王佳悅，董亞博，付元濤，蘭天，隋曉楠，王歡，江連洲

(東北農業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱，150030)

大豆蛋白作為一種重要的食品成分，是目前最豐富的具有重要商業(yè)價值的植物蛋白來源之一，由于其具有顯著的營養(yǎng)和功能特性、對健康的積極作用且低成本容易獲取而被廣泛應用于食品加工中[1]。大豆蛋白的生理、功能和營養(yǎng)特性對加工利用具有重要意義，因此通常經由化學、物理和酶處理大豆蛋白以改善其特性[2]。其中，利用酶水解蛋白制備具有多種生物活性功能(抗氧化性[3]、血管緊張素轉換酶抑制活性[4]、降血壓、降膽固醇、細胞保護作用[5]等)的蛋白肽受到越來越多的關注和研究。因此，酶法生產大豆蛋白肽已成為功能性食品配料、化妝品和藥品開發(fā)中公認的工藝[6-7]。蛋白質水解物通常是大量肽片段的混合物，因此需要進行分離以得到目標肽，目前幾種有效的分離肽的技術包括：高效液相色譜法(HPLC)[8-9]、超濾法[10]、體積排阻色譜法(size exclusion chromatography，SEC)[11]。然而，這些技術在使用中存在一些問題，如膜污染、操作繁瑣、成本高等[12]。

表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是綠茶中含量最豐富的兒茶素，也是已知的能夠捕獲大多數活性氧，如超氧化物、單線態(tài)氧、羥基自由基最有效的的茶多酚[13]。同時，EGCG還因其潛在的抗病毒、抗菌和神經保護等藥理作用而引起人們的關注。流行病學研究表明，攝入EGCG可以降低心血管疾病、神經退行性疾病、糖尿病和肥胖的風險[14]。近年來，多酚-蛋白質相互作用被廣泛研究，即多酚通過共價或非共價作用絡合蛋白質，進而影響蛋白質的結構、功能及營養(yǎng)特性[15]。WEI等[16]研究發(fā)現EGCG和乳球蛋白之間的相互作用改變了乳球蛋白的結構、功能和生物活性。DING等[17]研究表明，EGCG的加入使大豆蛋白油脂體的穩(wěn)定性顯著提高，并減緩油脂釋放速率。此外，除了形成可溶的絡合物，多酚與蛋白質相互作用也會形成不可溶的聚集體[18-19]。EGCG與富含脯氨酸的蛋白質有很強的相互作用，導致蛋白質聚集[20-21]。

本研究是根據EGCG與大豆分離蛋白(soy protein isolate，SPI)酶解物復合會形成不溶性肽聚集物，考察利用EGCG從大豆分離蛋白酶解液(soy protein hydrolysate，SPHs)中回收多肽的作用，并對大豆多肽與EGCG復合物性質進行表征，考察了EGCG濃度和pH值對總肽提取率的影響，通過對復合物的結構、功能的變化以及抗氧化活性的分析進一步評估回收肽的質量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI，實驗室自制；EGCG(純度98%)，西安通澤生物技術公司；堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 L，2.4 AU/g)，諾維信公司；鹽酸、氫氧化鈉(均為分析純)，天津基準化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

CJJ-6磁力攪拌器，納麗雅有限公司；Eppendorf 5 424R冷凍離心機，Eppendorf德國公司；PHS-25數顯臺式酸度計，上海雷磁公司；HH420光合水箱水浴鍋，光合有限公司；2500C高速研磨機，艾澤拉有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SPI的制備

參考ZHANG等[22]的方法稍加修改。將大豆磨粉過60目篩，與正己烷混合(質量比1∶3)進行3次脫脂得到脫脂豆粉。將脫脂豆粉溶于去離子水中(質量比1∶10)，并用2 mol/L NaOH調節(jié)pH至8.0。所得漿液在45 ℃條件下連續(xù)攪拌2 h，并在10 000×g離心30 min后收集上清液。用2 mol/L HCl調節(jié)上清液pH至4.5沉淀蛋白質，然后在6 500×g下離心20 min 收集沉淀。將得到的沉淀水洗3次，并用2 mol/L NaOH調節(jié)pH至中性后冷凍干燥得到大豆分離蛋白粉末。

