程青麗，李國明，趙曉涵，馮曉文，盧知浩，谷瑞增，魯軍，劉文穎

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)

水產(chǎn)品是蛋白質(zhì)、無機鹽和維生素的良好來源，尤其是蛋白質(zhì)含量豐富，是人類攝取動物性蛋白的重要食品來源之一，一直被世界各國公認為營養(yǎng)、美味的放心食品。隨著經(jīng)濟全球化不斷加深，會有越來越多的消費者對水產(chǎn)品產(chǎn)生習慣性消費。

然而水產(chǎn)品帶來的過敏問題也是層出不窮，大多數(shù)的過敏反應(yīng)屬于Ⅰ型免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介導的過敏反應(yīng)。IgE介導的食物過敏反應(yīng)程度可從輕微的局部癥狀發(fā)展到嚴重的全身性反應(yīng)，臨床表現(xiàn)為蕁麻疹、呼吸困難、嘔吐、腹痛、心血管衰竭等[1]，食物過敏已然逐漸成為全球化共性的人類健康問題。2008年國外流行病學調(diào)查表明，20%～30%世界人口受食品過敏的影響，水產(chǎn)品過敏尤其嚴重[2-3]，這一數(shù)據(jù)在近幾年仍在持續(xù)增長。然而國內(nèi)還沒有類似的系統(tǒng)調(diào)查，但有關(guān)食用蝦、魚、蟹等水產(chǎn)品引起過敏的報道很多，有5%的兒童和2%的成年人會對某些水產(chǎn)品產(chǎn)生過敏。臨床研究表明，在我國食物過敏患者中，海蝦、河蝦、海蟹的過敏率分別高達40.3%、39.0%和37.8%[4-5]。呂相征等[6]研究發(fā)現(xiàn)，對魚和海鮮類過敏者最多,共占36%；貝類和牛奶次之,分別占13.0%和 12.2%。中國預(yù)防醫(yī)學科學院食品營養(yǎng)與安全中心的調(diào)查也表明，水產(chǎn)品是我國食品中最主要的過敏原，并且其所占過敏原比例逐年增加。

水產(chǎn)品中魚類和甲殼類動物過敏原研究已經(jīng)較為深入，而對軟體動物過敏的研究很少，一項有8 600名參與者的問卷調(diào)查的顯示，1%的過敏癥狀與軟體動物有關(guān)[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)甲殼類動物(蝦、龍蝦和螃蟹)和軟體動物(鮑魚、貽貝、扇貝和牡蠣)之間也有交叉反應(yīng)[8]。因此，很有必要對軟體動物過敏原開展深層次研究。

目前已鑒定出6種貝類過敏原，包括肌球蛋白(tropomyosin, TM)[9]、精氨酸激酶(arginine kinase, AK)[10]、肌球蛋白輕鏈[11]、三糖磷酸異構(gòu)酶[12]、和肌漿鈣結(jié)合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein, SCP)[13]。貝類過敏原在臨床上缺乏研究，而TM是太平洋牡蠣中唯一公認的過敏原[14]。

SCP是具有高親和力性的EF手形Ca2+緩沖液，在骨骼肌中表達量最高[15]。SCP主要存在于無脊椎動物中，其致敏性與對蝦的臨床反應(yīng)性有關(guān)[16]，在各種甲殼類動物中構(gòu)成過敏原[13，17-18]，作用類似于脊椎動物體內(nèi)的小白蛋白，這2種蛋白都在快速抽搐骨骼肌中高水平表達。在黑虎蝦中，SCP被鑒定為對蝦過敏原[13]，在凡納濱對蝦中其IgE結(jié)合活性在分子水平上得到了證實[18]。YANG等[19]通過研究發(fā)現(xiàn)，SCP在甲殼類水產(chǎn)中已經(jīng)鑒定出其線性表位和構(gòu)象表位，在軟體類水產(chǎn)中則只做到了基本理化性質(zhì)和特異性IgE結(jié)合分析。重組蛋白比天然蛋白易獲取、純度和穩(wěn)定性更高，在使用重組過敏原的體內(nèi)診斷過敏方面也取得了實質(zhì)性進展[20-22]。本文從分子質(zhì)量、二級結(jié)構(gòu)方面對天然SCP和重組SCP進行一致性比對，旨在獲取與天然蛋白過敏原本質(zhì)無差別甚至致敏性更強的替代重組體，對牡蠣中重組SCP的鑒定對未來全面研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

