上官修蕾，顧秋亞，余曉斌

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

豆粕是大豆榨油后的副產(chǎn)品，其中含有大量大豆異黃酮。大量研究表明，大豆異黃酮與人類健康密切相關(guān)，具有一定的抗氧化[1]、抗癌[2-3]、抗腫瘤[4]、降血脂[5]、緩解更年期綜合征[6]等生理活性。天然存在的大豆異黃酮共有12種，分為結(jié)合型糖苷和游離型苷元。以糖苷形式存在的大豆異黃酮，不能被人體直接吸收，必須水解成苷元才能被吸收并發(fā)揮其藥理活性[7]。目前報(bào)道的糖苷水解方法主要有酸水解法、堿水解法和酶解法。酸水解的效率很高，但強(qiáng)酸條件不易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，且存在一定的不安全因素；堿水解條件下苷元性質(zhì)不穩(wěn)定；而酶水解反應(yīng)條件溫和，因而生物法轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷具有獨(dú)特的優(yōu)勢[8]。

“金花”菌是中國傳統(tǒng)發(fā)酵黑茶-茯磚茶“發(fā)花”過程中的優(yōu)勢菌[9-10]，具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化、促進(jìn)腸道健康等多方面促健康作用[11-12]。本研究選用傳統(tǒng)發(fā)酵茶中有益菌“金花”菌發(fā)酵豆粕，探討“金花”菌對豆粕發(fā)酵的影響，對比發(fā)酵前后苷元含量以及抗氧化活性的變化，以期對豆粕資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

由本實(shí)驗(yàn)室從湖南安化不同茶廠較具代表性的茯茶樣品中分離純化“金花”菌若干株，并分別進(jìn)行編號、保藏。

1.2 材料與設(shè)備

豆粕，寧波中瑞生物科技有限公司；大豆苷、染料木苷、大豆素、染料木素標(biāo)準(zhǔn)品，大連美侖生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

Agilent1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司；Synergy H4酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；7GI-16M高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.3 培養(yǎng)基

梔子苷篩選培養(yǎng)基(g/L)：梔子苷1.0，谷氨酸鈉10.0，蛋白胨5.0，磷酸二氫鉀10.0，硫酸鎂0.5，瓊脂粉25.0。

土豆茶汁培養(yǎng)基：土豆洗凈，稱取80 g切丁，沸水煮20 min，4層紗布過濾得土豆汁300 mL；稱取茶葉(正山小種)40 g，沸水煮20 min，4層紗布過濾得茶汁100 mL；混勻后加蔗糖16 g，瓊脂粉10 g。

“金花”菌液體種子培養(yǎng)基(g/L)：大米粉60.0，黃豆粉40.0，蔗糖20.0，海水晶25.0，磷酸氫二鉀2.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：豆粕100.0，蔗糖20.0，海水晶25.0，磷酸氫二鉀2.0。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶“金花”菌的篩選及鑒定

菌株初篩：將實(shí)驗(yàn)室分離純化的不同“金花”菌分別點(diǎn)種于梔子苷平板上進(jìn)行初步的篩選，根據(jù)菌落的生長情況及藍(lán)色圈的大小確定進(jìn)一步篩選的菌株。

菌株復(fù)篩：將菌種在土豆茶汁平板上進(jìn)行活化后接種至種子培養(yǎng)基(250 mL三角瓶，裝液量50 mL)，于30 ℃，160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)5 d得液體種子液。按10%接種量將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL三角瓶，裝液量50 mL),于30 ℃，160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d。測定豆粕發(fā)酵前后苷元含量，篩選出苷元質(zhì)量濃度增量最大的菌株作為最優(yōu)發(fā)酵菌株。

菌種鑒定：根據(jù)NCBI中冠突散囊菌的ITS rDNA、β-tubulin 和RNA polymerase基因序列設(shè)計(jì)引物，對待測菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，最后通過BLAST及多基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建確定其種屬[13]。

