喬青青，郝莉花*，鞏凡，葛靜，方?？?/p>

1(河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，河南 鄭州，450000)2(河南省食品安全數(shù)據(jù)智能重點實驗室，河南 鄭州，450000)3(仲愷農(nóng)業(yè)工程學院，廣東 廣州，510000)

焦糖色素是一種世界廣泛使用的食品色素，占整個食品著色劑使用量的90%以上[1]，由于它具有棕褐色色澤、良好的口感和穩(wěn)定性，被廣泛用于食醋、醬油、飲料和啤酒等水溶性食品中[2]。國際技術(shù)焦糖色素協(xié)會根據(jù)生產(chǎn)過程中所采用的反應(yīng)劑把焦糖色素分為四類，分別為普通法(Ⅰ類)、苛性硫酸鹽法(Ⅱ類)、氨法(Ⅲ類)和亞硫酸銨法(Ⅳ類)[3]。其中，Ⅲ類和Ⅳ類焦糖色素在制作過程中會產(chǎn)生副產(chǎn)物4-甲基咪唑[4]。

4-甲基咪唑是具有多元毒性的化合物，其毒理學性質(zhì)包括：抑制細胞色素P450同功酶、在人的肝臟中發(fā)生催化反應(yīng)、產(chǎn)生許多低分子質(zhì)量致癌物、誘發(fā)動物驚厥、導致甲狀腺腫瘤和白血病的風險[5-8]。因此，我國的食品安全國家標準中規(guī)定4-甲基咪唑的含量不得高于200 mg/kg，同時對不同食品中焦糖色的含量也進行了限定[3,9]。2-甲基咪唑是4-甲基咪唑的同分異構(gòu)體，目前，國內(nèi)外均未對這兩類甲基咪唑進行明確的限量規(guī)定，但其污染的風險性仍無法排除[4]。因此，準確測定焦糖色中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑十分重要。

檢測焦糖色素和食品中2-甲基咪唑、4-甲基咪唑的方法主要有紙層析法、分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-串接質(zhì)譜法、液相色譜串接質(zhì)譜法等。早期研究中所用的紙層析法以定性為主，定量誤差較大[10-11]。GB 1886.64—2015中規(guī)定4-甲基咪唑的檢測方法為氣相色譜法(火焰離子化檢測器，flame ionization detector，F(xiàn)ID檢測器)。對于這種小分子化合物FID檢測器響應(yīng)較差，當前毛細管色譜柱超量進樣又會導致進樣過載，峰寬大且嚴重拖尾，加之其他化合物對基線的影響，容易出現(xiàn)假陽性，定量不準確的問題。液相色譜法需要對樣品衍生，重現(xiàn)性較低[12]。

最近的研究將檢測重點轉(zhuǎn)移至質(zhì)譜領(lǐng)域，所開發(fā)的方法較多，僅2019—2020年，在中文文獻中檢索到多篇串接質(zhì)譜檢測2-甲基咪唑、4-甲基咪唑的研究，其中5篇為液相串接質(zhì)譜法。王穎等[13]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豆制品中3種甲基咪唑類化合物含量；王愛軍[14]采用氣相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜測定焦糖色中4-甲基咪唑含量；王冰玉等[15]采用高效液相色譜法測定咪唑生產(chǎn)工藝中反應(yīng)液中咪唑及2種雜質(zhì)：2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量；公丕學等[16]采用固相萃取UPLC-MS/MS測定黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量；鈕正睿等[17]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測保健食品中4-甲基咪唑含量。液相、氣相串接質(zhì)譜法能夠有效排除雜質(zhì)干擾，測定結(jié)果準確，雖然通用性好，但是儀器較昂貴，檢測成本高。相比串接質(zhì)譜，氣相單級質(zhì)譜也能測定[18]，但常用的電子轟擊電離(electron ionization，EI)源不具有選擇性，低分子質(zhì)量的甲基咪唑容易受到多雜質(zhì)干擾，繼而出現(xiàn)較多假陽性。與許多含氮化合物一樣，由于咪唑氮原子具有化學反應(yīng)活性，因此可以采用具有特殊選擇性的離子源模式，如正化學源模式對少數(shù)含氮化合物有響應(yīng)，對很多雜質(zhì)沒有響應(yīng)，可以消除多數(shù)無法離子化雜質(zhì)的干擾[19-20]，不易出現(xiàn)假陽性。

本研究采用氣相色譜-正化學源質(zhì)譜法檢測甲基咪唑，選擇適宜的前處理方式并優(yōu)化前處理條件和儀器參數(shù)，建立了同時測定焦糖色中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的方法。該方法具有高度選擇性，能夠避免單擊質(zhì)譜條件下雜質(zhì)的干擾，獲得較好的檢出限和精密度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：2-甲基咪唑(純度99.4%)、4-甲基咪唑(純度99.1%)，Bepure公司；硅藻土，美國Supelco公司；焦糖色素(市售)；正己烷，美國Tedia公司；二氯甲烷(色譜級)，天津市恒興化學試劑制造有限公司；三氯甲烷(色譜級)、丙酮(色譜級)， 煙臺市雙雙化工有限公司；乙酸乙酯(色譜級)、乙腈(色譜級)，霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司；氫氧化鈉(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；三級水，實驗室自制。

