易子玲，吳敬，陳晟*，王蕾*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

低聚異麥芽糖(isomalto-oligosacchrides, IMOs)是一類聚合度通常為2～10，含有1個或多個α-1,6糖苷鍵的寡聚葡萄糖。其主要功能成分是異麥芽糖、異麥芽三糖(isomaltotriose, IG3)和潘糖等[1-2]。IMOs甜度低、熱量低，具有低血糖指數(shù)特征；IMOs可被腸道益生菌如雙歧桿菌分解利用，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，提高人體免疫力，有研究表明，IMOs產(chǎn)品中IG3的成分相比于異麥芽糖更有利于人體內(nèi)雙歧桿菌生長，這說明了IG3為主要益生因子之一[3-5]；IMOs不被齲齒鏈球菌利用，可以有效預(yù)防齲齒。因此IMOs被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)。

目前，工業(yè)上主要使用以下2種方法制備IMOs。第1種方法以淀粉為原料經(jīng)過淀粉酶、葡萄糖苷酶處理制備IMOs[6]：例如LEE等[7]將麥芽糖淀粉酶和α-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)配催化玉米糖漿，可產(chǎn)出67.4%的IMOs，其中，IG3及聚合度更高的IMOs占比為39.7%。第2種方法以蔗糖為原料經(jīng)過右旋糖酐蔗糖酶(dextransucrase, DS)單獨(dú)制備IMOs或與右旋糖酐酶一同制備IMOs[8-12]：例如GOULAS等[12]使用DS和右旋糖酐酶以蔗糖為原料制備IMOs，產(chǎn)出聚合度為10～60的異麥芽寡糖(占比至多36%)。

KRALJ等[13]報道了1種4,6-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(4,6-α-glucanotransferase，4,6-α-GT)可將直鏈淀粉通過轉(zhuǎn)苷反應(yīng)轉(zhuǎn)化成右旋糖酐，產(chǎn)物中α-1,6糖苷鍵比率高達(dá)90%[13-16]。但基于底物的結(jié)構(gòu)，僅4,6-α-GTs不可能將非直鏈淀粉類的α-1,4糖苷鍵高效地轉(zhuǎn)化為α-1,6糖苷鍵連接的多聚糖[17]。據(jù)此我們提出了4,6-α-GTs和右旋糖酐酶制備IMOs的新策略，以麥芽糊精為底物，使用本實驗室篩選的來源于Lactobacillusfermentum的4,6-α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(4,6-α-glycosyltransferases, LfGT)合成右旋糖酐[18]，使用酵母將右旋糖酐中的葡萄糖消化后冷凍干燥制成粉末，再使用具有IG3產(chǎn)物特異性的來源于Brevibacteriumfuscum的異麥芽三糖右旋糖酐酶(isomaltotrio-dextranase, BfIMTD)降解右旋糖酐以制備IMOs的兩步法工藝。本研究在第1步合成反應(yīng)中添加商品化普魯蘭酶和重組表達(dá)的異普魯蘭酶(isopullulanase, IPU)與LfGT復(fù)配對合成反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，以提高中間產(chǎn)物右旋糖酐的產(chǎn)量和有效鍵型(α-1,6糖苷鍵)比率，并對降解反應(yīng)中BfIMTD降解右旋糖酐的工藝進(jìn)行優(yōu)化，以實現(xiàn)富含IG3的IMOs高效制備。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

EscherichiacoliJM109、E.coliBL21(DE3)和PichiapastorisKM71為本實驗室保藏；目的基因合成于上海捷瑞生物工程有限公司。

1.1.2 酶與主要試劑

LfGT來源于本實驗室；商品化高溫淀粉酶、糖化酶及普魯蘭酶購于山東隆科特有限公司。

異麥芽糖、潘糖、G3等標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich有限公司；商品化右旋糖酐20000，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；麥芽糊精(DE2，DE4～6和DE5～7)，羅蓋特精細(xì)化工有限公司；酵母，安琪生物集團(tuán)有限公司。所用培養(yǎng)基為大腸桿菌和酵母宿主常用培養(yǎng)基。主要儀器包括常用搖瓶發(fā)酵、酶反應(yīng)及產(chǎn)物檢測所需儀器等。