1.4.2 HPLC法測定大豆異黃酮糖苷及苷元含量

采用HPLC[14-15]測定發(fā)酵豆粕提取液中糖苷以及苷元含量，色譜條件：流動相為V(甲醇)∶V(0.2%磷酸)=50∶50，流速0.8 mL/min，柱溫37 ℃，檢測波長260 nm，進(jìn)樣量10 μL。

樣品處理：發(fā)酵完成后，菌株發(fā)酵液中加入100 mL甲醇超聲提取30 min，布氏漏斗抽濾除去固形物得提取液，提取液旋蒸后加10 mL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)膜后HPLC進(jìn)行檢測?？瞻讓φ諡榘l(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后不接菌，其他處理與發(fā)酵組保持一致。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素各20 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，得標(biāo)準(zhǔn)儲備液2 mg/mL，然后分別從各標(biāo)準(zhǔn)儲備液中吸取1 mL，用甲醇稀釋至 10、20、25、50、100、200 μg/mL待測，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，大豆異黃酮濃度(x)為橫坐標(biāo)，對各組分濃度與峰面積關(guān)系進(jìn)行回歸分析，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)。

表1 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curve of soybean isoflavone

1.4.3 發(fā)酵條件對豆粕異黃酮苷元轉(zhuǎn)化的影響

1.4.3.1 底物添加量對發(fā)酵結(jié)果的影響

選取最佳菌株，控制水、蔗糖、菌液(種子液)接種量不變，分別按豆粕添加量為5%、8%、10%、12%、15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃，160 r/min 恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d，按1.4.2所述方法提取并檢測，以大豆異黃酮苷元質(zhì)量濃度為指標(biāo)，確定最佳底物濃度。

1.4.3.2 菌液接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響

選取最佳菌株，控制水、蔗糖、底物添加量不變，分別按接種量為4%、6%、8%、10%、12%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃，160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d，按1.4.2所述方法提取并檢測，以大豆異黃酮苷元質(zhì)量濃度為指標(biāo)，確定最佳接種量。

1.4.3.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響

選取最佳菌株，控制水、蔗糖、底物添加量、接種量不變，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于18、25、30、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，按1.4.2所述方法提取并檢測，以大豆異黃酮苷元質(zhì)量濃度為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.4.3.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵結(jié)果的影響

選取最佳菌株，控制水、蔗糖、底物添加量、接種量不變，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃，160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)36、48、60、72、84 h，按1.4.2所述方法提取并檢測，以大豆異黃酮苷元質(zhì)量濃度為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵時間。

1.4.4 抗氧化活性的檢測分析

通過測定總還原力、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活力、DPPH自由基[16]以及總氧自由基清除能力，綜合評價(jià)發(fā)酵豆粕的抗氧化活性。

采用AGRAWAL等[17]的方法測定發(fā)酵液的總還原力；按照T-SOD試劑盒說明測定發(fā)酵液的T-SOD活力；按照DPPH自由基清除能力試劑盒說明制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定發(fā)酵液的DPPH自由基清除率，用從標(biāo)準(zhǔn)曲線上算得的相當(dāng)于抗氧化劑Trolox的量來表示發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力；參照FENG等[18]和ZHANG等[19]的方法測定發(fā)酵液的總氧自由基清除能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶“金花”菌的篩選

在β-葡萄糖苷酶催化條件下，1分子的梔子苷會被水解生成1分子的葡萄糖和1分子的梔子苷元，梔子苷元與氨基酸反應(yīng)生成梔子藍(lán)色素，可依據(jù)菌落背面或周圍顯現(xiàn)的藍(lán)色來篩選β-葡萄糖苷酶的菌株。

將從茯磚茶樣品中分離的“金花”菌分別點(diǎn)種于梔子苷平板，在以0.1%梔子苷為碳源的培養(yǎng)基上，“金花”菌都能生長，其中菌株JH-4、JH-6有藍(lán)色圈(圖1)，說明其具有較好的β-葡萄糖苷酶活性。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolated strains

