饒桂維

(浙江樹(shù)人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州，310015)

白藜蘆醇是植物體內(nèi)用于抵抗病原侵染的一種二苯乙烯非黃酮類(lèi)多酚物質(zhì)，是一種天然的芪類(lèi)化合物[1]。1940年日本學(xué)者首次從毛葉藜醇的根部分離得到白藜蘆醇[2]，白藜蘆醇一直是研究的熱點(diǎn)。如楊蘭澤等[3]經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)得出白藜蘆醇可以清除體內(nèi)過(guò)多的氧自由基，有效地延緩衰老。近年來(lái)對(duì)白藜蘆醇的藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤[4-5]、降低血糖[6]、保護(hù)心血管[7]、抗氧化[8]、抗真菌和抗炎等作用[9-12]。研究者還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)SARS-cov-2引起的肺炎有抗病毒活性[13]，研究表明白藜蘆醇具有能直接或間接作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移各個(gè)過(guò)程中多種途徑的關(guān)鍵靶點(diǎn)[14]。因此，它被譽(yù)為繼紫杉醇之后的又一個(gè)綠色抗癌藥物。

目前從植物提取白藜蘆醇主要來(lái)源于虎杖、桑葚、花生和葡萄等[15-17]。研究顯示花生在發(fā)芽后，其白藜蘆醇含量增大，如TONG等[18]采用木屑為培養(yǎng)基，培養(yǎng)Palgwang品種的花生到45 d，測(cè)得反式白藜蘆醇的含量為19.62 μg/g；康潔等[19]研究發(fā)現(xiàn)，花生萌發(fā)后在胚軸為3和5 cm時(shí)白藜蘆醇含量增加最大；付詩(shī)鳴等[20]研究發(fā)現(xiàn)花生發(fā)芽后總酚的含量是發(fā)芽前的1.7倍。對(duì)植物種子萌發(fā)的前處理會(huì)影響種子萌發(fā)率、自身活性物質(zhì)含量等[21]，常用的前處理方式有：超聲處理、微波處理、激素處理[22]、干旱脅迫和鹽脅迫處理等[23]。于淼[24]采用超聲脅迫提高了花生種子中白藜蘆醇合成酶的活性和基因表達(dá)，促進(jìn)了白藜蘆醇的生成。目前還無(wú)綜合研究微波、植物激素和鹽脅迫對(duì)花生萌芽期白藜蘆醇變化的文獻(xiàn)報(bào)道。我國(guó)花生資源十分豐富，并且廉價(jià)易得，故研究花生發(fā)芽期其白藜蘆醇含量變化和各種脅迫方式對(duì)其影響，探尋提高花生白藜蘆醇含量的培養(yǎng)條件具有廣闊的應(yīng)用前景。本文采用高效液相色譜法監(jiān)測(cè)花生發(fā)芽期其白藜蘆醇的含量變化，采用微波、植物激素和鹽脅迫等方式研究花生發(fā)芽期間其白藜蘆醇含量變化，并用得到的最佳條件培養(yǎng)10種不同產(chǎn)地的花生，得出白藜蘆醇含量最高的花生品種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料：10種花生采購(gòu)于電商，置于-18 ℃下貯存，備用。

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)，阿拉丁公司；色譜甲醇，美國(guó)天地公司；無(wú)水乙醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)；吲哚乙酸、吲哚丁酸、水楊酸、阿魏酸、丁香酸、KCl、CaCl2、ZnCl2、CuCl2、NH4Cl、FeSO4、K2SO4、ZnSO4、Na2SO4、NaH2PO4、NaHCO3、Na2CO3和(NH4)2S2O8皆為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(包括UV230II紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器、P230II高壓恒流泵、LU230II低壓梯度混合器)，大連依利特分析儀器有限公司；UPWS超純水器，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；LG10-2.4A高速離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；L6S紫外分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；PL402-L電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；JK-100超聲波清洗器，合肥金尼機(jī)械制造有限公司；C型30玻璃儀器快速烘干器，長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DGG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白藜蘆醇色譜測(cè)定