1.2 重組菌的構(gòu)建及發(fā)酵

根據(jù)研究需求，從NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇B.fuscum來源的BfIMTD，及Aspergillusniger來源的IPU的氨基酸序列，由上海捷瑞生物工程有限公司對目的氨基酸序列進(jìn)行表達(dá)宿主密碼子優(yōu)化以及基因合成，選擇E.coliBL21(DE3)和pET-24a(+)作為BfIMTD的表達(dá)宿主和載體，選擇P.pastorisKM71和pPIC9K作為IPU的表達(dá)宿主和載體，使用大腸桿菌宿主和畢赤酵母宿主常用發(fā)酵方法分別對BfIMTD和IPU進(jìn)行重組表達(dá)，使用SDS-PAGE方法對重組酶進(jìn)行分析[19-20]。

1.3 重組酶的酶活測定

使用DNS法對BfIMTD和IPU進(jìn)行酶活力測定[21]。

在本研究中，在pH 7.5和45 ℃的條件下使用10 g/L商品化右旋糖酐20000作為底物反應(yīng)10 min測定BfIMTD酶活力。酶活力定義：上述條件下，將1 min 水解右旋糖酐生成1 μmol的葡萄糖所需酶量定義為右旋糖酐酶的1個單位的酶活力。

在pH 3.5和30 ℃的條件下使用50 g/L普魯蘭多糖反應(yīng)30 min測定IPU酶活力。酶活力定義：上述條件下，將1 min水解普魯蘭多糖生成1 μmol的葡萄糖所需酶量定義為IPU的1個單位的酶活力。

1.4 低聚異麥芽糖的制備及檢測方法

1.4.1 合成右旋糖酐及中間處理的方法

將麥芽糊精溶于50 mmol/L磷酸/檸檬酸緩沖液中配制成250 g/L麥芽糊精溶液，隨后加入適量LfGT及緩沖液至底物麥芽糊精終質(zhì)量濃度為200 g/L，同批次可能同時或分別加入適量普魯蘭酶、IPU，通過加酶組合優(yōu)化此合成步驟，在37 ℃，200 r/min條件下反應(yīng)24 h。

隨后加入高溫淀粉酶(95 ℃, 反應(yīng)30 min)和糖化酶(60 ℃，反應(yīng)30 min)對合成反應(yīng)液中未反應(yīng)的底物及產(chǎn)物中的末端α-1,4糖苷鍵短鏈部分進(jìn)行處理，隨后煮沸滅酶。向反應(yīng)液中加入50 g/L反應(yīng)液的干酵母，在30 ℃條件下反應(yīng)12 h消化葡萄糖。

將處理好的反應(yīng)液置于-80 ℃下冷藏過夜，隨后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥, 獲得樣品右旋糖酐粉末。

1.4.2 水解右旋糖酐制備IMOs的方法

將1.4.1所述樣品粉末溶于50 mmol/L磷酸/檸檬酸緩沖液中，加入適量右旋糖酐酶，于37 ℃條件下反應(yīng)不同時長，煮沸滅酶離心后即可獲得IMOs反應(yīng)液。

1.4.3 產(chǎn)物的HPLC檢測方法

使用安捷倫1260 HPLC色譜儀對右旋糖酐(DP≥3)進(jìn)行檢測。檢測條件為：色譜柱Agilent Hi-Plex Ca (7.7 mm×300 mm, 8 μm)，柱溫80 ℃，流動相為純水，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。將HPLC測得三糖及以上聚合度部分視為右旋糖酐，其產(chǎn)量按照測得產(chǎn)品峰面積占所有產(chǎn)品的比例計算。