挑取菌落生長及產(chǎn)酶能力較好的“金花”菌進(jìn)一步試驗(yàn)，考察不同菌株對豆粕中大豆異黃酮轉(zhuǎn)化能力的差異。從圖2中可以看出接種金花菌發(fā)酵后，豆粕中苷元含量均有較大幅度的提升，其中菌株JH-4轉(zhuǎn)化效果最好，大豆素和染料木素增量最高。因此選取菌株JH-4進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同菌株發(fā)酵豆粕3 d后苷元質(zhì)量濃度Fig.2 Aglycone concentration of soybean meal fermented by different strains for 3 days

2.2 菌種鑒定

測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，下載與待鑒定菌株序列同源性達(dá)99%以上的已知分類地位的模式菌株，運(yùn)用MEGA7的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20],如圖3所示，綜合形態(tài)學(xué)和分子鑒定結(jié)果，鑒定該菌為謝瓦曲霉[21]，命名為AspergilluschevalieriJH-4。

圖3 “金花”菌JH-4系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of “Jinhua” fungi JH-4

2.3 發(fā)酵條件對豆粕異黃酮轉(zhuǎn)化的影響

2.3.1 最佳底物添加量的確定

將活化好的謝瓦曲霉種子液按接種量10%接種至豆粕添加量為5%、8%、10%、12%、15%的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d后苷元質(zhì)量濃度如圖4所示。數(shù)據(jù)表明，前期底物添加量較少時，隨著底物添加量的增多，可供菌株利用的營養(yǎng)物質(zhì)也在增多，有利于菌體生長，對大豆異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化效果增強(qiáng)，因此對應(yīng)苷元質(zhì)量濃度呈現(xiàn)遞增趨勢；當(dāng)達(dá)到最佳底物添加量后，再次添加底物，導(dǎo)致基質(zhì)含量降低，菌體可利用的活性水含量降低，不利于菌體的生長，進(jìn)而影響大豆異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化效果從而導(dǎo)致苷元質(zhì)量濃度降低，因此選取12%作為最佳底物添加量。

圖4 不同底物添加量對苷元質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effect of different substrate additions on the mass concentration of aglycones

2.3.2 最佳接種量的確定

將活化好的謝瓦曲霉種子液分別按4%、6%、8%、10%、12%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 d后,苷元質(zhì)量濃度如圖5所示。數(shù)據(jù)表明，前期菌體接種量較少時，菌體接入發(fā)酵培養(yǎng)基后，由于延滯期過長，不利于菌株產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，從而影響大豆異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化效果，導(dǎo)致苷元質(zhì)量濃度偏低。增加菌體接種量，有利于縮短延滯期，使菌體迅速生長，有利于大豆異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化，縮短發(fā)酵周期。在最優(yōu)接種量的基礎(chǔ)上增加菌體接種量，會導(dǎo)致可供菌株利用的營養(yǎng)物質(zhì)減少，不利于菌體生長，因此對大豆異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化效果呈現(xiàn)下降趨勢，對應(yīng)苷元質(zhì)量濃度也相應(yīng)降低，因此選取8%作為最佳菌體接種量。

圖5 不同接種量對苷元質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of different inoculations on the mass concentration of aglycones

2.3.3 最佳發(fā)酵溫度的確定

將活化好的謝瓦曲霉種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于18、25、30、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后,苷元質(zhì)量濃度如圖6所示，發(fā)酵溫度為30 ℃時，苷元質(zhì)量濃度最高，說明此溫度下適宜菌株生長，有利于異黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化。因此選取30 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖6 不同發(fā)酵溫度對苷元質(zhì)量濃度的影響Fig.6 Effect of different fermentation temperatures on the mass concentration of aglycones