白藜蘆醇高效液相色譜條件[25]：色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)；流動(dòng)相為水∶甲醇(體積比55∶45)；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，即為500 mg/L的儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)使用液：將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成0.5、1.0、5.0、25.0和50.0 mg/L的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)使用液。在“1.3.1”色譜條件下，測(cè)各濃度標(biāo)準(zhǔn)使用液的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 花生芽中白藜蘆醇的提取

采用農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY/T 2641—2014 植物源性食品中白藜蘆醇的測(cè)定高效液相色譜法[25]進(jìn)行處理：稱(chēng)取經(jīng)拭干水的30 g花生芽樣品，加入60 mL無(wú)水乙醇后在高速組織搗碎機(jī)中提取2 min，將混合液倒入燒杯中超聲再提取30 min后，倒入離心管中4 000 r/min的離心機(jī)中離心10 min，取上層清液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.4 不同發(fā)芽時(shí)間花生芽中白藜蘆醇含量變化

取適量山東改良海花1號(hào)花生經(jīng)消毒后在40 ℃下泡種2 h，將發(fā)芽盒盒底鋪上1層紗布，花生平行設(shè)置3組，每組750 g，置于溫度為30 ℃，濕度為60%的暗環(huán)境下發(fā)芽，每天澆水，取樣，按照1.3.3方法提取其中的白藜蘆醇，按照1.3.1色譜條件測(cè)定含量。

1.3.5 微波輻射脅迫對(duì)花生芽中白藜蘆醇含量影響

取適量山東改良?；?號(hào)花生經(jīng)消毒后在40 ℃下泡種2 h，將發(fā)芽盒盒底鋪上1層紗布，花生平行設(shè)置3組，每組180 g，置于溫度為30 ℃，濕度為60%的暗環(huán)境下發(fā)芽，每天澆水，在第4天時(shí)各取30 g用110 W微波[20]0，30，60，90，120，150 s進(jìn)行輻射，第2天取樣，按照1.3.3方法提取其中的白藜蘆醇，按照1.3.1色譜條件測(cè)定含量。

1.3.6 植物激素誘導(dǎo)對(duì)花生發(fā)芽期白藜蘆醇含量影響[26]

考察常見(jiàn)的植物激素如吲哚乙酸、吲哚丁酸、水楊酸、阿魏酸和丁香酸對(duì)花生的萌發(fā)影響，尤其是花生發(fā)芽期白藜蘆醇含量的變化，以及找到花生發(fā)芽期白藜蘆醇含量最高的激素種類(lèi)及濃度。取適量山東改良?；?號(hào)花生經(jīng)消毒后在40 ℃下泡種2 h，將發(fā)芽盒盒底鋪上1層紗布，花生平行設(shè)置3組，每組450 g，置于溫度為30 ℃，濕度為60%的暗環(huán)境下發(fā)芽，每組每天淋相應(yīng)濃度(25～500 mg/L)生長(zhǎng)激素溶液，在第5天取樣，按照1.3.3方法提取其中的白藜蘆醇，按照1.3.1色譜條件測(cè)定含量。

1.3.7 鹽脅迫對(duì)花生發(fā)芽期間白藜蘆醇含量影響

分別將KCl、CaCl2、ZnCl2、CuCl2、NH4Cl、FeSO4、K2SO4、ZnSO4、Na2SO4、NaH2PO4、NaHCO3、Na2CO3和(NH4)2S2O8配制成0.5 g/L溶液，取適量山東改良?；?號(hào)花生經(jīng)消毒后在40 ℃下泡種2 h，將發(fā)芽盒盒底鋪上1層紗布，花生平行設(shè)置3組，每組450 g，置于溫度為30 ℃，濕度為60%的暗環(huán)境下發(fā)芽，每組每天淋相應(yīng)濃度鹽溶液，在第5天取樣，按照1.3.3方法提取其中的白藜蘆醇，按照1.3.1色譜條件測(cè)定含量。