使用安捷倫1260 HPLC色譜儀對寡糖分子(IG3、異麥芽糖和葡萄糖等)進(jìn)行檢測。待測樣品經(jīng)純乙腈等體積過夜沉淀后，取上清液檢測，檢測條件為：色譜柱Agilent ZORBAX NH2(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，柱溫35 ℃，流動相為體積分?jǐn)?shù)70%～75%的乙腈，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。標(biāo)準(zhǔn)品(葡萄糖-麥芽七糖混合標(biāo)樣G1～G7、異麥芽糖、IG3等)同樣品一同檢測，IMOs的產(chǎn)量按照外標(biāo)法計算得相應(yīng)濃度，并結(jié)合第1步反應(yīng)占比，計算得IG3兩步法產(chǎn)率。

1.4.4 產(chǎn)物鍵型的核磁共振氫譜(1H-nuclear magnetic resonance spectra，1H-NMR)檢測方法

利用AVANCE III 400 MHz數(shù)字NMR核磁共振光譜儀(Bruker Biospin International AG)測定右旋糖酐的鍵型比例。稱取30～40 mg樣品溶于500 μL D2O (D, 99.9%)中，漩渦振蕩至徹底溶解后打入核磁管中進(jìn)行測定，溫度為60 ℃。將三甲基甲硅烷基丙酸(0.3 g/L)溶解在樣品中作為內(nèi)標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成步驟右旋糖酐的制備

本研究中使用到的底物麥芽糊精屬于淀粉不同程度的水解產(chǎn)物，其主鏈為α-1,4糖苷鍵連接，在鏈上的不同部位會有不同聚合度的支鏈，分支處以α-1,6糖苷鍵為主的糖苷鍵連接。圖1中呈現(xiàn)了麥芽糊精具有代表性的結(jié)構(gòu)。合成步驟中使用的酶種類包括LfGT、普魯蘭酶及IPU。3種酶的主要作用分別為：(1)產(chǎn)生右旋糖酐:4,6-α-GTs作為合成右旋糖酐的主要酶，它能夠利用淀粉的直鏈部分生成含有α-1,6糖苷鍵連接的右旋糖酐部分，但與淀粉含有支鏈的部位不易發(fā)生反應(yīng);(2)提高右旋糖酐產(chǎn)量:普魯蘭酶是一類可以水解淀粉分支的脫支酶，可將最小單位的支鏈從主鏈上水解下來，使4,6-α-GTs可以最大程度地利用淀粉質(zhì)底物;(3)提高產(chǎn)物中α-1,6糖苷鍵比例:IPU可以水解普魯蘭多糖中1個或連續(xù)α-1,6糖苷鍵后的α-1,4糖苷鍵，此處IPU水解麥芽糊精或LfGT產(chǎn)出右旋糖酐由α-1,6糖苷鍵連接支鏈后的α-1,4糖苷鍵，隨后LfGT利用得到的直鏈淀粉，最終獲得α-1,6糖苷鍵占比更高的產(chǎn)物。

綜上所述，本研究分別建立并優(yōu)化了單酶(LfGT)，雙酶復(fù)配(LfGT和普魯蘭酶)以及三酶復(fù)配(LfGT、普魯蘭酶和IPU)3種生產(chǎn)右旋糖酐的反應(yīng)體系，以獲得具有更高α-1,6糖苷鍵右旋糖酐反應(yīng)體系(圖1)。

1-可與LfGT反應(yīng)的底物直鏈區(qū)域；2-不可與LfGT反應(yīng)的底物含支鏈的區(qū)域；3-可被普魯蘭酶水解的底物支鏈區(qū)域(α-1,6糖苷鍵)；4-不可被異普魯蘭酶水解的底物直鏈區(qū)域；5-可被異普魯蘭酶水解的底物上緊跟支鏈的α-1,4末端；6-可被異普魯蘭酶水解的LfGT產(chǎn)物上緊跟支鏈的α-1,4末端；a-LfGT和普魯蘭酶復(fù)配產(chǎn)物結(jié)構(gòu)；b-LfGT,普魯蘭酶和異普魯蘭酶復(fù)配產(chǎn)物結(jié)構(gòu)圖1 合成步驟底物和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)簡圖Fig.1 Structure of the substrate and product in the synthesis step