太平洋牡蠣，山東威海；硫酸銨、碳酸氫鈉、過硫酸銨、二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol, DTT)，北京化工廠；EDTA，中國Biotopped公司；Tris(超純級)、考馬斯亮藍R-250(超高純)，美國Amresco公司；低分子質(zhì)量蛋白Marker，碧云天公司；卡那霉素和異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)，美國VWR公司；PAS染色試劑盒，北京Solarbio公司。

振蕩培養(yǎng)箱，太倉華美公司；多通道超聲破碎儀，寧波新芝；冷凍離心機，美國Sigma公司；雙穩(wěn)定時電泳儀，美國BioRad公司；KTA蛋白純化儀，美國GE Healtheare公司；圓二色(cireular dichroism, CD)光譜儀，英國應(yīng)用光物理公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)儀，德國Ultraflextreme公司；UV-1780紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 天然SCP的提取純化

蛋白純化流程主要參考沈苑[23]的方法，并作適當修改。取牡蠣閉殼肌，切碎，溶于10倍體積預(yù)冷的緩沖液A(50 mmol/L NaCl，2 mmol/L NaHCO3，10 mmol/L EDTA)中，用高速勻漿機勻漿，離心(10 500×g，20 min，4 ℃)取上清液；進行75%～90%硫酸銨鹽析，離心(10 500×g，40 min，4 ℃)取沉淀。將沉淀溶于少量緩沖液B(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0)中，并于透析液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，4 ℃)中透析16 h；最后上樣于已用緩沖液B平衡好的HiTrap-Q柱。用緩沖液B洗脫未吸附部分，再用1 mol/L NaCl線性洗脫2 h，流速為0.5 mL/min，收集洗脫部分于-80 ℃凍存，隨后與重組蛋白樣品同步進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析。

1.2.2 重組SCP的誘導表達

登錄Uniprot數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站查找太平洋牡蠣SCP氨基酸序列(登錄號：CGI_10004435)并設(shè)計完整的基因序列，將其復(fù)制到大腸桿菌表達的目標載體上，本實驗以pET-30a(+)質(zhì)粒構(gòu)建重組載體克隆方案為NdeI-ATG-Sarcoplasmic calcium-binding protein-His tag-Stop codon--HindIII。從超低溫冰箱中取出 BL21(DE3)感受態(tài)細胞，置于冰上融化，加入重組質(zhì)粒(100 ng)，輕輕吹吸充分混勻，冰上放置30 min，水浴鍋42 ℃熱激90 s，冰上放置3 min加入100 μL室溫LB液體培養(yǎng)基，在搖床中37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)60 min，將菌液混勻后涂至卡那霉素抗性平板上。分別挑取3個單克隆，分別接種到4 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB 試管中，在搖床中37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，當OD600值達到0.6～0.8時，向2個試管中分別加入0.5 mmol/L IPTG，15 ℃培養(yǎng)16 h和37 ℃培養(yǎng)4 h，最后一支試管為陰性參照。

1.2.3 樣品準備

取450 μL培養(yǎng)基離心后的沉淀，重懸于300 μL裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl，5%(質(zhì)量分數(shù))甘油，pH 8.0)，用超聲破碎儀裂解10 min。

全菌樣品：取100 μL裂解液，與50 μL 5×上樣緩沖液(30%甘油，10%(質(zhì)量分數(shù))SDS，300 mmol/L Tris，250 mmol/L DTT)混合均勻，100 ℃加熱10 min，15 000 r/min離心5 min。

細胞裂解物的上清液和沉淀樣品:取剩余200 μL裂解液，15 000 r/min離心10 min，分別收集細胞裂解液的上清液和細胞沉淀?；旌?0 μL 5×上樣緩沖液到180 μL上清液中，做為上清樣品。用150 μL 5×上樣緩沖液重懸沉淀，做為沉淀樣品。100 ℃加熱10 min后，15 000 r/min離心5 min，待上樣。

1.2.4 SDS-PAGE分析

使用SDS-PAGE探究重組蛋白在不同溫度和誘導時間以及BL21(DE3)菌的上清液和沉淀中的表達情況。SDS-PAGE：配制5%(聚丙烯酰胺體積分數(shù))濃縮凝膠和15%(聚丙烯酰胺體積分數(shù))分離凝膠進行電泳。將重組SCP蛋白樣品溶液(20 μL)與 5 μL上樣緩沖液混合，并在95 ℃加熱5 min后進行電泳。通過比較低分子質(zhì)量標記蛋白的電泳遷移率來確定分子質(zhì)量。使用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot，WB)鑒定組氨酸(His)標簽標記的目標蛋白，抗His抗體能夠和帶有His標簽的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。確定重組SCP最佳表達條件后，取天然SCP和重組SCP蛋白樣品各20 μL 直接與5 μL上樣緩沖液混合，后續(xù)操作相同。

1.2.5 MALDI-TOF-MS分析

利用MALDI-TOF-MS，進一步分析重組SCP蛋白的準確性。質(zhì)譜鑒定的操作：切下通過SDS-PAGE獲得的目標蛋白，蛋白樣品經(jīng)DTT還原和碘代乙酰胺烷基化處理后，用胰蛋白酶進行凝膠消化。酶解后得到的肽段再經(jīng)C18ZipTip脫鹽后，與基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸混合點板。最后用MALDI-TOF-MS儀進行分析，波長337 nm；加速電壓25 kV；采用正離子模式，自動獲得數(shù)據(jù)。最后使用Mascot搜索工具將目標蛋白酶解后所產(chǎn)生的得到的肽片段的質(zhì)量圖譜與NCBIprot數(shù)據(jù)庫中的指紋進行比較分析。

1.2.4 CD光譜分析

利用CD光譜測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，準備0.3 mg/mL的天然SCP和重組SCP樣品，用CD光譜儀分析其CD光譜，并將測得的3個光譜平均值作為最終數(shù)據(jù)。對于波長分析，以0.5 nm的步長和2.0 nm的帶寬掃描樣品，光譜范圍為190～260 nm，掃描速度為200 nm/min。

1.2.5 過碘酸雪夫染色法(periodic acid-schiff stain，PAS)和碳水化合物-肽連鎖特征

食物過敏原大多數(shù)是具有酸性等電點的糖蛋白，且分子質(zhì)量一般在10～80 kDa[24]。用PAS染色法確定天然SCP是否屬于糖蛋白，取經(jīng)過SDS-PAGE分析的純蛋白條帶，按照試劑盒說明進行實驗，牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)作為陰性對照。用β消除法繼續(xù)驗證SCP上的多糖是否有O-糖苷鍵，根據(jù)CHEN等[25]的實驗稍作修改，取0.25 mg/mL的天然SCP蛋白樣品90 μL與0.5 mol/L的NaOH溶液10 μL混合均勻，于37 ℃靜置孵育15 h，測量其在230～300 nm處的紫外吸光值，以10 μL的純水混合孵育作為對照組。

1.2.6 蛋白多糖含量測定

用苯酚硫酸法測定天然SCP中多糖的含量，以鐘巖等[26]和佟海菊等[27]的實驗作為參考，取5 g重蒸酚定容于100 mL水中預(yù)先配制5%(體積分數(shù))的苯酚溶液，外包錫箔紙放4 ℃?zhèn)溆?；準確稱取105 ℃干燥恒重的1 g葡萄糖定容于100 mL水中，再取上述溶液1 mL定容于100 mL水中，得到0.1 mg/mL的標準葡萄糖溶液，取10支試管分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL標準葡萄糖溶液，均補加蒸餾水至2 mL；取天然SCP蛋白溶液，蛋白質(zhì)量濃度為0.620 9 mg/mL，各0.2 mL于3支試管中，補加蒸餾水至2 mL。以上13支試管先加入5%(體積分數(shù))苯酚溶液搖勻，迅速各加入濃硫酸5 mL，搖2 min，靜置10 min，再于100 ℃水浴加熱20 min，于避光處冷至室溫，在490 nm處測其紫外吸光值，樣品3次測量值取平均值作最終數(shù)據(jù)，以空白試劑作為參比。

1.2.7 氨基酸組成成分分析

Uniprot數(shù)據(jù)庫顯示太平洋牡蠣SCP共含有179個氨基酸，SCP的氨基酸組成已經(jīng)很清楚，本文將SCP的氨基酸組成進行了簡單統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組SCP最佳表達條件確定

將含有目的基因的重組質(zhì)粒pET-30a(+)導入到大腸桿菌BL21(DE3)中，分別在15 ℃誘導16 h和37 ℃ 誘導4 h。用SDS-PAGE和WB檢測全菌、上清液、包涵體樣品，結(jié)果如圖1-A所示，由圖1-A可以看出無論是15 ℃誘導16 h，還是37 ℃誘導4 h的細胞裂解物的上清液和沉淀中，在22 kDa處均有明顯條帶，而在沒有加入IPTG誘導表達的細胞裂解物中沒有條帶顯示。圖1-A表明15 ℃誘導16 h比37 ℃ 誘導4 h蛋白表達量高，且從裂解上清液條帶可以看出前者可溶性蛋白含量也高于后者。圖1-B表明重組的SCP蛋白中含有His標簽，也為下一步的Ni-柱親和層析純化做好基礎(chǔ)。實驗測得最佳表達條件15 ℃誘導16 h蛋白表達水平為25 mg/L，可溶性為70%。

2.2 SDS-PAGE 分析

對牡蠣粗提物進行SDS-PAGE分析，如圖2所示。牡蠣粗提物主要含有相對分子質(zhì)量為20、35和40 kDa 的蛋白條帶，經(jīng)過75%～90%硫酸銨鹽析等后續(xù)操作上樣于HiTrap-Q柱，接收第2個洗脫峰的洗脫部分與重組SCP樣品一起電泳。純化后得到的天然SCP蛋白條帶在20 kDa左右，天然提取的牡蠣蛋白除了目的蛋白SCP外，還有較多的雜蛋白，通過純化也很難得到特別高的純度，而重組SCP蛋白條帶在22 kDa左右，其相對分子質(zhì)量略大于天然SCP相對分子質(zhì)量，這主要是由于重組SCP添加組氨酸標簽使得蛋白相對分子質(zhì)量變大，重組SCP蛋白在經(jīng)過Ni-柱親和層析后可以得到比較純的目的條帶。

A-SDS-PAGE；B-Western blot圖1 太平洋牡蠣SCP(～21.5 kDa)在BL21(DE3)表達的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.1 SDS-PAGE and Western blot analysis of human heavy chain ferritin (～21.5 kDa) expression in BL21 (DE3)注：M1-分子質(zhì)量標記，kDa；M2-WB分子質(zhì)量標記，kDa；PC1-牛血清白蛋白(1 μg)；PC2-牛血清白蛋白(2 μg)；NC-未誘導的全細胞；1-15 ℃誘導16 h的全細胞；2-37 ℃誘導4 h的全細胞；NC1-未誘導的細胞裂解上清；3-15 ℃誘導16 h的細胞裂解上清；4-37 ℃ 誘導4 h的細胞裂解上清；NC2-未誘導的細胞裂解沉淀；5-15 ℃誘導16 h的細胞裂解沉淀；6-37 ℃ 誘導4 h的細胞裂解沉淀；用于WB的抗體為anti-His抗體(GenScript，Cat.No A00186)

M-分子質(zhì)量標記，kDa；1-牡蠣粗提液；2-HiTrap-Q柱洗脫后的純化天然SCP；3-純化的重組SCP圖2 太平洋牡蠣天然SCP與重組SCP SDS-PAGE分析圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of natural SCP and recombinant SCP of Pacific oyster

2.3 MALDI-TOF-MS分析多肽

采用質(zhì)譜法鑒定22 kDa蛋白。用MALDI-TOF分析純化蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后產(chǎn)生的肽段。如圖3所示，純化蛋白的質(zhì)譜顯示多個峰，從800～4 000 Da不等，最高峰為2 377 Da。將2 377 Da處的信號與NCBI 數(shù)據(jù)庫進行比較，使用Mascot工具搜索并觀察Mowse值，肽段序列匹配的最高得分是太平洋牡蠣SCP(登錄號：XP_011436345.1)，匹配值為24，評分為212。質(zhì)譜鑒定的數(shù)據(jù)表明22 kDa蛋白質(zhì)是牡蠣SCP。

圖3 太平洋牡蠣重組SCP質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrometry of recombinant SCP of Pacific oyster

2.4 CD光譜分析

通過上述一系列的實驗的分析，已經(jīng)可以證明重組的SCP是正確的，為了更進一步探究重組SCP與天然SCP是否具有相同的二級結(jié)構(gòu)，進行了CD光譜實驗。CD光譜在遠紫外區(qū)域具有肽鍵吸收信號，并能反映蛋白質(zhì)特征二級結(jié)構(gòu)的含量。由圖4可以看出，天然SCP信號在198 nm處具有1個正峰值，并且在208和222 nm處具有2個負峰值，此外，摩爾橢圓率θ222/θ208>1，這些信號可以有力地證明它是典型的α-螺旋蛋白質(zhì)。重組SCP蛋白的CD光譜信號幾乎與天然SCP的信號相重疊，可能是由于天然牡蠣SCP純度不夠，而重組的SCP純度更高，使得在2個負峰處的值稍有偏差，且經(jīng)蛋白擬合軟件CDNN計算得到蛋白二級結(jié)構(gòu)各組成含量如表1所示，2種蛋白各組成含量基本相同，但這足以證明重組SCP與天然的SCP具有近乎相同的空間結(jié)構(gòu)。

nSCP-天然SCP；rSCP-重組SCP圖4 CD光譜Fig.4 CD spectrum

表1 二級結(jié)構(gòu)各組成含量測定Table 1 Determination of components in secondary structure