儀器：Agilent 7200氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有可切換的EI、CI源)，美國安捷倫公司；Vortex Mixer QL-866旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；FA2004 N電子天平，上海箐海儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

在50 mL離心管中準確稱取(0.5±0.02) g焦糖色，加入250 μL氫氧化鈉溶液(氫氧化鈉水溶液3 mol/L)混合均勻。加入少量硅藻土，旋蓋后渦旋混勻，繼續(xù)添加硅藻土混勻直至形成半干、均勻的混合物(離心管壁上不粘有焦糖色)。上述混合物完全轉(zhuǎn)移至帶有砂芯漏斗的玻璃柱中，少許開啟旋塞，將洗脫溶劑傾倒至柱中，待溶劑通過色譜柱流至旋塞時關(guān)閉旋塞，溶劑停留在柱層中5 min。打開旋塞，繼續(xù)添加溶劑并收集洗脫液10～15 mL(控制流速5 mL/min)，并定容至20 mL，混合均勻；定容液過0.22 μm有機膜，置于進樣小瓶中，待上機。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：DB-WAXetr(30 m×320 μm×1 μm)。載氣：He；流量：2 mL/min；進樣口溫度：220 ℃。進樣模式：脈沖不分流。程序升溫：40 ℃保持1 min，5 ℃/min至115 ℃，后運行260 ℃(3 mL/min)保持5 min，傳輸線溫度：280 ℃。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源：化學源；模式：正模式(正化學電離，positive chemical ionization，PCI模式)；離子源溫度：300 ℃；發(fā)射電流：4.4 μA；電子能量：240 eV。采集模式：Scan，掃描m/z=35～100，采集頻率:5質(zhì)譜圖/s。EI源根據(jù)文獻[14]中的條件設(shè)置。

1.2.4 標準溶液配制

準確稱量2-甲基咪唑和4-甲基咪唑標準品(0.01 g)，用乙酸乙酯定容至10 mL，配制質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL標準儲備液D1；準確量取1.00 mL標準儲備液D1，用乙酸乙酯定容至100 mL，配制成10 μg/mL儲備液D2；量取50、100、200、400、800 μL儲備液D2，分別加入乙酸乙酯定容至1 mL，配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL的標準溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑質(zhì)譜采集模式的研究

2.1.1 PCI模式

研究采用1.2.2色譜條件，分別用EI、PCI、負化學電離(negative chemical ionization，NCI)3種離子源模式電離并測定儲備液D2，獲得2-甲基咪唑和4-甲基咪唑色譜圖(圖1)和質(zhì)譜圖(圖2)。

由圖1可以看出，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑保留時間分別為8.480和8.992 min，EI模式下和NIST14庫匹配度>80%，化合物定性準確；PCI模式下，在相同保留時間仍可以發(fā)現(xiàn)峰形較好的2個峰，質(zhì)譜圖(圖2)主要m/z為83、84、82，因此選擇m/z=83為定量離子，m/z=84和82為定性離子。

a-EI模式；b-PCI模式圖1 質(zhì)量濃度為10 μg/mL的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑色譜圖Fig.1 Chromatograms of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in the level of 10 μg/mL

a-EI模式下2-甲基咪唑；b-EI模式下4-甲基咪唑；c-PCI模式下2-甲基咪唑；d-PCI模式下4-甲基咪唑圖2 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在EI、PCI模式下的質(zhì)譜圖Fig.2 MASS chromatogram of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in the mode of PCI-MS /MS and EI-MS/MS

2.1.2 PCI條件下MS/MS模式

采用1.2.2色譜條件，在PCI模式基礎(chǔ)上測定研究儲備液D2的MS/MS產(chǎn)物離子，優(yōu)化碰撞能量5、10、15、20、25 V，最終得到產(chǎn)物離子最豐富的碰撞能量為15 V，產(chǎn)物離子圖見圖3。母離子m/z=83產(chǎn)生的子離子主要為m/z=42和56，因此，如果采用PCI模式串接三重四極桿質(zhì)譜檢測，應(yīng)選擇定量離子m/z=83→42(碰撞能量15 V)、定性離子m/z=83→56(碰撞能量15 V)。

a-2-甲基咪唑；b-4-甲基咪唑圖3 PCI模式下MS/MS產(chǎn)物離子圖Fig.3 The ion chromatograms in the mode of PCI

2.2 前處理方法的選擇與優(yōu)化

2.2.1 洗脫劑的選擇

采用文獻[14]所述方法在樣品焦糖色中檢出98 mg/kg 4-甲基咪唑，2-甲基咪唑未檢出，因此本研究在樣品中添加100 mg/kg的2-甲基咪唑，制備待測樣品S1并對前處理的方法選擇和優(yōu)化。

