馬瑩 陳奕 吳青青

自20世紀(jì)90年代，Nicolaides等[1]首次報道超聲測量頸項透明層(nuchal translucency，NT)厚度用于孕早期胎兒染色體異常的篩查，并分析NT厚度用于識別胎兒染色體非整倍體異常的靈敏度和特異度[2]。此后，NT測量在世界范圍內(nèi)逐漸被廣泛采用，國際婦產(chǎn)超聲學(xué)會對如何測量NT和控制質(zhì)量有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，還建議有條件的醫(yī)療機構(gòu)在孕11+0～13+6周進(jìn)行孕周確定和孕早期超聲結(jié)構(gòu)篩查[3]。NT≥3.5 mm的胎兒發(fā)生非整倍體異常的風(fēng)險增加[4]，NT≥3.5 mm的胎兒中檢測到16.8%～30.2%存在非整倍體異常[5-6]。此外在科技進(jìn)步的帶動下產(chǎn)前遺傳實踐取得了非凡進(jìn)展，已知致病性拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNV)在辨別胎兒染色體亞顯微結(jié)構(gòu)異常方面具有重要作用。很多文獻(xiàn)將NT≥3.5 mm作為胎兒進(jìn)行染色體CNV檢測的納入指標(biāo)[5-8]，薈萃分析顯示NT≥3.5 mm且核型正常的病例經(jīng)基因組微陣列技術(shù)檢測有5.0%的胎兒存在CNV[7]。但是相對于NT≥3.5 mm，NT厚度在2.5～3.4 mm的胎兒染色體情況尤其是CNV的報道很少，因此有必要對此類胎兒的染色體情況進(jìn)行探討。本院作為區(qū)域性產(chǎn)前診斷中心，2013年以來對NT厚度位于2.5～3.4 mm的胎兒采用單獨核型分析或核型分析聯(lián)合分子遺傳學(xué)技術(shù)檢測胎兒染色體情況，本文對上述兩種技術(shù)檢測出的胎兒染色體核型和致病性CNV的情況進(jìn)行分析，以供臨床參考。

對象與方法

1. 研究對象：選取2013年1月至2018年6月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院孕11+0～13+6周超聲檢查，標(biāo)準(zhǔn)切面測量胎兒頂臀長(CRL)在45～84 mm，NT為 2.5～3.4 mm并同意行介入性產(chǎn)前診斷的孕婦入組，記錄孕婦的年齡、胎兒NT厚度、胎兒超聲結(jié)果以及穿刺方法和染色體檢查結(jié)果。

2. 超聲方法：NT測量基于胎兒醫(yī)學(xué)基金會(The Fetal Medicine Foundation，F(xiàn)MF)推薦的方案[9]。所有病例的NT超聲測量均由經(jīng)過培訓(xùn)的超聲科醫(yī)師完成，并對入組病例中繼續(xù)妊娠者進(jìn)行中孕期胎兒超聲結(jié)構(gòu)篩查。

3. 產(chǎn)前診斷方法：根據(jù)孕周知情同意后選擇如下方法(1)孕11～14周經(jīng)腹絨毛活檢；(2)孕18～24周行羊膜腔穿刺；(3)超過孕24周選擇臍靜脈穿刺。所有孕婦均簽署介入性操作知情同意書。

4. 染色體檢測方法：孕婦知情了解后選擇下面兩種檢測方法，單獨或聯(lián)合檢測，每種方法均簽署知情同意書。(1)染色體核型分析。顯帶水平為320條帶。根據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN1995、ISCN2009)至少計數(shù)20個細(xì)胞，記錄任何觀察到的染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。對疑有染色體嵌合的樣本，至少計數(shù)50個細(xì)胞。(2) 低覆蓋度全基因組測序(Low Pass Whole Genome Sequencing，Low Pass WGS) 結(jié)合短串聯(lián)重復(fù)序列(Short Tandem Repeats，STR)檢測，由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行，檢測的分辨率為100 Kb。實驗操作主要分為三步①樣本基因組DNA提取；②文庫構(gòu)建；③上機測序。