2.5 PAS染色和碳水化合物-肽連鎖特征

PAS染色用于鑒定牡蠣天然SCP是否是糖蛋白，如圖5-A所示，陰性對照BSA經(jīng)PAS染色未出現(xiàn)顏色變化，而SCP蛋白條帶經(jīng)染色出現(xiàn)預(yù)期的紫紅色，證實SCP確為糖蛋白。如圖5-B所示，SCP經(jīng)NaOH處理后，在230～300 nm處的紫外吸光值明顯增加，尤其在244 nm處增加值最大。這一結(jié)果表明，SCP的結(jié)構(gòu)中存在1個或多個O-糖苷鍵[28]。O-糖苷鍵與多肽鏈上的絲氨酸或蘇氨酸的羥基相連，在堿的作用下，發(fā)生β消除反應(yīng)，分子內(nèi)脫去1個水分子生成不飽和鍵，在244 nm處產(chǎn)生了紫外吸收。上述2個實驗共同驗證SCP是O-糖苷鍵型的糖蛋白，而研究表明糖蛋白與IgE結(jié)合能力有關(guān)，即糖蛋白與抗原致敏性存在關(guān)聯(lián)。

2.6 SCP多糖含量

根據(jù)梯度葡萄糖濃度在490 nm處測得的吸光值繪制葡萄糖標準曲線，得到標準方程y=9.463 6x-0.000 4，R2=0.986 2，樣品吸光值平均值為0.046，則稀釋10倍前的多糖質(zhì)量濃度為0.049 0 mg/mL，而蛋白質(zhì)量濃度為0.620 9 mg/mL，即求得蛋白中糖含量為7.89%。

圖6 葡萄糖標準曲線Fig.6 Glucose standard curve

2.7 氨基酸組成

SCP氨基酸組成如圖7所示。由圖7可以清楚地看出SCP蛋白含有19種氨基酸，其含有非常豐富的天冬氨酸(D)和賴氨酸(K)，其次是丙氨酸(A)、蛋氨酸(M)和苯丙氨酸(F)，包含人體的8種必需氨基酸，可見氨基酸組成很全面。另外，SCP含有半胱氨酸(C)，半胱氨酸與二硫鍵的形成有關(guān)，有利于形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)，這可能與蛋白的過敏性不易消除存在一定的聯(lián)系。

圖7 SCP氨基酸組成Fig.7 Amino acid composition of SCP注：*-表示人體必需氨基酸；D-天冬氨酸；K-賴氨酸；A-丙氨酸；M-蛋氨酸；F-苯丙氨酸；E-谷氨酸；Q-谷氨酰胺；I-異亮氨酸；G-甘氨酸；V-纈氨酸；T-蘇氨酸；S-絲氨酸；L-亮氨酸；W-色氨酸；N-天冬酰胺；R-精氨酸；Y-酪氨酸；P-脯氨酸；C-半胱氨酸

3 結(jié)論

本研究以太平洋牡蠣為對象，采用飽和硫酸銨鹽析及陰離子交換等方法分離純化天然SCP，進行MALDI-TOF-MS以證實該蛋白為牡蠣中提取的天然SCP。通過基因工程重組表達并采用鎳柱親和層析分離純化重組SCP，進行Western blot證實研究成功利用重組大腸桿菌表達出牡蠣重組SCP。對重組SCP和天然SCP進行SDS-PAGE、CD光譜分析證明了利用重組大腸桿菌表達出的SCP與天然SCP除了分子質(zhì)量稍有差別，空間結(jié)構(gòu)近乎相同，而重組蛋白相對天然蛋白性質(zhì)更加穩(wěn)定便宜獲取，為后期利用重組SCP替代天然SCP進行相關(guān)實驗提供理論支撐。實驗利用PAS染色法鑒定牡蠣天然SCP為糖蛋白，利用苯酚硫酸法測定其蛋白中多糖的含量，采用β消化法鑒定此糖蛋白為O-糖苷鍵型的糖蛋白，另外，也對SCP氨基酸組成成分進行簡要分析，這一系列實驗旨在證明SCP確為牡蠣中的潛在過敏原。牡蠣營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)種類較全，非常適合作為人體營養(yǎng)補充食品，但牡蠣中除原TM和AK 2種重要過敏原，SCP作為新型過敏原也應(yīng)被研究重視。