1.3.2 SPI酶解物的制備

將凍干大豆分離蛋白粉末溶于去離子水中(質量濃度為40 g/L)，于50 ℃下加熱攪拌20 min以達到堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)最適溫度。在SPI溶液中加入Alcalase 2.4 L(質量濃度為10 g/L)分別持續(xù)酶解30、60、90 min，并在酶解過程中用2 mol/L NaOH始終保持SPI溶液的pH為8.5。將所有樣品在85 ℃的水浴中加熱10 min，并立即在冰浴中冷卻至室溫終止反應。將酶解后的混合物調節(jié)pH至中性，然后在3 000×g下離心20 min。將含有大部分大豆分離蛋白酶解物的上清液分離。

1.3.3 SPHs的分子質量分布

參考ZHANG等[3]的方法對大豆蛋白酶解產物的分子質量分布進行測定。采用島津LC 20 A型高效液相色譜儀利用體積排阻色譜(SEC-HPLC)法進行測定，檢測器為紫外檢測器(ultraviolet detector，UVD)，色譜柱為AdvanceBio SEC柱(300 mm×4.6 mm，2.70 μm)。將樣品溶于PBS(0.01 mol/L，pH 7.0)中，配制質量濃度為1 mg/mL 的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，進樣體積10 μL。流動相為磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 7.0)，洗脫速度0.30 mL/min，檢測波長為220 nm。分別以牛γ-血球蛋白(158 kDa)、牛血清白蛋白(66 kDa)、雞卵白蛋白(44 kDa)、馬肌紅蛋白(17 kDa)和維生素B12(1.35 kDa)作為標準品得到各個蛋白的保留時間與相對分子質量間的回歸方程，進而計算大豆蛋白酶解物的分子質量分布。

1.3.4 EGCG沉降SPHs

量取等量SPHs分別調節(jié)pH值至4.5和7.0，將0、0.05%、0.10%、0.20%(質量分數)EGCG分別加入SPHs溶液(pH 4.5和7.0)中，并在室溫下避光攪拌30 min。隨后，在4 ℃下用去離子水透析24 h后將混合物以10 000×g離心20 min，收集沉淀冷凍干燥后進行分析。肽回收率根據公式(1)計算：

(1)

式中：P′為上清液中肽含量，P為SPHs中肽含量。

1.3.5 SPHs-EGCG的紅外光譜分析

參考JIANG等[23]的方法，稱取一定量的SPHs-EGCG復合物樣品與溴化鉀粉末混合后壓片，兩者配比為1∶100(質量比)，紅外光譜儀分辨率設置為4 cm-1，掃描次數設置為32次，掃描波數譜段范圍設置為400～4 000 cm-1。隨后用Peakfit 4.12軟件對譜圖進行分析，并通過積分面積來計算肽的二級結構組分的百分含量占比。

1.3.6 SPHs-EGCG的表面疏水性分析

使用熒光探針ANS-方法測量表面疏水[24]。在室溫下用10 mmol/L的PBS稀釋樣品使其質量濃度達0.04～0.2 g/L，將4 mL樣品溶液與20 μL ANS(0.008 mol/L)混合反應15 min后置于石英比色皿中進行熒光光譜測定光譜測定條件設置為：激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長為470 nm，激發(fā)狹縫為5 nm，發(fā)射狹縫寬為5 nm，重復掃描3次。

1.3.7 SPHs-EGCG的抗氧化活性分析

樣品溶液與等體積的DPPH原液(0.20 mmol/L，體積分數95%的乙醇溶液)混合。室溫下在黑暗中孵育30 min后，用酶標儀(Tecan Infinite M200酶標儀，Tecan Inc.，Maennedorf，Switzerland)在517 nm處測量混合物的吸光度?？瞻子靡掖即鍰PPH溶液，對照用乙醇代替樣品溶液。根據公式(2)計算自由基清除率：

(2)

式中：A樣品，A空白，A對照分別為樣品、空白和對照品的吸光度。

1.3.8 統(tǒng)計分析

每組試驗至少需要進行重復3次。采用SPSS 16.0對數據進行ANOVA分析，結果以平均值±標準差(SD)表示，當P<0.05時為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 SPHs的分子質量分布分析

通過排阻色譜測定的SPHs分子質量分布如表1所示。未進行酶處理的樣品中，主要成分為分子質量為5～10 kDa的肽或蛋白小分子，占比85.33%；分子質量>10 kDa的肽含量占13.63%，此時分子質量為1～5 kDa內未發(fā)現肽。隨著酶解時間的增加，分子質量>10 kDa的肽含量逐漸減少，形成更小的多肽。CHABANON等[25]研究發(fā)現油菜籽蛋白在Alcalase 2.4 L酶解過程中，隨著水解度的增加，完整的蛋白或大分子質量的多肽(>10 kDa)逐漸消失，形成更小的多肽。在酶解時間60 min及以后，分子質量5～10 kDa和分子質量<1 kDa的肽含量逐漸下降直至檢測不到，而中間分子質量1～5 kDa的肽含量隨時間延長而增加，這說明酶解作用在整個蛋白上，導致中間肽的出現比例很高(96.96%)[26]。

表1 大豆分離蛋白酶解物的分子質量分布Table 1 Molecular weight distribution of SPHs

2.2 肽回收率分析

不同pH、EGCG添加量、酶解時間條件下的肽回收率如圖1所示。在pH 4.5、7.0時，EGCG的加入使蛋白質回收率增加且聚集體的量與EGCG的濃度呈正相關。CHARLTON等[27]表示多酚可以與肽相互作用形成聚集體并從水溶液中沉淀。當接近蛋白質等電點時，在pH 4.5的條件下，EGCG更容易沉淀多肽。RAWEL等[28]的研究得到相似的結論，在牛血清白蛋白(BSA)的等電點附近，阿魏酸與BSA之間的親和力較高。當EGCG添加量為為0.20%時，pH 4.5 的條件下肽的最大回收率為48.3%。在pH 4.5時，隨著酶解時間的增加肽回收率呈先降低后升高趨勢，且加入EGCG的SPHs在30 min時回收率比其他兩個時間點較高，說明EGCG可能與分子質量5～10 kDa的肽更易生成沉淀。

A-pH 7.0；B-pH 4.5圖1 不同pH值、EGCG添加量、酶解時間的條件下肽回收率Fig.1 Peptide recovery rate under different pH value, EGCG concentration and enzymolysis time

2.3 SPHs-EGCG紅外光譜分析

表2展示了不同pH條件下生成的SPHs-EGCG復合物的二級結構含量變化。當pH值為7.0時，無論EGCG添加量為多少，SPHs-EGCG復合物的α-螺旋和β-折疊含量僅發(fā)生輕微的變化。當pH值調為4.5時，隨著EGCG量的增加，SPHs-EGCG復合物的二級結構發(fā)生明顯變化，表現出α-螺旋和β-轉角含量升高，β-折疊含量降低的現象。與ZHOU等[13]研究一致，EGCG的加入改變了蛋白質的二級結構，使其α-螺旋和β-轉角含量升高，β-折疊含量降低。β-折疊含量的降低表明EGCG與蛋白質的結合可以改變蛋白質的構象，蛋白質肽鏈與多酚相互作用后發(fā)生松動，蛋白質被拉伸。同時，KANAKIS等[29]報道多酚可以改變蛋白質的構象，主要體現在α-螺旋、β-轉角含量的增加，與本研究結果一致。