將制備的待測樣品S1，采用1.2.1所述前處理方法，選取不同種類洗脫劑(正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、丙酮)50 mL洗脫樣品并按照2.1.1所述PCI單極質(zhì)譜方法檢測，以回收率為指標選擇合適溶劑，每組實驗重復2次，結(jié)果見表1。

由表1可以看出，正己烷無法洗脫待測物(回收率為0%)，因此不適合作為洗脫劑，但可用作復雜體系除脂。二氯甲烷作為洗脫劑時，對4-甲基咪唑回收率107.12%，2-甲基咪唑回收率僅為67.11%，因此不適合同時檢測2種化合物。

表1 洗脫劑種類對2-甲基咪唑和4-甲基咪唑洗脫回收率的影響(n=3)Table 1 Influence of different eluents on recoveries of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole (n=3)

三氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯為洗脫劑時對2種化合物洗脫效果較好，但其中三氯甲烷毒性較大且產(chǎn)生較強的基質(zhì)放大效應(yīng)(回收率121.25%)，乙腈極性較大，洗脫后待測液顏色較深，均不適合作為洗脫劑。乙酸乙酯洗脫后回收率接近100%，溶劑毒性較小，因此選擇乙酸乙酯作為本研究的洗脫劑。此外，由于丙酮洗脫后焦糖色素大量溶出，無法產(chǎn)生有效凈化效果，因此不適合作洗脫劑。

2.2.2 洗脫液用量

采用乙酸乙酯作為洗脫劑，將制備的待測樣品S1，采用1.2.1所述前處理方法測定，并按照2.1.1所述PCI單極質(zhì)譜方法檢測，考察洗脫液用量對2-甲基咪唑和4-甲基咪唑洗脫回收率，結(jié)果如表2所示。

表2 洗脫液體積對2-甲基咪唑和4-甲基咪唑洗脫回收率的影響(n=3)Table 2 Influence of different eluents volume on recoveries of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole (n=3)

由表2可以看出，隨著洗脫液用量增加，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑回收率呈上升趨勢，超過10 mL時回收率接近100%，繼續(xù)增加溶劑的洗脫量不僅不會增加回收率，反而使精密度和回收率下降，這可能是因雜質(zhì)的量增加而導致基質(zhì)效應(yīng)影響顯著導致。因此，本研究洗脫液體積選擇為10～15 mL。

2.2.3 線性范圍、定量限、精密度、回收率

配制0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑標準系列濃度進行測定，按照2.1.1所述PCI單極質(zhì)譜方法檢測，以定量離子峰面積S為縱坐標，質(zhì)量濃度ρ(μg/mL)為橫坐標繪制標準工作曲線，2-甲基咪唑標準溶液在0.5～0.8 μg/mL范圍內(nèi)，線性回歸方程為y=10 099x+6 279，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，4-甲基咪唑標準溶液在0.5～0.8 μg/mL范圍內(nèi)，線性回歸方程為y=8 836x+8 824，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，線性均較好。

按照3倍性噪比計算檢出限，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑儀器檢出限均為0.5 μg/mL，稱樣量為0.5 g，定容體積20 mL時，方法檢出限為20 mg/kg，滿足焦糖色中4-甲基咪唑含量的檢驗要求(限量值為200 mg/kg)。對2-甲基咪唑空白焦糖色樣品加標，考察了3個加標水平(20、80和320 mg/kg)，每個水平平行試驗3次(n=3)，計算測得樣品的加標回收率為102.1%～107.9%，通過相對標準偏差衡量試驗精密度，相對標準偏差值為1.33%～5.79%，具體見表3。

表3 焦糖色素中2-甲基咪唑加標回收率及相對標準偏差(n=3)Table 3 Recoveries and precisions of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in caramel pigment(n=3)

3 結(jié)論與討論

本研究采用氣相色譜-正化學源質(zhì)譜法檢測甲基咪唑類物質(zhì)，樣品經(jīng)堿化處理后，用硅藻土凈化，10～15 mL乙酸乙酯洗脫，在0.5～8.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，該方法2種物質(zhì)的方法檢出限均為20 mg/kg；在20、80、320 mg/kg 3個水平下，2-甲基咪唑的回收率為102.1%～107.9%，相對標準偏差(n=3)為1.33%～5.79%。

EI模式?jīng)]有選擇性，甲基咪唑類分子質(zhì)量低容易受到雜質(zhì)干擾，PCI模式對2-甲基咪唑及4-甲基咪唑都有較好的響應(yīng)，對很多雜質(zhì)沒有響應(yīng)，可消除多數(shù)無法離子化雜質(zhì)的干擾，不易出現(xiàn)假陽性。該方法簡單、快速、高效，可用于同時測定焦糖色素中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑。