李澤,黃和,鐘賽意,陳小麗,陳建平,任鵬康,劉海

(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東省亞熱帶果蔬加工現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，廣東 湛江，524088)

荔枝是我國盛產(chǎn)的名優(yōu)水果，屬于非呼吸躍變型果實，是最不耐貯藏的果品之一，荔枝在采摘后基本上每日一變：果皮色澤變褐、果實香味散失、果肉風(fēng)味變差、直到發(fā)生霉變。新鮮采摘后的荔枝果實極容易失水，雖然荔枝果肉中的水分含量很高，但是在沒有特定保濕冷凍貯藏環(huán)境下，果皮以及薄膜難以保持果肉中的水分，且果皮不斷失水衰老導(dǎo)致通透性增大，進而引起荔枝果實的褐變和霉變[1]。蘋果切開后發(fā)生褐變的原因主要是由多酚類物質(zhì)引起的，而荔枝果皮中的紅色素降解再加上多酚類物質(zhì)的氧化催化作用，使荔枝果皮非常容易發(fā)生褐變。這種特性導(dǎo)致運輸困難，嚴(yán)重制約我國荔枝產(chǎn)業(yè)健康和持續(xù)發(fā)展[2]。

呼吸作用是生物體重要生命活動標(biāo)志，荔枝果實在采摘后同樣進行著必不可少的呼吸作用，利用各種呼吸代謝相關(guān)酶將復(fù)雜有機物分解為自身能利用的簡單有機物，同時釋放出能量。荔枝在呼吸代謝過程中用以維持自身生命活動的能量，主要由細(xì)胞中的線粒體產(chǎn)生。與此同時，活性氧也會被釋放出來?；钚匝趵鄯e后容易破壞細(xì)胞膜的通透性，對荔枝的老化有著加速的作用[3]。

目前國內(nèi)外現(xiàn)有的荔枝保鮮技術(shù)主要包括：熏硫技術(shù)、冷藏、涂膜處理和氣調(diào)貯藏，其中熏硫技術(shù)影響果實風(fēng)味且有殘留問題，對人體有害；氣調(diào)貯藏因使用高純度的惰性氣體，成本較高；因荔枝果皮不光滑，涂膜處理難以完全覆蓋，效果不顯著；冷藏保鮮效果最好，但當(dāng)荔枝轉(zhuǎn)入常溫貨架會迅速褐變，24 h即失去商品價值。

減壓處理是一項新興的物理保鮮技術(shù)，能夠形成低壓、低O2的貯藏環(huán)境，防止有害氣體的侵入，消除田間熱并抑制微生物生長繁殖，防止果實生理病害的出現(xiàn)[4]。研究表明，減壓處理能夠降低新疆白杏果實的軟化速率[5]；有效提高水蜜桃的抗氧化體系[6]；可使草莓的呼吸強度減弱，減少丙二醛含量[7]。目前，國內(nèi)外關(guān)于減壓處理技術(shù)在荔枝果實上的研究未見報道，本實驗試圖通過研究不同減壓處理對采后荔枝果實在常溫貯藏期間細(xì)胞膜功能與膜脂代謝相關(guān)酶活性的影響，確定最佳貯藏壓力處理條件，初步探討荔枝果實能量代謝對膜完整性和功能的影響，以及果皮膜脂和能量代謝特性、膜結(jié)構(gòu)和功能的變化，以揭示膜脂和能量代謝在膜劣變和果皮褐變中的作用，進一步了解荔枝果實細(xì)胞膜功能完整性對荔枝保鮮的重要性。

1 材料與方法

1.1 材料

采用的荔枝品種為‘妃子笑’，采自湛江市東坡荔枝園，采摘后馬上運送至實驗室，挑選出8成熟、色澤相同、大小均勻、無損傷病蟲害的荔枝果實，將挑選好的荔枝果實放入抽濾瓶內(nèi)，每個抽濾瓶裝30顆果實，利用真空泵進行不同減壓處理，壓力分別設(shè)置為40、60和80 kPa，以常壓(101.325 kPa)下不經(jīng)任何處理的荔枝為對照，在常溫(25 ℃)貨架貯藏，進行取樣分析，取樣天數(shù)分別為0，2，4，6 d，取樣后復(fù)壓，每組重復(fù)3次。

1.2 實驗方法

1.2.1 果皮褐變指數(shù)的測定

果皮褐變程度評估參考林河通等[8]的方法。隨機選取30個荔枝果實計算褐變指數(shù)。褐變等級按0級：沒有褐變；1級：輕微褐變；2 級：褐變面積<25%；3級：褐變面積在25%～50%；4 級：褐變面積>50%來區(qū)分。褐變指數(shù)計算如公式(1)所示：

(1)

1.2.2 果皮霉變指數(shù)的測定

果皮霉變率計算根據(jù)JIANG等[9]的方法。隨機選取30個荔枝果實來計算霉變指數(shù)。霉變程度按0級：沒有霉變；1級：輕微霉變；2級：霉變面積<25%；3級：霉變面積在25%～50%；4級：霉變面積>50%進行區(qū)分。霉變指數(shù)計算如公式(2)所示：

(2)

1.2.3 果皮細(xì)胞膜相對滲透率的測定

參考JIANG等[10]的方法。從每組中隨機取出30個荔枝果皮，打成30個直徑為10 mm的果皮圓片，蒸餾水洗凈濾掉水分，在0.3 mol/L甘露醇中放置30 min后測第1次電導(dǎo)率；將其煮沸冷后開始測第2次電導(dǎo)率。相對滲透率用前后2次之比來表示。

1.2.4 果皮細(xì)胞線粒體的提取

參照譚才鄧[11]的方法。隨機從30個荔枝果實中選取10 g果皮進行液氮研磨，加入線粒體提取液[0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))半胱氨酸、1 mmol/L EDTA、0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))聚乙烯吡咯烷酮、0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白]的燒杯中，4 ℃靜置15 min后過濾，濾液在4 ℃下再次離心，待離心停止，收集沉淀，加入洗滌液[0.25 mol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA、0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白、0.3 mol/L甘露醇]溶解，再經(jīng)過2次離心所得沉淀即為線粒體，懸浮于線粒體提取液中備用。

1.2.5 細(xì)胞膜流動性的測定

反應(yīng)體系(2 nmol/L含熒光偏振探針1, 6二苯基-1, 3, 5己三烯的四氫呋喃溶液，0.3 mol/L甘露醇，0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液)，加入上述線粒體懸浮液，振蕩搖勻恒溫加熱20 min。以不加1,6二苯基-1,3,5己三烯(DPH)溶液作對照，在熒光分光光度計發(fā)射波長為432 nm，激發(fā)波長為362 nm下，測定熒光偏振值(P值)。P值越小，則流動性越大。

1.2.6 琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)活性的測定

參考ACKERLL等[12]和朱廣廉[13]的方法測定。反應(yīng)混合液2.7 mL(pH 7.4 琥珀酸鈉0.2 mol/L、pH 7.4 磷酸鉀緩沖液0.2 mol/L、0.9 mmol/L 2,6-二氯酚靛酚)，0.3 mL線粒體提取液；先量取適量反應(yīng)混合液置于37 ℃水浴鍋中，待水浴5 min后加入線粒體提取液，再加入0.3%甲硫酚嗪(5-methylphenazinium methosulfate，PMS)輕微振蕩搖勻，以2,6-二氯酚靛酚鈉在紫外分光光度計，600 nm處的還原速度表示SDH活性。實驗重復(fù)3次。

1.2.7 細(xì)胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，CCO)活性的測定

參照ERREDE等[14]的方法測定。反應(yīng)混合液2.7 mL[pH 7.4磷酸鉀緩沖液0.2 mmol/L、2%(體積分?jǐn)?shù)) TritonX-100、蒸餾水]，0.3 mL線粒體提取液。先量取適量反應(yīng)混合液置于37 ℃水浴鍋中，待水浴2 min后加入線粒體提取液和20 mg/mL細(xì)胞色素C，以細(xì)胞色素C在紫外分光光度計，550 nm處被氧化的速度來表示CCO活性。實驗重復(fù)3次。

1.2.8 ATP、ADP和AMP含量的測定

參照OZOGUL等[15]的方法提取荔枝果皮中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)。從30個荔枝中取10 g果皮組織進行液氮研磨，加入高氯酸提取，離心后的上清液用氫氧化鉀中和至pH 6.8，冰浴中靜置，過濾器過濾，在分析前存放于-20 ℃。按LIU等[16]的方法進行。采用Water e2695型高壓液相色譜儀。色譜條件如下：超球體ODS EC(250 mm×4.60 mm)色譜柱，在254 nm處檢測并分析峰，采用連續(xù)梯度洗脫，流動相流速為1.2 mL/min，洗脫12 min，進樣體積為20 μL，以確保完全分離并計算能荷(energy charge，EC)，如公式(3)所示：