1.3.8 不同鹽濃度脅迫對(duì)花生發(fā)芽期間白藜蘆醇含量影響

經(jīng)上述1.3.7下13種鹽脅迫實(shí)驗(yàn)，得到最佳的脅迫鹽種類(lèi)，進(jìn)行不同濃度鹽脅迫因素實(shí)驗(yàn)，配制含該鹽0、0.5、1.5、2.0、2.5和3.0 g/L的溶液，取適量山東改良?；?號(hào)花生經(jīng)消毒后在40 ℃下泡種2 h，將發(fā)芽盒盒底鋪上1層紗布，花生平行設(shè)置3組，每組540 g，置于溫度為30 ℃，濕度為60%的暗環(huán)境下發(fā)芽，每組每天淋相應(yīng)濃度鹽溶液，在第5天取樣，按照1.3.3方法提取其中的白藜蘆醇，按照1.3.1色譜條件測(cè)定含量。

1.3.9 最佳脅迫因素下對(duì)花生發(fā)芽期間白藜蘆醇含量影響

通過(guò)對(duì)比植物激素脅迫和鹽脅迫對(duì)花生芽中白藜蘆醇含量的大小，選取最佳的脅迫方式和參數(shù)，對(duì)采集到的10種花生品種進(jìn)行脅迫培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，在同一條件下培養(yǎng)到第5天時(shí)取樣，按照1.3.3方法提取其中的白藜蘆醇，按照1.3.1色譜條件測(cè)定含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上指標(biāo)均取3個(gè)平行樣品，重復(fù)測(cè)定3次。采用Excel軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和Origin繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過(guò)實(shí)驗(yàn)求得各濃度下的標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積之間的關(guān)系,為y=71.127x-33.678,線性擬合結(jié)果R2=0.999，結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好，白藜蘆醇質(zhì)量濃度在0.5～50 mg/mL線形良好。

2.2 發(fā)芽時(shí)間對(duì)發(fā)芽花生中白藜蘆醇含量的影響

通過(guò)24 d的監(jiān)測(cè)，計(jì)算得出山東改良?；?號(hào)花生芽白藜蘆醇含量隨發(fā)芽時(shí)間變化的曲線，如圖1所示。由圖1可知，該種花生芽在生長(zhǎng)到第19天到第23天期間白藜蘆醇含量明顯高于其他時(shí)期，其中第20天白藜蘆醇含量出現(xiàn)最大值，達(dá)到了5.3 mg/100g，其次是第22天，白藜蘆醇含量達(dá)到了5.1 mg/100g。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)芽時(shí)間為第5天時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)前18 d發(fā)芽期的高峰，白藜蘆醇含量達(dá)到了1.51 mg/100g,本研究基于培養(yǎng)消耗成本及時(shí)間成本考慮，選定培養(yǎng)花生發(fā)芽測(cè)定其中白藜蘆醇的的最佳時(shí)間為發(fā)芽的第5天。本項(xiàng)目后續(xù)測(cè)量各種脅迫因素影響花生芽中白藜蘆醇含量的時(shí)間為發(fā)芽期第5天。

圖1 白藜蘆醇含量隨花生發(fā)芽時(shí)間變化的影響Fig.1 Effect of peanut germination time on resveratrol content

2.3 微波輻射脅迫對(duì)花生芽中白藜蘆醇含量的影響

微波輻射脅迫對(duì)花生芽中白藜蘆醇含量影響結(jié)果如圖2所示。經(jīng)發(fā)芽培養(yǎng)的花生芽樣品經(jīng)過(guò)功率為100 W，時(shí)間為30～150 s微波處理后，測(cè)定得到花生芽中的白藜蘆醇含量為1.2～1.6 mg/100g，相比于未經(jīng)微波處理的花生芽白藜蘆醇含量(1.5 mg/100g)無(wú)顯著提高，證明微波促進(jìn)作用甚微，從培養(yǎng)成本考慮，本研究后續(xù)的實(shí)驗(yàn)皆不采用微波脅迫方法。

圖2 微波時(shí)間對(duì)花生發(fā)芽白藜蘆醇含量影響Fig.2 Effect of microwave time on resveratrol content duringpeanut germination

