付仁豪，汪春玲，陳 政，林向東，馮愛國*

（海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228）

2018年我國羅非魚產(chǎn)量約為162.45萬 t，占世界總產(chǎn)量的41%左右[1]。羅非魚蛋白含量高且營養(yǎng)豐富，但是，像其他水產(chǎn)品一樣，新鮮羅非魚由于微生物活性高而極易腐爛[2]。因此，保鮮技術(shù)在羅非魚的貿(mào)易中起著至關(guān)重要的作用。

冷凍貯藏是保持魚類新鮮度最常用的方法，可減緩變質(zhì)速率并延長保質(zhì)期。但凍結(jié)過程不可避免地會對魚肉品質(zhì)產(chǎn)生負面影響，冷鏈運輸或貯存過程中反復(fù)凍融時有發(fā)生[3]，反復(fù)凍融引起的溫度波動導(dǎo)致食品質(zhì)量發(fā)生不良變化，包括水分流失和質(zhì)構(gòu)特性改變等[4]。因此，了解羅非魚片凍融過程中的品質(zhì)變化是至關(guān)重要的。凍融條件下關(guān)于水產(chǎn)品生化指標(biāo)變化的研究很多，但有關(guān)對肌肉組織微結(jié)構(gòu)影響方面的報道較為少見。魚類在凍藏過程中，冰結(jié)晶和組織脫水會使肌肉組織產(chǎn)生蜂窩狀微結(jié)構(gòu)，這是影響冷凍食品最終品質(zhì)的關(guān)鍵因素。與其他多孔結(jié)構(gòu)類似，這種微結(jié)構(gòu)本質(zhì)上是不規(guī)則的，很難用普通的方法來表征[5]。曼德爾布羅特提出的分形維數(shù)是幾何學(xué)中的一個參數(shù)，其表示的是空間結(jié)構(gòu)在一定尺度上的空間填充能力。近年來，汪星星[6]分析了凍融條件下添加不同食品膠對面筋蛋白分形維數(shù)和微結(jié)構(gòu)的影響。陳建文[7]根據(jù)牛肉的大理石紋圖像建立了分形維數(shù)模型以確定其品質(zhì)等級。由此可見，食品的品質(zhì)與微結(jié)構(gòu)和分形維數(shù)的變化存在一定的關(guān)聯(lián)。

本實驗基于肌肉微結(jié)構(gòu)分形維數(shù)和品質(zhì)指標(biāo)來評價反復(fù)凍融下羅非魚片的品質(zhì)變化。采用分形維數(shù)來表征魚片組織被冰晶破壞后的多孔結(jié)構(gòu)，并分析其與總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、色差、總峰面積、電導(dǎo)率、質(zhì)構(gòu)等品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性，旨在為羅非魚保鮮貯藏的品質(zhì)評價提供理論依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮發(fā)色羅非魚片購自海南?？谀沉_非魚加工廠。

甲基紅（分析純）、溴鉀酚綠 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硼酸、鹽酸（均為分析純） 廣州化學(xué)試劑廠；Tissue-Tek?4583 OCT包埋劑 美國Sakura Finetek公司；蘇木精染液、伊紅染液（均為分析純） 南昌雨露實驗器材有限公司；4%組織細胞固定液（分析純） 合肥新恩源生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NMI20-040H-I低場強核磁共振分析儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；HM 550型冷凍切片機 德國MICROM公司；CR-10型色差儀 日本柯尼卡美能達公司； CT3型質(zhì)構(gòu)分析儀 美國博勒飛公司；TDR100時域反射計 美國Campbell Scientific公司；K9840半自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器有限公司；BCD-356WJ型電冰箱 青島海爾股份有限公司；179-UI無紙溫度記錄儀 艾普瑞（上海）精密光電有限公司；Eclipse ci光學(xué)顯 微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

選取規(guī)格約為（130±10）g的新鮮發(fā)色羅非魚片，冷鏈條件下迅速運回實驗室，擦干魚片表面水分后密封包裝置于溫度分別為（-4.0±0.4）、（-18.0±1.5）、（-30.0±2.0）℃冰箱中，并用179-UI無紙溫度記錄儀監(jiān)控溫度。凍藏5 d后取出，于室溫下解凍，魚片中心溫度達到0 ℃后放置10 min，即完成第1次冷凍-解凍過程。隨機選擇樣品進行各指標(biāo)測定，剩余的樣品放入冰箱，按照上述操作依次完成第2～4次凍融，探究冷凍-解 凍循環(huán)條件下對魚片品質(zhì)的影響，每個測試指標(biāo)重復(fù)3 次取平均值。

1.3.2 質(zhì)構(gòu)分析

使用CT3型質(zhì)構(gòu)分析儀的TPA模式，壓縮目標(biāo)距離為2 mm，觸發(fā)負載為7 g，探頭移動速率為4 mm/s，探頭型號為直徑6 mm的圓柱形TA41探頭。選取魚片背部的魚肉進行質(zhì)構(gòu)測定，每片測定3 次，選擇3 組樣品進行測定，結(jié)果取平均值。

1.3.3 電導(dǎo)率的測定

使用TDR100時域反射計和專用軟件測定電導(dǎo)率，擦干樣品表面水分后，將探針從背部完全插入魚片中，點擊“BULK EC”按鍵，記錄測定結(jié)果后再更換兩次探針插入點，操作同上，3 次測定結(jié)果取平均值。

1.3.4 總色差的測定

參考Su Dianbin等[8]的方法并稍作修改，將色差儀探頭置于樣品尾部色澤最鮮艷處，測定L*、a*和b*值。顏色變化總色差（ΔE）按下式計算。

式中：下標(biāo)0表示魚片冷凍前；下標(biāo)t表示魚片凍融第t次。

1.3.5 總揮發(fā)性鹽基氮含量的測定

按郭學(xué)騫等[9]的方法測定TVB-N含量。

1.3.6 水分遷移及含量的測定

參考汪春玲等[10]的方法并稍作修改。使用NMI20-040H-I 低場強核磁共振分析儀分析水分遷移情況及含量，切取背部魚肉（3 cm×3 cm×2 cm），用無干擾的保鮮膜包裝魚肉塊，進行橫向弛豫時間的測定，選取數(shù)據(jù)量200、弛豫時間點數(shù)400、反演方式SIRT、迭代次數(shù)100 000對數(shù)據(jù)進行批量反演，實驗測得樣品各峰面積之和（總峰面積）為3 種狀態(tài)水分含量總和，除以樣品質(zhì)量后，可代表樣品中總水分富集程度。

1.3.7 冷凍切片及分維計算

參考Chen Zheng等[11]的方法并稍作改動。魚片切成2 cm×2 cm×2 cm的肉塊并冷凍，使用時取出。將樣品置于工作溫度為-20 ℃的冷凍切片機內(nèi)，使用 Tissue-Tek?4583 OCT包埋劑包埋，切片厚度為10 μm，切片完成后置于載玻片上進行蘇木精-伊紅染色。染色完成后使用Eclipse ci光學(xué)顯微鏡以40 倍放大倍數(shù)觀察樣品的組織結(jié)構(gòu)，并拍攝組織微結(jié)構(gòu)圖像。

通過ImageJ軟件采用盒維計數(shù)法計算得到分形維數(shù)，先將組織顯微圖像二值化，用長度分別為圖像邊長1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64的子方格覆蓋二值化圖像，統(tǒng)計覆蓋圖像中肌肉組織的格子數(shù)，記為N（1/ε），ε表示測量尺度。令y＝lnN（1/ε）、x＝ln 1/ε，對x和y進行回歸分析，直線斜率即為組織微結(jié)構(gòu)的分形維數(shù)[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2019軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，采用Origin 2017軟件作圖，采用SPSS 24軟件對實驗數(shù)據(jù)進行皮爾遜相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍融條件下羅非魚片質(zhì)構(gòu)特性的變化

羅非魚片的質(zhì)構(gòu)特性是評價魚肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，直接影響到魚肉的感官和功能。羅非魚片在3 種低溫凍融條件下的硬度如圖1A所示。新鮮羅非魚片的硬度為（123.4±9.4）g，隨著凍融次數(shù)的增加，硬度逐漸降低。至凍融4 次時，3 組樣品硬度存在明顯差異， -4 ℃保存的樣品在4 次凍融循環(huán)后硬度最低，下降了64.34%，而保存在-18 ℃和-30 ℃的樣品凍融4 次后硬度分別下降60.29%、49.27%。魚片的硬度可能與其肌肉纖維有關(guān)，更緊密堆積的肌肉纖維會賦予魚片更大的硬度，魚片在反復(fù)凍融過程中，魚肉組織內(nèi)的冰晶由于不斷地融解、凍結(jié)，使得維持肌肉結(jié)構(gòu)的氫鍵持續(xù)斷裂，肌纖維逐漸軟化，硬度逐漸降低[13]。

圖1 凍融條件下羅非魚片質(zhì)構(gòu)特性的變化Fig.1 Changes in textural characteristics of tilapia fillets under freeze-thaw conditions

魚片的彈性如圖1B所示。新鮮羅非魚片的彈性為（1.73±0.05）mm，隨著凍融次數(shù)的增加，彈性呈現(xiàn)出下降趨勢。-4、-18 ℃和-30 ℃凍融條件下魚片的彈性在整個過程中分別下降了24.50%、18.38%和13.87%，由此可以發(fā)現(xiàn)，在較低溫度下，魚片彈性較高，可能是較低的溫度在一定程度上保持了魚肉組織的結(jié)構(gòu)特性。彈性反映的是魚片發(fā)生形變后的恢復(fù)能力，彈性與肌肉組織中肌球蛋白、肌動蛋白和彈性蛋白等含量密切相關(guān)，由于反復(fù)凍融，肌肉中蛋白質(zhì)遭到破壞后逐漸降解，故魚片的彈性逐漸下降[14]。

2.2 凍融條件下羅非魚片電導(dǎo)率的變化

由圖2可知，新鮮羅非魚片的電導(dǎo)率為 2.134 mS/cm，電導(dǎo)率在整個凍融期間呈上升趨勢，且凍藏溫度越高的樣品電導(dǎo)率增長速率越快。Liu Χiaochang等[15]報道了虹鱒貯存過程中存在類似的電導(dǎo)率變化現(xiàn)象。電導(dǎo)率隨凍融次數(shù)增加而提高是由于凍存過程中肌肉纖維的膜滲透性增強和含水量降低，而3 組樣品電導(dǎo)率增加速率不同是由于較低的溫度對組織分解和細菌生長具有更明顯的抑制作用[16]。電導(dǎo)率作為分析肌肉組織電解質(zhì)濃度的指標(biāo)，受到細胞的體液平衡和膜結(jié)構(gòu)完整程度的影響。此外，肌肉組織的劣變和體液的流失又會反過來改變肌肉組織的結(jié)構(gòu)。因此，導(dǎo)電性與肌肉組織的結(jié)構(gòu)之間存在著密切的關(guān)系。

圖2 凍融條件下羅非魚片電導(dǎo)率的變化Fig.2 Changes in electrical conductivity of tilapia fillets under freeze-thaw conditions

2.3 凍融條件下羅非魚片總色差的變化

圖3為魚片總色差在凍融期間的變化。魚片的色澤是評價品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，根據(jù)魚肉的色澤可判斷其新鮮程度，其是影響消費者是否購買的主要因素。由圖3可知，3 個溫度下魚片的色差隨著凍融次數(shù)的增加而增加。第一次凍融結(jié)束時，-4、-18 ℃和-30 ℃組 樣品的ΔE就出現(xiàn)明顯差異，凍融4 次時，-4、-18 ℃和-30 ℃下魚片ΔE分別為9.48、7.35、6.28，說明-4 ℃的樣品凍融前后顏色變化程度大，而-18、-30 ℃樣品的顏色變化程度相近，ΔE變化相對較小。研究過程中發(fā)現(xiàn)-4 ℃的魚片在凍融中出現(xiàn)褐變，顏色變得暗淡，而其他兩組溫度能較好地維持魚片褐變的速度。其主要原因可能是肌肉組織的顏色變化主要是由肌紅蛋白的含量和不同氧化還原形式（紫紅色的脫氧肌紅蛋白、鮮紅色的氧合肌紅蛋白和褐紅色的高鐵肌紅蛋白）決定的，凍融循環(huán)產(chǎn)生的冰晶破壞了肌肉細胞結(jié)構(gòu)，加快了蛋白質(zhì)氧化作用，促使肌肉組織中的肌紅蛋白在貯藏過程中自動氧化為高鐵肌紅蛋白，導(dǎo)致魚片出現(xiàn)不同程度的褐變[17]。

圖3 凍融條件下羅非魚片ΔE的變化Fig.3 Changes in color difference (ΔE) of tilapia fillets under freeze-thaw conditions

2.4 凍融條件下羅非魚片總揮發(fā)性鹽基氮含量的變化

TVB-N含量是評價水產(chǎn)品腐敗程度的重要指標(biāo)，其越低意味著水產(chǎn)品新鮮度越高。根據(jù)GB 5009.228—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[18]， 凍羅非魚片合格標(biāo)準(zhǔn)的TVB-N限量為不高于20 mg/100 g。不同溫度下，凍融次數(shù)對魚片TVB-N含量的影響如圖4所示。新鮮羅非魚片的TVB-N含量為8.3 mg/100 g。隨著反復(fù)凍融的進行，TVB-N含量逐漸增大。在相同的凍融次數(shù)，-4 ℃凍藏樣品的TVB-N含量最高。魚片經(jīng)4 次反復(fù)凍融后，在-4、-18 ℃和 -30 ℃條件下樣品TVB-N含量分別增長至23.5、16.5、17.4 mg/100 g。其中，-4 ℃條件組TVB-N含量的上升幅度較其他組大，且4 次凍融循環(huán)后TVB-N含量高于20 mg/100 g，已為腐敗不合格品，而其他兩組樣品在凍融4 次后仍然合格。由于反復(fù)凍融會破壞肌肉的細胞結(jié)構(gòu)，細胞內(nèi)釋放出溶酶體酶、血紅素鐵和其他促氧化劑，使魚肉中含氮化合物在酶和促氧化劑的作用下發(fā)生降解，產(chǎn)生氨以及胺類等揮發(fā)性堿性含氮化合物，導(dǎo)致TVB-N含量升高[19]。樣品貯藏溫度越低，其TVB-N含量增加速率越低，說明較低的溫度能夠抑制酶和促氧化劑的活性，從而減少揮發(fā)性鹽基氮類物質(zhì)的形成。

圖4 凍融條件下羅非魚片TVB-N含量的變化Fig.4 Changes of TVB-N contents of tilapia fillets under freeze-thaw conditions

2.5 凍融條件下羅非魚片水分遷移及含量的變化

利用低場核磁共振檢測羅非魚片中的水分遷移狀態(tài)和水分含量變化。由圖5A～C可知，所有樣本都觀察到3 個峰，T2b（0.1～10 ms）代表與大分子親水基團緊密結(jié)合的結(jié)合水；T21（10～100 ms）主要對應(yīng)固定在肌纖維網(wǎng)中或厚薄肌絲間的不易流動水，是存在于肌肉中的主要水分；T22（100～1 000 ms）表示纖維束間空間中存在的自由水[20]。從新鮮魚片的水分分布可知，T22和T21所占比例較高，T2b較低。凍融4 次后，-4 ℃組樣品水分含量最低（圖5D），可能是在凍融循環(huán)過程中，在細胞內(nèi)部或外部形成的冰晶引起細胞膜的破壞，細胞膜周圍的滲漏導(dǎo)致細胞內(nèi)空間的水移動到細胞外空間，增加了融化后肌肉的滴水損失[21]。

圖5 凍融條件下羅非魚片水分遷移及含量的變化Fig.5 Changes in water mobility and content of tilapia fillets under freeze-thaw conditions

2.6 凍融條件下羅非魚片微結(jié)構(gòu)及分形維數(shù)的變化

圖6展示了羅非魚樣品在-4、-18 ℃和-30 ℃凍融條件下肌肉組織的形態(tài)變化。羅非魚肌肉的微結(jié)構(gòu)由兩部分組成：紅色部分是蘇木精-伊紅染色后的肌肉組織，白色部分是冰晶留下的孔隙[22]。新鮮魚片致密排列的肌肉組織圖像覆蓋率為72.78%，冰晶孔隙細小且圓滑。魚片在-4、-18、-30 ℃條件下經(jīng)歷4 次凍融循環(huán)后，肌肉組織的圖像覆蓋率分別下降到55.07%、61.36%、62.78%，冰晶孔隙變得不規(guī)則且尺寸增大，占據(jù)了圖像中很大部分區(qū)域，冰晶的孔隙率隨著貯藏溫度的降低而明顯減小。這種現(xiàn)象可能是由于凍融使組織脫水和退化，其中，水分遷移和冰晶不斷生成造成不規(guī)則孔隙的形成，較大尺寸的冰晶會破壞肌肉，使其軟化腐敗從而導(dǎo)致肌纖維的形態(tài)變化[23]，而較低溫度下冰晶尺寸較小，因此減小了冰晶對肌肉組織的破壞[24]。分形維數(shù)對結(jié)構(gòu)、尺寸和面積分數(shù)敏感，適用于表征羅非魚肌肉纖維的不均勻分布。因此，分形維數(shù)的變化可以反映這些孔隙的變化。

圖6 不同溫度凍融條件下羅非魚片微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig.6 Changes in microstructure of fish fillets under different freeze-thaw conditions

研究發(fā)現(xiàn)，冷凍魚肉中冰晶破壞后的多孔肌纖維結(jié)構(gòu)為無尺度結(jié)構(gòu)，不能通過普通的數(shù)學(xué)方法測量。分形維數(shù)反映了復(fù)雜形體占有空間的有效性，它是復(fù)雜形體不規(guī)則性的量度，對區(qū)分微小的結(jié)構(gòu)差異足夠敏感，因此它可以恰當(dāng)?shù)乇碚骷∪饫w維在魚肉組織中的不均勻分布[25]。在不同的冷凍溫度和凍融次數(shù)下，魚片的分形維數(shù)如圖7所示?？偟貋碚f，分形維數(shù)隨凍融次數(shù)的增加呈下降趨勢，且在低溫下樣品分形維數(shù)的下降速率較低。新鮮樣品的分形維數(shù)為1.925。凍融4 次后，-4、-18 ℃和-30 ℃樣品的分形維數(shù)分別下降到1.815、1.843和1.853。本實驗結(jié)果與He Qi等[26]報道的結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)陳皮提取物處理的冷凍羅非魚組織分形維數(shù)隨溫度的升高和貯藏時間的延長而減小。陳政等[27]發(fā)現(xiàn)分形維數(shù)越低，表明冰晶破壞后微結(jié)構(gòu)的不規(guī)則程度越高。由于大而不規(guī)則的冰晶使肌纖維物理破裂而造成微結(jié)構(gòu)的機械損傷，從而導(dǎo)致分形維數(shù)降低、蛋白質(zhì)變性和其他相關(guān)品質(zhì)參數(shù)的變化。

圖7 凍融條件下羅非魚片微結(jié)構(gòu)分形維數(shù)的變化Fig.7 Changes in microstructure fractal dimension of tilapia fillets under freeze-thaw conditions

2.7 凍融條件下羅非魚片微結(jié)構(gòu)分形維數(shù)與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析

皮爾遜相關(guān)系數(shù)被廣泛用于確定兩個變量之間的線性依賴程度[28]。圖8給出了分形維數(shù)與電導(dǎo)率、總峰面積、TVB-N含量等品質(zhì)指標(biāo)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)熱圖。分形維數(shù)與6 個品質(zhì)指標(biāo)間有較好的相關(guān)性，其中總峰面積、硬度與-4、-18 ℃組的分形維數(shù)均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01），電導(dǎo)率、TVB-N含量和ΔE與-4、-18 ℃組的分形維數(shù)呈顯著負相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明利用分形維數(shù)可以準(zhǔn)確地反映上述品質(zhì)參數(shù)的變化，分形維數(shù)可以作為定量評價凍融條件下羅非魚片品質(zhì)參數(shù)變化的可靠指標(biāo)，與熊銘[29]的研究結(jié)果一致。

圖8 凍融條件下羅非魚片剖面分形維數(shù)與品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性Fig.8 Correlation between microstructure fractal dimension and quality parameters of tilapia fillets under freeze-thaw conditions

3 結(jié) 論

本實驗分析了經(jīng)多次凍融循環(huán)后羅非魚片微結(jié)構(gòu)和品質(zhì)指標(biāo)的變化。結(jié)果表明，羅非魚肌肉組織的剖面分形維數(shù)可以用作表征樣品微結(jié)構(gòu)變化的有效方法，并且在不同溫度凍融過程中分形維數(shù)與品質(zhì)指標(biāo)（電導(dǎo)率、總峰面積以及TVB-N含量等）顯著相關(guān)，分形維數(shù)變化的幅度隨著冷凍溫度的降低而降低。因此，分形維數(shù)可用于羅非魚的品質(zhì)評價。與傳統(tǒng)方法相比，分形維數(shù)法更好地揭示了微結(jié)構(gòu)的變化，是一種新穎的品質(zhì)指標(biāo)，它將為食品保藏研究提供新的思路。