2.1.1 LfGT加酶量對右旋糖酐合成的影響

本實驗室篩選得到L.fermentum來源的LfGT，其最適溫度為37 ℃，最適pH為6.0。在LfGT的最適條件37 ℃和pH 6.0下，將200 g/L麥芽糊精(DE2)與不同加酶量的LfGT (300、400、500、800 U/g底物，以下簡稱U/g)反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后使用1.4.1所述方法處理反應(yīng)液，以消除未被利用的底物和產(chǎn)物含有α-1,4糖苷鍵末端的部分，下述合成步驟后處理方法保持一致。使用1.4.3所述方法檢測有效成分的峰面積占比來確定LfGT加酶量對合成反應(yīng)效率的影響。

如圖2-a所示，12.384 min和10.739 min出峰成分為本合成步驟產(chǎn)物右旋糖酐，16.206 min出峰為葡萄糖。如圖2-b所示，當(dāng)LfGT加酶量為400 U/g時，右旋糖酐的產(chǎn)物占比最高，約為24.5%，此時葡萄糖占比為71.5%，未被LfGT利用的麥芽糊精經(jīng)高溫淀粉酶和糖化酶中間處理水解為葡萄糖。產(chǎn)物由酵母消除葡萄糖后冷凍干燥成粉末后，稱取其30～40 mg粉末溶于500 μL D2O，使用0.3 g/L TMSP作為內(nèi)標(biāo)一同溶于樣品中進(jìn)行1H-NMR檢測，如圖2-c所示，檢測得產(chǎn)物中α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵的比例為1∶3.15，α-1,6糖苷鍵比率為76%。加酶量為400～800 U/g，產(chǎn)物右旋糖酐減少，可能是LfGT存在副反應(yīng)——水解反應(yīng)，在右旋糖酐產(chǎn)量接近平衡時，增加LfGT的加酶量，其水解反應(yīng)開始起作用，水解底物麥芽糊精或生成的產(chǎn)物右旋糖酐，因此提高加酶量反而使得右旋糖酐產(chǎn)量降低。

a-LfGT產(chǎn)物HPLC圖譜(G1：葡萄糖；G2：麥芽糖；G3：麥芽三糖；≥G4：麥芽四糖～麥芽七糖)；b-LfGT加酶量對右旋糖酐產(chǎn)物占比的影響；c-加酶量為400 U/g時產(chǎn)物1H-NMR圖譜圖2 單獨(dú)使用LfGT產(chǎn)物HPLC圖譜、其加酶量對右旋糖酐產(chǎn)物占比的影響及產(chǎn)物1H-NMR圖譜Fig.2 HPLC analysis of product prepared by LfGT, the effect of LfGT amount on dextran proportion and relavant 1H-NMR analysis

2.1.2 LfGT與普魯蘭酶復(fù)配對右旋糖酐合成的影響

在37 ℃和pH 6.0的條件下，依據(jù)2.1.1的探究結(jié)果使用400 U/g加酶量的LfGT進(jìn)行復(fù)配優(yōu)化，依照實驗室研究經(jīng)驗使用40 U/g的普魯蘭酶進(jìn)行復(fù)配。雙酶復(fù)配的HPLC產(chǎn)物圖譜如圖3-a所示。同時分別使用200 g/L DE2、DE4～6和DE5～7的麥芽糊精作為底物對右旋糖酐的產(chǎn)量進(jìn)行探究，如圖3-b 所示。底物使用DE2麥芽糊精時，單獨(dú)使用LfGT催化反應(yīng)的右旋糖酐產(chǎn)物占比為24.3%，雙酶復(fù)配的右旋糖酐產(chǎn)物占比增加了僅50%；底物使用DE4～6或DE5～7麥芽糊精時，單獨(dú)使用LfGT催化反應(yīng)的右旋糖酐產(chǎn)物占比約45%，雙酶復(fù)配產(chǎn)出右旋糖酐占比增加了15%。雙酶復(fù)配時，DE2麥芽糊精的轉(zhuǎn)化程度更高。此外，利用1H-NMR檢測產(chǎn)物的鍵型比例，如圖3-c所示，在使用DE2的麥芽糊精時，雙酶復(fù)配產(chǎn)物的α-1,6糖苷鍵比率可達(dá)89.2%。各組實驗結(jié)果綜合表明，利用普魯蘭酶與LfGT復(fù)配，可以進(jìn)一步提高產(chǎn)物中右旋糖酐產(chǎn)量。