2.4 植物激素誘導(dǎo)對(duì)花生發(fā)芽期白藜蘆醇含量的影響

各不同質(zhì)量濃度的阿魏酸、水楊酸、丁香酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸對(duì)花生發(fā)芽期間白藜蘆醇含量的影響見(jiàn)圖3～圖7。5種酸的單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：阿魏酸在200 mg/L時(shí)白藜蘆醇含量最高為1.71 mg/100g；水楊酸在100 mg/L時(shí)白藜蘆醇含量最高為1.74 mg/100g；丁香酸在200 mg/L時(shí)白藜蘆醇含量最高為1.71 mg/100g；吲哚乙酸在300 mg/L時(shí)白藜蘆醇含量最高為1.71 mg/100g；吲哚丁酸在100 mg/L 時(shí)白藜蘆醇含量最高為1.7 mg/100g。而不添加上述植物激素溶液的花生芽對(duì)照樣品中白藜蘆醇的含量為1.51 mg/100g，采用水楊酸在100 mg/L濃度脅迫的花生芽中白藜蘆醇含量是對(duì)照樣品的1.15倍。由此可見(jiàn)，這些植物激素皆能促進(jìn)花生發(fā)芽期間白藜蘆醇含量的增加。變化趨勢(shì)是白藜蘆醇的峰面積先隨植物激素濃度升高而升高，后隨其濃度升高而下降。表明適當(dāng)?shù)闹参锛に貪舛饶艽碳せㄉ堪邹继J醇的產(chǎn)生，而過(guò)高的濃度則會(huì)抑制花生芽代謝生成白藜蘆醇。

圖3 水楊酸質(zhì)量濃度對(duì)花生發(fā)芽白藜蘆醇含量影響Fig.3 Effect of salicylic acid concentration on resveratrol content during peanut germination

圖4 丁香酸質(zhì)量濃度對(duì)花生發(fā)芽白藜蘆醇含量影響Fig.4 Effect of syringic acid concentration on resveratrol content during peanut germination

圖5 吲哚乙酸質(zhì)量濃度對(duì)花生發(fā)芽白藜蘆醇含量影響Fig.5 Effect of indoleacetic acidconcentration on resveratrol content during peanut germination

圖6 吲哚丁酸質(zhì)量濃度對(duì)花生發(fā)芽白藜蘆醇含量影響Fig.6 Effect of indolebutyric acid concentration onresveratrol content duringpeanut germination

圖7 阿魏酸質(zhì)量濃度對(duì)花生發(fā)芽白藜蘆醇含量影響Fig.7 Effect of ferulic acid concentration on resveratrol content during peanut germination

2.5 鹽脅迫對(duì)花生發(fā)芽期間白藜蘆醇含量影響

本實(shí)驗(yàn)選取了5種鹽酸鹽、4種硫酸鹽和2種碳酸鹽以及1個(gè)磷酸鹽和1個(gè)過(guò)硫酸鹽來(lái)進(jìn)行鹽脅迫實(shí)驗(yàn)。由表1可知，不同種類(lèi)的鹽溶液對(duì)花生發(fā)芽到第5天時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)不盡相同，KCl、CaCl2、K2SO4和Na2SO4培養(yǎng)的花生芽在顏色和光澤和不用鹽脅迫培養(yǎng)的花生芽基本一致，為白色淺綠。而CuCl2和FeSO4培養(yǎng)的花生芽一個(gè)呈淺灰黑色，一個(gè)表皮黑色。其他鹽類(lèi)多淺綠色。從芽的形態(tài)和狀態(tài)看，除了ZnCl2、CuCl2、Na2SO4培養(yǎng)的花生芽相對(duì)對(duì)照芽顯得芽頭小，而FeSO4鹽脅迫的花生芽芽干細(xì)長(zhǎng)、發(fā)芽率低。而(NH4)2S2O8脅迫培養(yǎng)的花生芽芽干粗壯，發(fā)芽率高。從白藜蘆醇含量來(lái)看，經(jīng)各鹽脅迫后，花生芽中的白藜蘆醇含量普遍得到增加。采用同濃度的CuCl2與(NH4)2S2O8溶液培養(yǎng)花生種子時(shí)，花生中的白藜蘆醇含量增加最多，約為正常培養(yǎng)的花生的1.2倍。但由于CuCl2含重金屬離子Cu2+，具有毒性，且培養(yǎng)的花生芽十分短小，而(NH4)2S2O8為氧化劑，且培養(yǎng)出來(lái)的花生芽較為粗壯，考慮到環(huán)境及在花生中的殘留問(wèn)題，我們采用(NH4)2S2O8做后續(xù)的濃度實(shí)驗(yàn)。