(3)

1.2.9 果皮透射電鏡的觀察

參照黃旭明等[17]的方法。隨機選取30個荔枝果皮切成約4 mm×4 mm×1 mm的方塊，用戊二醛固定，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH 7.0)漂洗樣品；經(jīng)過純包埋劑包埋樣品；加熱固化后即得到包埋好的樣品。通過LEICA-705902型超薄切片機將樣品切成50 nm的切片，再經(jīng)30 g/L檸檬酸鉛-醋酸雙氧鈾溶液各染色5 min，即可在JEM-1011型透射電鏡下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel整理數(shù)據(jù)、Origin 2017作圖和SPSS 19.0進行差異顯著性分析。上述每個實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 減壓處理對荔枝果皮褐變指數(shù)的影響

采后荔枝果實不耐貯藏，極易發(fā)生褐變，在常溫貨架期間果皮褐變程度逐漸變深。果皮褐變加劇了荔枝果實的衰老程度，商品價值驟然下降[18]。由圖1可知，隨著貯藏時間延長，荔枝果實褐變指數(shù)呈上升趨勢；在0～2 d，荔枝果皮褐變指數(shù)變化趨勢不大；2 d后，荔枝果皮褐變指數(shù)變化趨勢增大，其中對照組、40和80 kPa處理果實的褐變指數(shù)增大速度較快，而60 kPa處理果實的褐變指數(shù)增長較緩慢，明顯低于其他處理，說明60 kPa減壓處理明顯延緩了果皮褐變的發(fā)生，效果最佳，與對照組相比，存在差異顯著(P<0.05)。

圖1 減壓處理對荔枝果皮褐變指數(shù)的影響Fig.1 Effect of reduced pressure treatment on browning index of litchi pericarp

2.2 減壓處理對荔枝果皮霉變指數(shù)的影響

采后荔枝果實會出現(xiàn)嚴(yán)重的霉變現(xiàn)象，一般是采后果實表面殘留的微生物引起的，加上在高溫高濕季節(jié)成熟，更有利病源微生物生長，造成對鮮果的侵染，蔓延后霉變加重[19]。如圖2所示，前2 d，荔枝果實并沒有發(fā)生霉變，2 d后，對照組、40和80 kPa減壓處理組果實霉變指數(shù)增加較快，而60 kPa處理組果皮的霉變指數(shù)始終處于較低水平，在貯藏第6天時，對照組果皮的霉變指數(shù)是60 kPa處理組果實的3.5倍，說明與對照組和其他減壓條件處理，60 kPa處理明顯抑制采后荔枝果皮霉菌的生長(P<0.05)。

圖2 減壓處理對荔枝果皮霉變指數(shù)的影響Fig.2 Effect of reduced pressure treatment on mildew index of litchi pericarp

2.3 減壓處理對荔枝果皮細(xì)胞膜相對滲透率的影響

細(xì)胞膜滲透性是分析細(xì)胞膜完整性的關(guān)鍵指標(biāo)，它的大小能夠反映果實衰老和損傷程度，一般用相對電導(dǎo)率表示[20]。如圖3所示，在整個貯藏期間，對照組果皮中的電導(dǎo)率遠(yuǎn)高于減壓處理組；貯藏第4天，對照組、40和80 kPa處理組的電導(dǎo)率均出現(xiàn)峰值；在常溫貨架期間，60 kPa處理組果皮中的細(xì)胞膜滲透率基本趨于平穩(wěn)，與對照組相比，兩者之間具有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 減壓處理對荔枝果皮細(xì)胞膜相對滲透率的影響Fig.3 Effect of reduced pressure treatment on relative permeability of litchi pericarp cell membrane

2.4 減壓處理對荔枝果皮細(xì)胞膜流動性的影響

當(dāng)細(xì)胞膜流動性下降，膜脂通透性增強，膜脂中飽和脂肪酸含量增加時，意味著膜脂系統(tǒng)劣變[21]。如圖4所示，在貯藏期間，對照組果皮中細(xì)胞膜流動性P值高于減壓處理組，4組果皮中細(xì)胞膜流動性P值隨著常溫貨架期的延長而不斷增長；前2 d，全部呈緩慢上升趨勢；在2～6 d，開始呈直線迅速上升；到第6天，均出現(xiàn)峰值，且對照組荔枝果皮中細(xì)胞膜流動性P值(P<0.05)顯著高于60 kPa處理組，說明減壓處理能有效維持荔枝果皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，其中60 kPa處理組效果較好。