a-雙酶復(fù)配產(chǎn)物HPLC圖譜；b-復(fù)配組合及底物對右旋糖酐產(chǎn)物占比的影響；c-使用DE2麥芽糊精的雙酶復(fù)配產(chǎn)物1H-NMR圖譜圖3 雙酶復(fù)配產(chǎn)物HPLC圖譜、不同復(fù)配組合與不同DE值麥芽糊精對右旋糖酐占比的影響及雙酶復(fù)配產(chǎn)物1H-NMR圖譜Fig.3 HPLC analysis of product prepared by two enzymes, the effect of enzyme cocktails and maltodextrins with varying DE on dextran proportion and relevant 1H-NMR analysis

2.1.3 LfGT、普魯蘭酶與異普魯蘭酶復(fù)配對右旋糖酐合成的影響

根據(jù)AKEBOSHI等[22]、SAKANO等[23]對來源于A.niger的IPU的研究，其最適pH為3.0～3.5，最適溫度為40 ℃。本研究依據(jù)相關(guān)發(fā)酵方法對IPU進(jìn)行重組表達(dá)。重組表達(dá)的IPU酶活力可達(dá)691.5 U/mL，可用于制備IMOs兩步法工藝。在37 ℃和pH 6.0的條件下，在2.1.2所述雙酶復(fù)配的基礎(chǔ)上使用DE2的麥芽糊精，加入IPU一同反應(yīng)24 h，三酶復(fù)配的HPLC產(chǎn)物圖譜如圖4-a所示。400 U/g的IPU與LfGT和普魯蘭酶復(fù)配時右旋糖酐產(chǎn)物占比可達(dá)66.3%，如圖4-b所示。利用1H-NMR檢測不同組合產(chǎn)物的鍵型比例，如圖4-c所示，三酶組合的鍵型比例為1∶142.3，α-1,6糖苷鍵的比率達(dá)到99.3%，這說明IPU的加入幾乎使所有可用的α-1,4糖苷鍵經(jīng)LfGT轉(zhuǎn)糖基化為α-1,6糖苷鍵。α-1,6糖苷鍵占比更高的右旋糖酐對后續(xù)右旋糖酐酶發(fā)揮水解特性更加有效，從而直接影響IMOs的產(chǎn)率。

a-三酶復(fù)配產(chǎn)物HPLC圖譜；b-三酶復(fù)配不同IPU加酶量對右旋糖酐產(chǎn)物占比的影響；c-IPU加酶量為400 U/g時三酶復(fù)配產(chǎn)物的1H-NMR檢測圖譜圖4 三酶復(fù)配產(chǎn)物HPLC圖譜、不同IPU加酶量對右旋糖酐產(chǎn)物占比的影響及其1H-NMR檢測Fig.4 HPLC analysis of product prepared by three enzymes, the effect of IPU amount on dextran proportion and relevant 1H-NMR analysis

2.2 降解步驟IMOs的制備

2.2.1 BfIMTD加酶量對制備IMOs的影響

依據(jù)相關(guān)方法對BfIMTD進(jìn)行重組表達(dá)，測得胞外上清液的酶活力為7.8 U/mL，說明BfIMTD在大腸桿菌中表達(dá)成功。根據(jù)MIZUNO等[24]對BfIMTD的研究表明，該重組BfIMTD最適溫度為45 ℃，最適pH為7.5。按照1.4.1所述方法使用酵母將產(chǎn)品中的葡萄糖消化，隨后冷凍干燥制成粉末。在40 ℃和pH 7.5的條件下，使用上述右旋糖酐(終質(zhì)量濃度為100 g/L)與BfIMTD反應(yīng)4 h探究BfIMTD加酶量對產(chǎn)出IMOs的影響。如圖5所示，BfIMTD展現(xiàn)其產(chǎn)物特異性，高效產(chǎn)出IG3，IG3的產(chǎn)率在加酶量為150 U/g時可以達(dá)到最高93.6 g/L，兩步法總的IG3轉(zhuǎn)化率為62.1%。