2.3.4 最佳發(fā)酵時間的確定

將活化好的謝瓦曲霉種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，分別測定發(fā)酵36、48、60、72、84 h后苷元質(zhì)量濃度,如圖7所示，隨著發(fā)酵時間的推移，苷元含量不斷增加，當(dāng)發(fā)酵72 h后苷元質(zhì)量濃度達(dá)到最高，隨后出現(xiàn)降低趨勢。說明在發(fā)酵72 h后培養(yǎng)基中可供菌體利用的營養(yǎng)物質(zhì)不足，導(dǎo)致菌體利用苷元，使苷元質(zhì)量濃度下降，因此選取72 h作為最佳發(fā)酵時間。

圖7 不同發(fā)酵時間對苷元質(zhì)量濃度的影響Fig.7 Effect of different fermentation times on the mass concentration of aglycones

2.4 豆粕發(fā)酵前后苷元含量及體外抗氧化能力變化

參照單因素試驗(yàn)結(jié)果，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中豆粕添加量改為12%，將活化好的謝瓦曲霉種子液按8%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)72 h，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行豆粕發(fā)酵，并對發(fā)酵前后糖苷及苷元含量進(jìn)行檢測，同時對發(fā)酵前后豆粕的抗氧化活性進(jìn)行分析。

2.4.1 豆粕發(fā)酵前后液相色譜圖

由圖8可得知，未接菌發(fā)酵的豆粕苷元含量非常低，而發(fā)酵過后豆粕中糖苷含量顯著降低，苷元含量明顯升高，其中大豆素與染料木素含量均得到大幅度提升，說明菌株JH-4轉(zhuǎn)化效果較好。按1.4.2所述方法提取并檢測發(fā)酵前后豆粕中大豆異黃酮含量，發(fā)酵后大豆素增至292.94 μg/mL，染料木素增至309.82 μg/mL，分別比發(fā)酵前提高8.19和10.13倍；大豆苷從359.35 μg/mL降至30.91 μg/mL，轉(zhuǎn)化率為91.40%；染料木苷從373.64 μg/mL降至1.57 μg/mL，轉(zhuǎn)化率為99.58%。

圖8 豆粕發(fā)酵前后大豆異黃酮高效液相色譜圖Fig.8 HPLC of soybean isoflavones before and after fermentation of soybean meal

2.4.2 豆粕發(fā)酵前后抗氧化能力變化

以發(fā)酵上清液為樣品，未接菌培養(yǎng)基上清液為對照，測定豆粕發(fā)酵前后總還原力、T-SOD、DPPH自由基以及總氧自由基清除能力，結(jié)果如表2所示。數(shù)據(jù)表明，發(fā)酵后抗氧化能力得到大幅度提升，其中T-SOD 活力以及總氧自由基清除能力變化最明顯，綜合判斷，發(fā)酵后豆粕抗氧化能力明顯提高。

表2 豆粕發(fā)酵前后抗氧化能力變化Table 2 Changes of antioxidant capacity of soybean meal before and after fermentation

3 結(jié)論

茯茶“金花”菌在發(fā)酵過程中能產(chǎn)多種酶參與底物的轉(zhuǎn)化。研究者對實(shí)驗(yàn)室保存的不同“金花”菌β-葡萄糖苷酶活力進(jìn)行篩選并將其應(yīng)用于豆粕的液體發(fā)酵，最終確定1株優(yōu)勢菌AspergilluschevalieriJH-4。該菌在豆粕添加量12%，接種量8%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵72 h后大豆苷從359.35 μg/mL降至30.91 μg/mL，轉(zhuǎn)化率為91.40%；染料木苷從373.64 μg/mL降至1.57 μg/mL，轉(zhuǎn)化率為99.58%。大豆素增至292.94 μg/mL，染料木素增至309.82 μg/mL，分別比發(fā)酵前提高8.19和10.13倍。實(shí)驗(yàn)證明，“金花”菌AspergilluschevalieriJH-4能夠有效轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷，有利于發(fā)揮豆粕中大豆異黃酮的生物活性，從而提高豆粕的利用價(jià)值。