm值為0.5±0.02。取適量菌懸液，加入等體積的二甲苯，旋渦振蕩2 min后，約25 ℃室溫放置30 min，分兩相，以無菌PBS為空白組，于600 nm波長處檢測下層水相的吸光度。按式（4）計算菌株的疏水性。

式中：A30為二甲苯振蕩處理30 min后的吸光度；A0為t＝0時的菌懸液吸光度。

1.3.3.4 抑菌能力測定

參考劉冬梅等[25]測定抑菌能力的方法進行修改。以大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 12598為指示菌種，取無菌生理鹽水，將2 株致病菌稀釋至濃度為106～107CFU/mL，再取菌液0.1 mL均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基表面，將牛津杯中心對稱放置于培養(yǎng)基表面，每個牛津杯內(nèi)注射100 μL待測樣品液。將平板置于4 ℃擴散24 h后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小。

1.3.3.5 抗氧化能力測定

參照田圓圓等[26]方法測定乳桿菌DPPH自由基清除能力。首先稱取0.007 8 g DPPH，用無水乙醇溶解并定容至100 mL制得0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，室溫避光放置，現(xiàn)配現(xiàn)用。將2.0 mL待測樣品與2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液混合均勻，室溫避光放置30 min，于室溫、8 000 r/min離心10 min，取上清液于517 nm波長處測定吸光度。按式（5）計算菌株的自由基清除率。

式中：A樣品為待測樣品加等體積DPPH乙醇溶液的吸光度；A空白為待測樣品加等體積無水乙醇的吸光度；A對照為PBS加等體積DPPH乙醇溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。采用Excel、SPSS Statistics 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用OriginPro 9.1進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定結(jié)果

經(jīng)16S rDNA測序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中挑選出合適的菌株，與測試乳桿菌進行比較，構(gòu)建進化樹，作系統(tǒng)分析，結(jié)果如圖1所示，測試乳桿菌與各已知序列的格氏乳桿菌的同源性較大，結(jié)合生理生化特征分析，確定菌株為格氏乳桿菌種，將其命名為LGZ 1029，于2019年4月29日保存于廣東微生物菌種保藏中心，保存的菌株編號為GDMCC 60641。

圖1 格氏乳桿菌LGZ 1029的進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree constructed for L. gasseri LGZ 1029

2.2 菌株的安全性

2.2.1 菌株的溶血活性評估

乳酸菌在代謝過程中可能會產(chǎn)生溶血毒素溶解血紅細胞，導(dǎo)致貧血等反應(yīng)出現(xiàn)[27]。血平板劃線法是有效檢測細菌溶血性的方法，溶血檢測結(jié)果如圖2所示，圖2a的質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC 25922菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明溶血圈，結(jié)果呈陽性，而圖2b的格氏乳桿菌LGZ 1029長出乳白色菌落，周圍沒有明顯溶血圈，呈陰性結(jié)果，可說明格氏乳桿菌LGZ 1029及代謝產(chǎn)物對血細胞無損傷性。

圖2 溶血活性檢測結(jié)果Fig. 2 Results of hemolysis test

2.2.2 菌株的耐藥性評價

格氏乳桿菌LGZ 1029的抗生素耐藥性標(biāo)準(zhǔn)及檢測結(jié)果分別如表1和表2所示，選取的抗生素種類包括多肽類的萬古霉素、大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素、四環(huán)素、青霉素類的氨芐西林以及氨基糖苷類的卡那霉素。由表1、2可知，質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 12598對各抗生素產(chǎn)生的抑菌圈直徑均在S范圍內(nèi)，說明抗生素有效，可以用于鑒定菌株的耐藥性。格氏乳桿菌LGZ 1029對各類抗生素產(chǎn)生的抑菌圈直徑均在S范圍內(nèi)，即格氏乳桿菌對其均不具有抗性。檢測依據(jù)為美國CLSI制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[22]。

表1 藥敏紙片含藥量及耐藥性判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Drug load on drug sensitive discs and judgment criteria for drug resistance

表2 抑菌圈直徑及抗性結(jié)果Table 2 Inhibition zone diameters mm

2.2.3 菌株的動物毒理性評價

益生菌株在投入食品使用前，還要進行更多的體內(nèi)安全性評價，因此實驗先進行了小鼠急性毒理實驗以驗證格氏乳桿菌LGZ 1029的安全性。結(jié)果如表3所示，灌服菌液后，觀察期內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)中毒癥狀或者死亡，小鼠體質(zhì)量正常升高，實驗期內(nèi)無異常表現(xiàn)。實驗結(jié)束后，對存活的動物解剖，肉眼未見異常。由此可知，活菌數(shù)為1×108CFU/mL的格氏乳桿菌LGZ 1029菌液對雌雄性KM小鼠急性經(jīng)口毒性的半致死率（lethal dose of 50%，LD50）大于10.0 g/kg，屬于無毒級食品。

表3 受試物對小鼠經(jīng)口急性毒性實驗結(jié)果Table 3 Acute oral toxicity evaluation of L. gasseri LGZ 1029 in mice