5. CNV的分類：通過以下網(wǎng)址分析分析CNV的情況：http://omim.org/；http://genome.ucsc.edu/；http://ncbi.nlm.nih.gov/pubmed； http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home；https://decipher.sanger.ac.uk/。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實驗室和美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(American college of medical genetics and genomics，ACMG )制定和解釋的標(biāo)準(zhǔn)[10-11]，檢測結(jié)果將CNV分類為：致病性、可疑致病性、意義不明確性、可疑良性和良性。本研究將致病性和可疑致病性定義為致病性，將可疑良性和良性定義為良性。

6. 統(tǒng)計分析方法：使用PASW Statistics 22.0軟件，不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)M(P25，P75)來表示。組間的各因素的樣本率、構(gòu)成比用χ2檢驗或Fisher′s精確概率(雙尾)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。分別按胎兒是否存在結(jié)構(gòu)異常、NT厚度為2.5～2.9 mm、3.0～3.4 mm和孕婦是否高齡進(jìn)行分組，分層比較不同組發(fā)生染色體異常的差異。

結(jié)果

1. 一般情況：因NT ≥2.5mm指征行介入性產(chǎn)前診斷的孕婦共977例，其中NT厚度為2.5～3.4 mm的孕婦488例(48.2%)入組。孕婦年齡19歲～47歲，年齡中位數(shù)30(28，33)歲，NT中位數(shù)3.0(2.8，3.2)mm。單胎475例，雙胎13例，其中10例一胎NT厚度<2.5 mm，另一胎NT為2.5～3.4 mm，僅對NT厚度為2.5～3.4 mm的胎兒行產(chǎn)前診斷，3例雙胎的兩胎兒NT厚度均為2.5～3.4 mm，分別對兩胎兒分別行產(chǎn)前診斷，共入組491例胎兒。

2. 檢測結(jié)果：核型分析381例，Low Pass WGS檢測239例，其中兩者聯(lián)合129例，單純行核型分析252例，單純行Low Pass WGS檢測110例。

(1)檢測結(jié)果概況。所有病例中，檢測出非整倍體異常48例，占9.8%(48/491)，包括21三體34例，18三體10例，13三體3例，15三體1例。另外還發(fā)現(xiàn)嵌合體2例和染色體多態(tài)性變異(均9號染色體臂間倒位)2例。

Low Pass WGS檢測239例中，檢測出CNV 35例，包括良性18例，意義不明確性12例，致病性CNV 5例(見表1)，致病性CNV的檢出率為2.1%(5/239)。除外意義不明確性及良性CNV，491例胎兒中染色體異常總的檢出率為11.6%(57/491)。

(2)合并結(jié)構(gòu)異常的檢測結(jié)果。26例胎兒超聲提示有結(jié)構(gòu)異常表現(xiàn)，21例行Low Pass WGS檢測(其中8例同時進(jìn)行核型分析)，5例僅行核型分析，12例(46.2%)胎兒染色體異常，包括非整倍體異常10例(38.5%)，21三體7例，18三體2例，13三體1例；致病性CNV 2例，占9.5%(2/21)。見表2。

表2 NT 2.5～3.5mm合并結(jié)構(gòu)異常的病例

(3)無結(jié)構(gòu)異常的檢測結(jié)果。單純NT厚度為2.5～3.4 mm的胎兒465例,45例(9.7%)胎兒染色體異常，包括非整倍體異常38例(8.2%)，染色體多態(tài)性變異2例，1例為46XN，inv(9)(p12q13)，另1例為46XN，inv(9)(p12q21)mat，均無異常臨床表型。嵌合體2例，1例為48,XN,+3,+7[35%]/46,XN[65%]，另1例為47XYY[17%]/46XY[83%]。218例胎兒行Low Pass WGS檢測，3例(1.4%)檢測出致病性CNV。