表1 不同鹽類(lèi)處理對(duì)花生發(fā)芽白藜蘆醇含量影響Table 1 Effects of different salt treatments on resveratrol content during peanut germination

2.6 不同濃度(NH4)2S2O8對(duì)花生發(fā)芽期間白藜蘆醇含量的影響

得到最佳鹽種類(lèi)之后，配制質(zhì)量濃度為0、0.5、1.5、2.0、2.5和3.0 g/L的(NH4)2S2O8溶液，并分組進(jìn)行培養(yǎng)該花生種子，提取，進(jìn)樣。由圖8可知，促進(jìn)白藜蘆醇含量增加的最佳鹽溶液的質(zhì)量濃度為2.5 g/L，白藜蘆醇的含量為同批次正?；ㄉ?.5倍。

圖8 過(guò)硫酸銨濃度對(duì)花生芽白藜蘆醇含量變化影響Fig.8 Effect of ammonium persulfate concentration on resveratrol content during peanut germination

2.7 用所得最佳條件培養(yǎng)10種不同產(chǎn)地的花生發(fā)芽白藜蘆醇含量結(jié)果

綜合上述微波脅迫、植物激素種類(lèi)脅迫和鹽種類(lèi)脅迫結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用配制2.5 g/L的(NH4)2S2O8溶液來(lái)對(duì)采集到的10種花生進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)。由表2可知，采用2.5 g/L的(NH4)2S2O8溶液脅迫培養(yǎng)的花生芽中白藜蘆醇含量為8.22～13.32 mg/100g。各品種花生芽白藜蘆醇含量與品種緯度無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。而江蘇省大白沙花生的白藜蘆醇含量最高達(dá)到了13.32 mg/100g，是云南紅皮花生的白藜蘆醇含量8.22 mg/100g的1.62倍。山東平度富硒黑皮花生及云南七彩花生雖粒徑較小，但總體上含量均高于其他品種花生。

表2 用2.5 g/L的 (NH4)2S2O8溶液培養(yǎng)10種花生白藜蘆醇含量Table 2 resveratrol content of culture by ten peanut species with mass fraction of 2.5 g/L (NH4)2S2O8solution

3 結(jié)論

花生發(fā)芽期間的白藜蘆醇含量隨時(shí)間有變化：結(jié)果表明，在花生生長(zhǎng)第20天白藜蘆醇含量出現(xiàn)最大值，并且在第5天出現(xiàn)小峰值。該文通過(guò)單因素試驗(yàn)探究了微波輻射對(duì)花生發(fā)芽期間白藜蘆醇含量的影響，結(jié)果表明微波輻射對(duì)促進(jìn)白藜蘆醇含量的效果一般。此外，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了不同濃度的5種激素對(duì)花生中白藜蘆醇含量的影響差異，得出激素處理促進(jìn)白藜蘆醇含量增加的最佳條件為：水楊酸在100 mg/L質(zhì)量濃度脅迫的花生芽中白藜蘆醇含量是對(duì)照樣品的1.15倍。該文還研究了13種鹽類(lèi)對(duì)花生發(fā)芽期間白藜蘆醇含量的影響，基于綠色環(huán)保的理念，得出最佳鹽類(lèi)為(NH4)2S2O8及其最佳質(zhì)量濃度為2.5 g/L，該條件下培養(yǎng)的花生中白藜蘆醇含量是正?；ㄉ械?.5倍。采用2.5 g/L的(NH4)2S2O8溶液培養(yǎng)10個(gè)品種的花生，江蘇省高產(chǎn)大白沙花生發(fā)芽期的白藜蘆醇含量最高，達(dá)到13.32 mg/100g。