2.3 菌株的耐受性

2.3.1 胃腸液耐受性

圖3為格氏乳桿菌LGZ 1029在人工胃液中的存活率結(jié)果，在人工胃液中培養(yǎng)3 h后，格氏乳桿菌在pH 2.5～4.0的存活率均保持在95%以上，存活率無顯著差異（P＜0.05），而在pH 2.0的人工胃液中培養(yǎng)3 h，存活率仍有87.27%。益生菌在胃腸道內(nèi)的存活率是評價益生菌的益生潛力的重要參數(shù)。因此，耐受模擬胃腸液是評價益生菌作用發(fā)揮的基本指標(biāo)[28]。陳曉華等[15]在研究格氏乳桿菌的益生性質(zhì)時，發(fā)現(xiàn)菌株在pH 2.0的人工胃液中存活率僅為71.43%，李文靜等[29]研究乳酸桿菌的益生性質(zhì)時，發(fā)現(xiàn)菌株在pH 3.0的模擬胃液中存活率范圍是82.22%～91.65%。相比而言，本實驗格氏乳桿菌LGZ 1029對胃液的耐受能力較強。

圖3 胃液耐受性結(jié)果Fig. 3 Tolerance of LGZ1029 to artificial gastric juice

如表4所示，格氏乳桿菌LGZ 1029在人工腸液中經(jīng)過8 h培養(yǎng)后，活菌數(shù)沒有下降，反而略有上升，與空白組相比沒有顯著性差異，表現(xiàn)出格氏乳桿菌LGZ 1029對人工腸液有較高的耐受性。

表4 格氏乳桿菌LGZ 1029在人工腸液中活菌數(shù)變化Table 4 Change in viable cell count of L. gasseri LGZ1029 incubated in artificial intestinal fluids（lg（CFU/mL））

2.3.2 膽鹽耐受性

如圖4所示，在0.5 g/100 mL的膽鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后存活率不足60%，生存率較低，而在0.3 g/100 mL的膽鹽培養(yǎng)基中孵育4 h后存活率可達78.27%，在0.1 g/100 mL和0.2 g/100 mL的膽鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后存活率高達90%以上，此現(xiàn)象與陳曉華等[15]的研究結(jié)果類似。人的腸道中含有膽鹽，能幫助人體消化和吸收脂肪，但同時會抑制和干擾腸道細菌的生長，破壞進入腸道的益生菌細胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致益生菌不能在腸道中存活并發(fā)揮功效[30]。雖然目前沒有研究指出益生菌在腸道中需要耐受的最高膽鹽濃度，但較高膽鹽耐受性仍作為評判菌株益生潛力的標(biāo)準(zhǔn)之一。格氏乳桿菌LGZ 1029在較低濃度的膽鹽培養(yǎng)基中仍可以保持活性并發(fā)揮功效，因此其對人工腸液有較高耐受性。此外，格氏乳桿菌LGZ 1029在模擬胃腸道消化液中仍可保持較高活性的3 個實驗結(jié)果均有利于該菌株在胃腸道內(nèi)以較高的活菌數(shù)到達其作用靶點，發(fā)揮其益生功能。

圖4 膽鹽耐受性結(jié)果Fig. 4 Tolerance of LGZ1029 to bile salts

2.4 菌株的黏附性

2.4.1 自凝聚能力

乳酸菌的疏水性、自凝聚能力和生物膜的形成能力呈正相關(guān)關(guān)系，可作為菌體黏附能力的指標(biāo)。自凝聚能力高的菌株在競爭細胞基質(zhì)-宿主結(jié)合位點時處于優(yōu)勢地位，除有利于其在腸道中的定植外，還可以有效避免病原體與宿主結(jié)合，從而阻止致病菌的黏附。Han Qi等[31]將菌株的自凝聚率分為3 個等級：16～35%為低等，35～50%為中等，50%以上為高等自凝聚能力。

如圖5所示，2 株乳桿菌的自凝聚率均隨時間延長而增加，二者均在前6 h內(nèi)迅速凝聚，在24 h時達到最高值，此實驗結(jié)果與陳臣[32]測試乳酸桿菌自凝聚能力的研究結(jié)果一致。格氏乳桿菌LGZ 1029在整個靜置過程中自凝聚能力均高于鼠李糖乳桿菌，且在4 h時自凝聚率已達到64.18%，屬于高自凝聚能力范圍，最終24 h時自凝聚率達到了88.49%，即格氏乳桿菌具有較高的自凝聚能力，其可能具有較高的黏附腸上皮細胞的能力。

圖5 乳酸桿菌的自凝聚能力Fig. 5 Self-aggregation capacity of Lactobacillus

2.4.2 疏水性

菌株的疏水性是決定細菌非特異性黏附到各種生物、非生物表面及界面的最重要的因素之一，也是影響細菌吸收和降解疏水性有機物質(zhì)的主要影響因素之一，乳酸菌的高度疏水性有利于菌株在腸道中存活，維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)。Hernández-Alcántara等[33]指出，疏水性大于60%的菌株高度疏水，疏水性位于40%～60%之間是中度疏水菌，疏水性低于40%時的菌株親水。經(jīng)測定，格氏乳桿菌LGZ 1029的疏水性可達到79.75%，遠高于鼠李糖乳桿菌的疏水性（43.01%），格氏乳桿菌LGZ 1029是高度疏水性菌株，其在疏水性的測定中存在菌種特異性。