圖5 BfIMTD不同加酶量對IMOs產(chǎn)量的影響Fig.5 The effect of BfIMTD amount on IMOs production

2.2.2 反應(yīng)時長對制備IMOs的影響

在40 ℃和pH 7.5的條件下，使用右旋糖酐溶液(終質(zhì)量濃度為100 g/L)與150 U/g加酶量的BfIMTD反應(yīng)。如圖6所示，從反應(yīng)2 h開始BfIMTD產(chǎn)出84.6 g/L的IG3，隨后緩慢增加，在10 h時達(dá)到最高質(zhì)量濃度98.3 g/L，此時兩步法IG3總的轉(zhuǎn)化率為65.2%，隨后產(chǎn)率保持平緩至12 h。外切酶BfIMTD特異性產(chǎn)出IG3，產(chǎn)品符合對IMOs益生性能的要求。

圖6 反應(yīng)時長對BfIMTD產(chǎn)出IMOs的影響Fig.6 The effect of reaction time by BfIMTD on IMOs yield

3 結(jié)論與討論

以淀粉酶主導(dǎo)制備IMOs的傳統(tǒng)方法工藝復(fù)雜、產(chǎn)率低、有效成分含量低；以右旋糖酐蔗糖酶主導(dǎo)的制備IMOs方法成本高，且產(chǎn)品中含有無法被利用的葡萄糖且其產(chǎn)物右旋糖酐聚合度不可控。本研究開發(fā)了4,6-α-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶和異麥芽三糖右旋糖酐酶高效制備IMOs的兩步法工藝，第1步優(yōu)化單酶、雙酶、三酶復(fù)配體系，以提高中間產(chǎn)物右旋糖酐的產(chǎn)量和α-1,6糖苷鍵比率，使用普魯蘭酶和LfGT復(fù)配時，可以得到產(chǎn)物占比為73.1%的右旋糖酐，其α-1,6 糖苷鍵比率為89.2%，使用IPU、普魯蘭酶與LfGT復(fù)配催化DE2麥芽糊精，可以得到產(chǎn)物占比為66.3%的右旋糖酐，此時其α-1,6糖苷鍵比率可達(dá)99.3%；第2步對異麥芽三糖右旋糖酐酶降解右旋糖酐產(chǎn)出IMOs進(jìn)行優(yōu)化，以制備IG3占比更高的IMOs產(chǎn)品，使用BfIMTD降解三酶復(fù)配產(chǎn)出的右旋糖酐可以產(chǎn)出98.3 g/L的IG3，此時兩步法IG3的產(chǎn)率為65.2%。本研究還可以在以下這些方面展開后續(xù)研究：

(1) 本研究的合成步驟后續(xù)可通過數(shù)據(jù)庫挖掘或自然篩選獲取能夠有效利用麥芽糖、麥芽三糖的4,6-α-GTs，進(jìn)一步提升右旋糖酐產(chǎn)率，同時對4,6-α-GTs催化的鏈長范圍進(jìn)行探究，以產(chǎn)出鏈長更可控的右旋糖酐或IMOs。

(2) 本研究的降解步驟選用的表達(dá)宿主是大腸桿菌，其表達(dá)量高、通用性好，但是IMOs主要用于食品領(lǐng)域，因此后續(xù)研究可選用食品安全菌枯草芽孢桿菌對所需右旋糖酐酶進(jìn)行重組表達(dá)和制備研究，以滿足食品工業(yè)應(yīng)用需求。