圖4 減壓處理對荔枝果皮細(xì)胞膜流動性的影響Fig.4 Effect of reduced pressure treatment on cell membrane fluidity of litchi pericarp

2.5 減壓處理對荔枝果皮中SDH活性的影響

SDH是果皮細(xì)胞線粒體內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵酶。如圖5所示，在0～2 d時，對照組的SDH活性呈下降趨勢，而減壓處理組的SDH活性逐漸上升，酶活性較對照組要高，對照組的荔枝果實呼吸作用受到抑制。在2～6 d時，對照組的SDH活性有所增加，而60 kPa處理組的SDH活性趨于平穩(wěn)，使線粒體的功能維持在一個較為穩(wěn)定的狀態(tài)，與對照組相比，差異顯著(P<0.05)。

圖5 減壓處理對荔枝果皮中SDH活性的影響Fig.5 Effect of reduced pressure treatment on SDH activity in litchi pericarp

2.6 減壓處理對荔枝果皮中CCO活性的影響

CCO活性的高低影響組織細(xì)胞的好氧速率，能反映出荔枝果實的有氧呼吸狀態(tài)。由圖6可知，在貯藏期間，減壓處理組的CCO活性遠(yuǎn)高于對照組，在荔枝新鮮采摘后的前期0～2 d，細(xì)胞的CCO活性均呈上升趨勢，此時荔枝果實的有氧呼吸代謝旺盛。第2天后開始下降，對照組的CCO酶活性迅速下降，在第4 天下降到最低后又開始上升，減壓處理組CCO活性趨于平穩(wěn)。在貯藏過程中，60 kPa處理組線粒體膜CCO活性顯著(P<0.05)高于對照組。說明60 kPa處理下的荔枝果實能保持較為穩(wěn)定的有氧呼吸水平，并對荔枝果實細(xì)胞膜脂代謝起到一定的抑制作用。

圖6 減壓處理對荔枝果皮中CCO活性的影響Fig.6 Effect of reduced pressure treatment on CCO activity in litchi pericarp

2.7 減壓處理對荔枝果皮ATP、ADP、AMP和EC的影響

如圖7-a所示，在貯藏期間，ATP 含量均有不同程度下降，在貯藏后期(4～6 d)下降較快，60 kPa處理荔枝果皮ATP 含量顯著(P<0.05)高于對照處理，為對照的1.38倍。

如圖7-b所示，在采收當(dāng)天，減壓處理荔枝果皮ADP含量略高于對照處理。在貯藏期間，ADP含量整體呈先上升后下降的趨勢，在前2 d開始上升，之后快速下降，到第6天，減壓處理組荔枝果皮ADP含量遠(yuǎn)高于對照組，分別是對照組的1.76、1.99和1.79倍，其中60 kPa處理荔枝果皮ATP含量顯著(P<0.05)高于對照組。

如圖7-c所示，在采收當(dāng)天，減壓處理荔枝果皮AMP含量低于對照處理。在貯藏期間，AMP含量均呈連續(xù)上升趨勢，并在2～4 d有一個快速上升過程，并在第6天全部達到峰值。在整個貯藏期間，60 kPa處理組AMP含量顯著(P<0.05)低于對照組。

如圖7-d所示，采后荔枝果皮EC值處于逐漸下降趨勢，在貯藏后期60 kPa處理組能荷顯著(P<0.05)高于對照組。減壓處理延緩了荔枝果皮能荷的下降。

上述結(jié)果表明，減壓處理有效延緩妃子笑荔枝果皮ATP、ADP含量的下降和AMP含量的升高，抑制果皮能荷的下降，有利于荔枝果皮處于較高的能量水平。

a-ATP；b-ADP；c-AMP；d-EC圖7 減壓處理對荔枝果皮的影響Fig.7 Effects of reduced pressure treatment on litchi pericarp

2.8 減壓處理對荔枝果皮超微結(jié)構(gòu)的影響

由圖8中1～2可知，新鮮荔枝果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜與細(xì)胞壁緊貼，所有細(xì)胞器都集中在質(zhì)膜上，可以看到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、細(xì)胞核、核糖體、線粒體等，還有其他一些細(xì)胞器，表明果皮細(xì)胞具有鮮活生命力。

由圖8中3～6可知，貯藏2 d后荔枝常溫貨架期果皮超微結(jié)構(gòu)變化。2組荔枝果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)隨著常溫貨架期的延長而變得模糊，基本看不到完整的細(xì)胞器。在常溫貨架期，60 kPa處理組的細(xì)胞膜破損程度較對照組小。2組的細(xì)胞在常溫貨架后期皆出現(xiàn)質(zhì)壁分離的現(xiàn)象，與對照組相比較而言，60 kPa處理組的荔枝果皮細(xì)胞質(zhì)壁分離較輕微。

由圖8中7～10可知，貯藏4 d后荔枝常溫貨架期果皮超微結(jié)構(gòu)變化。2組荔枝果皮細(xì)胞膜脂系統(tǒng)隨著常溫貨架期的延長而變得模糊破裂，對照組在常溫貨架后期基本找不到細(xì)胞膜，胞內(nèi)發(fā)生質(zhì)壁分離，細(xì)胞器遭到降解，細(xì)胞壁變形，此時果皮細(xì)胞失去生命力；而60 kPa處理組保持一定的膜脂，細(xì)胞膜沒有完全脫離細(xì)胞壁，還能看見一些細(xì)胞器。

由圖8中11～14可知，貯藏6 d后荔枝常溫貨架期果皮超微結(jié)構(gòu)變化。在貯藏6 d后，2組荔枝果皮細(xì)胞破損程度越來越大。隨著常溫貨架期延長，對照組不但細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性消失，出現(xiàn)胞吞現(xiàn)象，細(xì)胞壁也出現(xiàn)破裂，表明褐變后的細(xì)胞生命力喪失嚴(yán)重；而60 kPa處理組的荔枝果皮細(xì)胞微結(jié)構(gòu)情況較好，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)沒有完全破壞。

圖8 荔枝貯藏過程中果皮超微結(jié)構(gòu)變化Fig.8 Ultrastructural changes of litchi pericarp during storage注：荔枝果皮透射電鏡觀察倍數(shù)：1-(×3 700)；2-(×2 550)；3-(×3 700)；4-(×8 900)；5-(×1 650)；6-(×6 200)；7-(×8 900)；8-(×2 550)；9-(×2 550)；10-(×12 500)；11-(×3 700)；12-(×3 700)；13-(×2 550)；14-(×1 650)

3 結(jié)論

荔枝極易發(fā)生褐變霉變并引發(fā)腐爛，貯藏性差。本試驗中，以不同減壓處理和常壓作對照，研究了荔枝在貯藏2、4、6 d后，2組處理的荔枝果實細(xì)胞膜功能與膜脂代謝相關(guān)酶活性變化。研究表明，荔枝果皮結(jié)構(gòu)特殊，采后褐變與細(xì)胞膜的完整性密切相關(guān)，細(xì)胞滲透性增大，會導(dǎo)致膜內(nèi)酶和底物區(qū)域化破壞。在本研究中60 kPa處理通過延緩細(xì)胞膜滲透性的增加以及維持了果皮細(xì)胞膜的流動性，保持了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和功能，從而顯著降低了荔枝果實的果皮褐變和霉變率。

線粒體中能夠進行細(xì)胞組織能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化，線粒體呼吸作用標(biāo)志酶SDH和CCO活性的高低能直接反映出線粒體生命系統(tǒng)的功能狀態(tài)。本研究中，在荔枝果實的成熟期，對照組和60 kPa處理組的SDH和CCO活性都比較高；而在荔枝果實的衰老期，2組活性都有所下降。表明隨著貯藏時間的延長，荔枝果實細(xì)胞膜通透性增大，導(dǎo)致細(xì)胞膜的功能遭到破壞，可能使膜脂代謝相關(guān)酶的活性也受到抑制，使細(xì)胞加速衰老。

采收后的荔枝果實，失去了外源能量供給，需要通過分解自身營養(yǎng)物質(zhì)來維持自身正常代謝的能量。隨著采后果蔬的衰老、病原菌侵染的發(fā)生，果蔬氧化磷酸化作用明顯降低，會引起ATP生成的減少及EC水平的下降，ATP短缺和EC水平低意味著維持細(xì)胞生命活動所需要的能量不足，而能量虧缺會導(dǎo)致整個代謝系統(tǒng)瓦解，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而加速采后荔枝果實品質(zhì)敗壞。本試驗中，減壓處理能夠使采后妃子笑荔枝果實果皮ATP、ADP含量保持在較高水平，延緩AMP含量的上升，維持較高的EC水平，保證采后果皮細(xì)胞膜修復(fù)所需要的能量供應(yīng)，延緩果皮細(xì)胞膜完整性的破壞，從而增強果實的抗病能力，其中60 kPa處理效果最好。