(4)有無合并結(jié)構(gòu)異常的檢測結(jié)果比較。合并結(jié)構(gòu)異常的胎兒染色體異常和非整倍體異常的檢出率均顯著地高于不合并結(jié)構(gòu)異常的胎兒(P均<0.001)；兩者在致病性CNV的檢出率方面，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

3. NT厚度與胎兒染色體異常的關(guān)系：按NT 2.5～2.9 mm、3.0～3.4 mm分兩組進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。NT 2.5～2.9 mm組有195例胎兒，其中15例(7.7%)染色體異常；NT3.0～3.4 mm 有296例，其中42例(14.2%)染色體異常，兩組胎兒合并結(jié)構(gòu)異常的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，NT 3.0～3.4 mm組比NT 2.5～2.9 mm組的胎兒總?cè)旧w異常率和非整倍體異常率均高(P均<0.05)。全部5例致病性CNV病例都發(fā)生在NT 3.0～3.4 mm組，但兩組致病性CNV的檢出率比較無統(tǒng)計學(xué)差異。

4. 高齡與胎兒染色體異常的關(guān)系：按孕婦預(yù)產(chǎn)期年齡<35歲及≥35歲分兩組進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。每組例數(shù)及胎兒染色體異常例數(shù)分別為孕婦年齡<35歲有410例胎兒，其中38例(9.3%)染色體異常；孕婦≥35歲組有81例，其中19例(23.5%)染色體異常，孕婦≥35歲組總的染色體異常率和非整倍體異常率均明顯增高(P均<0.001)，并且高齡孕婦的胎兒出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常更多見(P=0.025)，全部5例致病性CNV病例都發(fā)生在年齡<35歲組，但兩組致病性CNV的檢出率比較無統(tǒng)計學(xué)差異。

表3 不同組別檢測結(jié)果比較[例數(shù)(%)]

討論

隨著超聲儀器分辨率的不斷提高及超聲工作者的不斷探索，孕早期超聲檢查越來越普及，可對早期胎兒結(jié)構(gòu)進(jìn)行評估，已知NT增厚是預(yù)測胎兒染色體異常和多種胎兒畸形的超聲軟標(biāo)記[12]。研究提示隨NT增加胎兒染色體異常的發(fā)生率逐漸升高[13-14]。2016年ACOG發(fā)布了163號指南[15]指出隨NT值增厚胎兒非整倍體異常風(fēng)險增加，NT≥3.0mm或大于相應(yīng)胎兒頭臀長的99%百分位數(shù)視為NT增厚，建議無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(noninvasive prenatal testing，NIPT)或絨毛活檢。

本資料證實合并結(jié)構(gòu)異常的胎兒染色體異常和非整倍體異常的檢出率均明顯高于不合并結(jié)構(gòu)異常的胎兒(P<0.05)。文獻(xiàn)也報道合并結(jié)構(gòu)異常的胎兒核型分析異常率較單純NT≥2.5 mm組明顯升高[14]。薈萃分析發(fā)現(xiàn)核型正常的單純NT≥3.5 mm的胎兒經(jīng)染色體微陣列(chromosomal microarray analysis，CMA)檢測后染色體異常檢出率為4.0%，當(dāng)合并其他結(jié)構(gòu)畸形時，染色體異常的檢出率增加到7.0%[7]。Leung等報道[8]在NT≥3.5 mm合并結(jié)構(gòu)異常的病例致病性CNV的檢出率為20.0%，而不合并結(jié)構(gòu)異常的病例中僅為5.3%。NT≥3mm且核型正常的胎兒中9.1%存在CNV，超聲提示結(jié)構(gòu)異常的胎兒存在CNV的情況顯著高于無結(jié)構(gòu)異常的胎兒[16]。本資料結(jié)果合并結(jié)構(gòu)異常的胎兒中9.5%存在致病性CNV，而在單純NT 2.5～3.4 mm病例中僅有1.4%的胎兒存在致病性CNV，與文獻(xiàn)報道基本一致[7-8,16]。說明當(dāng)NT 2.5mm以上合并結(jié)構(gòu)異常時應(yīng)考慮胎兒存在非整倍體異常和致病性CNV的可能，建議行分子遺傳學(xué)檢測。