2.5 菌株的抑菌能力

本實驗選取了金黃色葡萄球菌ATCC 12598（革蘭氏陽性菌）和大腸桿菌ATCC 25922（革蘭氏陰性菌）作為指示菌，根據(jù)抑菌圈直徑判斷格氏乳桿菌LGZ 1029和鼠李糖乳桿菌ATCC 7469的抑菌活性，結(jié)果如表5所示。乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物如有機酸、過氧化氫或分泌的細菌素可有效抑制腸道內(nèi)有害菌的生長，且減少腐敗菌產(chǎn)生的毒素，因而抑菌活性也是菌株的重要益生特性[34]。乳酸桿菌上清液的抑菌效果好于菌懸液，說明2 株菌的抑菌能力可能源于胞外代謝產(chǎn)物，對指示菌有一定抑制作用。相比于鼠李糖乳桿菌ATCC 7469，格氏乳桿菌LGZ 1029對金黃色葡萄球菌的抑菌效果極好，可能與其代謝產(chǎn)物有關(guān)，Otero等[35]發(fā)現(xiàn)格氏乳桿菌產(chǎn)有機酸和肽類物質(zhì)，并對金黃色葡萄球菌造成較大的形態(tài)損傷，進而有效抑制金黃色葡萄球菌的生長。格氏乳桿菌LGZ 1029對大腸桿菌的抑制效果與鼠李糖乳桿菌ATCC 7469接近。

表5 不同菌液成分的抑菌圈直徑Table 5 Diameters of inhibition zone of S. aureus and E. coli when exposed to the culture supernatant and cell suspension

2.6 菌株的抗氧化能力

如圖6所示，菌株的發(fā)酵液、上清液及活菌體的DPPH自由基清除率均隨活菌數(shù)的增加而逐漸增大。在活菌數(shù)為107CFU/mL時，格氏乳桿菌發(fā)酵液的DPPH自由基清除率達到最高值87.07%，另測得活菌數(shù)同樣為107CFU/mL的鼠李糖乳桿菌ATCC 7469發(fā)酵液的DPPH自由基清除率為80.24%，田圓圓等[26]研究的8 株乳酸桿菌DPPH自由基清除率最高值僅為52.48%，說明格氏乳桿菌具有較高的DPPH自由基清除能力。趙彤等[36]指出機體的抗氧化能力與慢性疾病的發(fā)生及機體衰老密切相關(guān)，機體的強抗氧化能力可以預(yù)防某些疾病并抵抗衰老。已有許多研究證明，乳酸桿菌是優(yōu)質(zhì)的天然抗氧化劑，攝入一定數(shù)量的乳酸桿菌，可有效預(yù)防氧化應(yīng)激作用[4-5,37]。而DPPH自由基清除能力是體外評價菌株抗氧化性的重要指標(biāo)。

圖6 格氏乳桿菌LGZ 1029的DPPH自由基清除能力Fig. 6 DPPH radical scavenging capacity of Lactobacillus gasseri LGZ 1029

此外，格氏乳桿菌的發(fā)酵液及上清液的DPPH自由基清除能力優(yōu)于活菌體，推測為菌株在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有較高的DPPH自由基清除能力。

3 結(jié) 論

本實驗以1 株分離自廣州1 月齡嬰兒腸道內(nèi)的乳酸桿菌為研究對象，對其進行分子生物學(xué)鑒定，確認為格氏乳桿菌并命名為LGZ 1029。通過溶血檢測、耐藥性檢測、小鼠急性毒理實驗對格氏乳桿菌LGZ 1029進行體內(nèi)外安全性評價，未檢測到有害代謝產(chǎn)物溶血毒素，格氏乳桿菌LGZ 1029對各種類抗生素都表現(xiàn)出了耐藥敏感性，含格氏乳桿菌LGZ 1029的菌液對雌雄性KM小鼠急性經(jīng)口毒性LD50大于10.0 g/kg，屬于無毒級菌株，表明菌株安全。益生特性結(jié)果顯示，格氏乳桿菌LGZ 1029在模擬胃腸道消化液中可保持較高活性，具有大于50%的高自凝聚能力和高疏水性（79.75%），黏附性高于對照組鼠李糖乳桿菌ATCC 7469。抑菌實驗顯示格氏乳桿菌對金黃色葡萄球菌有較高的抑菌效果，且上清液的抑菌活性較高，對大腸桿菌的抑菌效果與LGG相近?？寡趸芰y定結(jié)果表明，格氏乳桿菌LGZ 1029的發(fā)酵液、上清液及活菌體均具有一定的DPPH自由基清除能力，其中活菌數(shù)為107CFU/mL的發(fā)酵液清除能力最高且高于同等濃度鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵液。本實驗為發(fā)掘格氏乳桿菌LGZ 1029的益生功能特性提供參考，也為豐富我國益生菌種資源庫、開發(fā)食療性益生菌產(chǎn)品提供參考。