表2 SPHs-EGCG的二級結構變化Table 2 Secondary structure content of SPHs-EGCG

2.4 SPHs-EGCG表面疏水性分析

蛋白質表面疏水性的變化將明顯影響蛋白質的界面性質，而界面性質在穩(wěn)定食品配方(如分散劑、泡沫和乳劑)方面起著重要作用[30]。因此蛋白質的疏水基團的暴露(蛋白質三級結構的指示)使用熒光探針(ANS)的信號增強進行測量。圖2為不同EGCG添加量、不同pH值條件生成的SPHs-EGCG復合物的表面疏水性。由圖2可知，EGCG的加入可使蛋白質的表面疏水性降低，且EGCG的添加量和蛋白質表面疏水性值成反比。這可以歸因于酚類化合物內部的極性基團，EGCG引入的親水性羧基和羥基對蛋白質的疏水性產生了負面影響[28]。此外，SPHs-EGCG表面疏水性的降低可能是由于EGCG交聯蛋白中一些埋藏在肽鏈內部的疏水性基團，降低了熒光探針結合位點的可及性,由此也改變了蛋白質的空間結構[31]。此外。在EGCG添加量相同的條件下，pH 4.5的表面疏水性高于pH 7.0，表明SPHs-EGCG在酸處理期間的暴露出疏水基團，表面疏水性增加。酸性pH處理促進蛋白質結構展開，導致蛋白質的表面疏水性顯著增加[32]。

圖2 不同pH值、EGCG添加量條件下SPHs-EGCG表面疏水性Fig.2 Surface hydrophobicity of SPHs-EGCG at different pH value and EGCG concentration

2.5 SPHs-EGCG抗氧化能力分析

自由基清除能力是使用酚類化合物作為功能性添加劑的食品貨架穩(wěn)定性以及對健康有益的重要指標。本文采用DPPH自由基清除法檢測SPHs-EGCG，SPHs的抗氧化活性。如圖3所示，未結合EGCG的SPHs具有20%～40%的自由基清除率，而SPHs的抗氧化活性歸因于其組成部分多肽的抗氧化活性[33]。此外，SPHs清除DPPH自由基的能力隨水解時間的延長而提高?？寡趸芰Φ奶岣呤怯捎诖蠖沟鞍姿夂蟊┞读穗[藏的氨基酸殘基和具有抗氧化能力的側鏈(通常隱藏在蛋白質分子的三維結構中)[34]。YAN等[35]的研究表明EGCG通過范德華力和疏水相互作用與蛋白質結合，保護其復合物免受降解，從而提高其抗氧化特性并提高生物利用度，與該研究結果一致。隨著EGCG添加量的增加，SPHs-EGCG復合物呈現出更高的抗氧化活性，這是由于EGCG的加入引入了許多酚羥基或者與多肽的協同作用[16]。

A-pH 7.0；B-pH 4.5圖3 SPHs-EGCG的自由基清除能力Fig.3 DPPHs scavenging ability of SPHs-EGCG

3 結論

本研究考察了利用EGCG從大豆分離蛋白酶解液中回收多肽的作用，并對大豆多肽與EGCG復合物性質進行了研究。結果表明，在大豆分離蛋白酶解物中，隨著酶解時間的增延長，中間肽的出現比例增加(96.96%)。EGCG的加入使多肽回收率增加，且聚集體的量與EGCG的添加量呈正相關。隨著酶解時間的添加量，肽回收率先降低后升高，且在30 min時回收率最高，表明EGCG可能與分子質量5～10 kDa的肽更容易生成沉淀。通過紅外光譜分析，EGCG的加入使蛋白質的二級結構發(fā)生改變，其α-螺旋和β-轉角含量升高，β-折疊含量降低。EGCG的加入會降低蛋白質的表面疏水性，且EGCG的添加量與蛋白質表面疏水性值成反比。通過DPPH自由基清除法檢測證明EGCG添加量的增加會提高SPHs-EGCG復合物的抗氧化活性。