文獻(xiàn)報道NT≥3.5 mm的胎兒中2.7%～8.3%存在致病性CNV，1.8%～2.5%通過核型分析檢測不出來[5-6,8]。單純NT≤2.9mm、NT3.0～3.4mm及NT≥3.5mm的三組胎兒，CMA檢出的染色體異常率分別為1.7%、 6.5%和13.8%，檢出核型不能發(fā)現(xiàn)的致病性CNV分別為0.9%、1.8%和2.2%[13]。在NT≥3.0 mm且核型正常的胎兒中，發(fā)現(xiàn)1.2%～4.3%存在致病性CNV[14,17]。本資料NT 2.5～3.4 mm的胎兒中2.1%檢測出致病性CNV，但是本資料致病性CNV都發(fā)生在NT 3.0～3.4 mm胎兒中，NT 2.5～2.9 mm病例中未發(fā)現(xiàn)致病性CNV，也有同樣報道在NT 2.5～2.9 mm核型正常的胎兒中未能檢出致病性CNV[14]，分析原因為該NT范圍核型正常的胎兒中致病性CNV發(fā)生率很低，不易檢測到，進(jìn)行分子遺傳學(xué)檢測前應(yīng)權(quán)衡利弊。

本研究統(tǒng)計高齡孕婦組胎兒染色體異常率達(dá)23.5%，染色體異常和非整倍體異常的發(fā)生率均較非高齡孕婦組增高(P<0.05)，文獻(xiàn)也報道高齡孕婦且NT2.5～2.9 mm胎兒合并染色體核型異常的風(fēng)險增高[14]。雖然由于NIPT的廣泛開展和較高的篩查準(zhǔn)確率，不少NT2.5～2.9 mm的高齡患者傾向于選擇NIPT，但是基于本研究，當(dāng)孕婦高齡且NT2.5～2.9 mm時建議侵入性產(chǎn)前診斷為宜。另外本研究高齡孕婦組中未檢測到致病性CNV，文獻(xiàn)也報道高齡孕婦且NT2.5～2.9 mm胎兒未能檢出致病性CNV[14]，考慮孕婦是否高齡可能并不增加胎兒致病性CNV的發(fā)生率。

本資料中，致病性CNV中3例CNV片段<10 Mb，核型結(jié)果正常。還有2例致病性CNV結(jié)果是染色體部分缺失和染色體部分重復(fù)，胎兒為缺失-重復(fù)患者，核型結(jié)果也是正常(見表1，病例1和病例4)，分析原因考慮染色體缺失或重復(fù)片段雖然>10 Mb，但是重復(fù)的片段易位到了缺失的染色體上，片段大小接近且條帶類似，因此核型分析難以辨別，容易漏診此類患兒。

另外，Low Pass WGS無法檢測出染色體平衡性重排，本資料核型分析檢測出2例胎兒9號染色體臂間倒位，考慮為染色體多態(tài)性變異，1例inv(9)(p12q21)mat同時行Low Pass WGS檢測未提示異常CNV。核型分析和Low Pass WGS兩者聯(lián)合檢測可以較全面評估染色體結(jié)構(gòu)變異的情況，如果有條件產(chǎn)前診斷時建議采用兩種檢測方法。有報道NT增厚胎兒中檢測出9號染色體臂間倒位和9號與11號染色體片段平衡易位各1例[14]，結(jié)合本資料結(jié)果考慮與9號染色體臂間倒位在人群中的發(fā)生率相對較高有關(guān)。另外，雖然胎兒檢測結(jié)果為染色體多態(tài)性變異，無異常臨床表型，但其后代容易發(fā)生染色體部分片段缺失和重復(fù)，導(dǎo)致生殖異常，遺傳咨詢時要注意。

總之，NT 2.5～3.4 mm的胎兒中有2.1%存在致病性CNV，合并結(jié)構(gòu)異常組、NT 3.0～3.4 mm組和高齡孕婦組胎兒出現(xiàn)染色體非整倍體異常的概率更高。