紀(jì)佳妹 郭萍 王學(xué)成 吳奕章 楊穩(wěn) 周秀娟 楊兵

研究發(fā)現(xiàn),一半以上的致心律失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy,ARVC)病例是由橋?；蛲蛔儗?dǎo)致,因此ARVC被認(rèn)為是一種“橋粒病”[1]。橋粒是由三個(gè)超基因家族成員的五種蛋白,即斑珠蛋白(PG),橋粒斑菲素蛋白2(PKP2),橋粒芯糖蛋白2(DGS2),橋粒斑蛋白(DSP),橋粒膠蛋白(DSC)相互鉚合形成橋粒連接,以保證心肌細(xì)胞間機(jī)械連接,抵抗機(jī)械壓力和牽張,同時(shí)具有信號(hào)傳導(dǎo)和參與細(xì)胞凋亡等作用[2]。2006年有研究首次發(fā)現(xiàn)DSG2 基因突變與ARVC 發(fā)病相關(guān)[3]。近些年關(guān)于DSG2的轉(zhuǎn)基因或基因敲除動(dòng)物模型等研究也進(jìn)一步證實(shí)DSG2基因突變可以導(dǎo)致ARVC的發(fā)生[4]。

本中心前期在一個(gè)較大的ARVC家系(共5代32個(gè)成員)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的、高度保守的DSG2基因突變位點(diǎn)F531C[5]。我們課題組前期構(gòu)建了DSG2F536C點(diǎn)突變敲入小鼠模型,表達(dá)出包括心功能下降和心肌纖維化等符合ARVC 病理生理改變的表型[6]。室性心律失常作為ARVC的重要臨床表現(xiàn)之一,其形成機(jī)制研究相對(duì)較少。筆者研究DSG2F536C點(diǎn)突變基因敲入小鼠心外膜標(biāo)測(cè)電壓與心肌纖維化之間的關(guān)系,探索心外膜電壓變化與心肌纖維化的潛在關(guān)聯(lián),為ARVC室性心律失常的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 構(gòu)建DSG2F536C小鼠模型 根據(jù)課題組前期研究提供的患者DSG2-F531C 突變,通過(guò)小鼠染色體定位,由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所采用基因敲入技術(shù),通過(guò)同源重組構(gòu)建引入DSG2-F536C 點(diǎn)突變(人染色體DSG2-F531C 點(diǎn)突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)小鼠染色體的DSG2-F536C 點(diǎn)突變位點(diǎn))至胚胎干細(xì)胞(ES);篩選出陽(yáng)性ES細(xì)胞克隆行囊胚注射,通過(guò)毛色篩選嵌合率大于50%的雄性嵌合小鼠。雄性嵌合小鼠與C57BL/6J雌鼠進(jìn)行交配,獲得純C57BL/6J 背景的DSG2F536C雜合小鼠(Het),最后以DSG2F536雜合雌雄小鼠自交,獲得野生型(WT)和純合子(Hom),從而成功構(gòu)建了DSG2F536C小鼠模型。實(shí)驗(yàn)分為三組:野生型組(WT)、雜合子突變組(Het)和純合子突變組(Hom),每組各6只10周齡小鼠。所有實(shí)驗(yàn)均通過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查(編碼:IACUC-14030160)。

1.2 小鼠心外膜標(biāo)測(cè) 各組小鼠稱(chēng)重后將戊巴比妥鈉75 mg/kg腹腔內(nèi)注入進(jìn)行麻醉。麻醉后的小鼠行氣管內(nèi)插管,接入小動(dòng)物呼吸機(jī),給予人工通氣。沿胸骨左緣第二肋間處剪開(kāi)皮膚,撐開(kāi)器撐開(kāi)胸廓,充分暴露心臟,移除心包,以兩片標(biāo)測(cè)電極(自制)分別緊貼在心臟左、右室表面,接入信號(hào)采集系統(tǒng)(Powerlab多導(dǎo)生理記錄儀系統(tǒng)),記錄心外膜標(biāo)測(cè)電壓,選取連續(xù)3個(gè)基線平穩(wěn)的心電波形,用Matlab分析系統(tǒng)(Mathworks公司,美國(guó)),分析每個(gè)電極片的32個(gè)電壓數(shù)值,取32個(gè)電壓中最高者,計(jì)算3個(gè)心電波最高電壓的平均值為該參數(shù)測(cè)量值。

1.3 心室纖維化檢測(cè) 10周齡的小鼠斷頸處死后分離心臟擠出殘余血液,4%多聚甲醛固定過(guò)夜,常規(guī)取材,脫水,石蠟包埋,石蠟切片5μm;石蠟切片脫蠟復(fù)水;Weigert蘇木精液染核5～10 min;充分水洗;猩紅液染1 min;蒸餾水洗;磷鉬酸磷鎢酸水溶液分化10 min,直到膠原不再呈紅色;不經(jīng)水洗,直接用苯胺藍(lán)染5 min;蒸餾水洗;55℃烘片、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0分別測(cè)量左、右室膠原纖維染色面積占鏡下視野總面積的比例,膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF)等于膠原面積/視野總面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS-20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)于三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間采用單因素方差分析。圖形繪制使用Graphpad Prism 5.0 軟 件 完 成。以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 三組心外膜電壓標(biāo)測(cè)的比較 Hom 組右室單極電壓最高值較WT 組、Het組小鼠顯著降低,右室雙極電壓最高值較WT 組顯著降低。三組的左室單極和雙極電壓最高值無(wú)差異(表1,圖1)。與WT 組和Het組相比,Hom 組右室的CVF 明顯增加,三組左室CVF均無(wú)差異(表1)。

圖1 三組心室單極和雙極電壓心外膜標(biāo)測(cè)圖

表1 三組心外膜標(biāo)測(cè)心室單極和雙極電壓最高值數(shù)據(jù)與心室膠原容積分?jǐn)?shù)

2.2 三組心室纖維化比較 WT 組小鼠左、右室心肌結(jié)構(gòu)清晰,排列有序,心肌細(xì)胞間隙未見(jiàn)膠原纖維沉積。Het組僅出現(xiàn)左、右室心肌細(xì)胞排列稍紊亂,心肌細(xì)胞間隙未見(jiàn)膠原纖維沉積。Hom 組小鼠右室心肌排列紊亂,正常心肌組織被大量膠原纖維取代(圖2)。

圖2 三組的Masson染色

3 討論

目前ARVC的消融治療中,針對(duì)心外膜低電壓區(qū)的片狀消融是一重要方向。通過(guò)標(biāo)測(cè)心臟表面電壓,判斷心肌瘢痕區(qū)域,從而進(jìn)行消融[7]。臨床上心室雙極電壓＜0.5 m V 的區(qū)域標(biāo)記為瘢痕區(qū),＞1.5 m V 的為正常心肌,0.5～1.5 m V 為病變移行區(qū)[8]。通過(guò)在體心外膜標(biāo)測(cè)方法,單極電壓反映的是整個(gè)心室的電活動(dòng);而常規(guī)的雙極電壓反映的是局部的電活動(dòng),排除了遠(yuǎn)離電極部位電活動(dòng)的影響[9]。所以兩者可以相互補(bǔ)充,提供心肌局部電位和遠(yuǎn)場(chǎng)電位的信息,從而提高電生理標(biāo)測(cè)的準(zhǔn)確性。本研究中,Hom 組小鼠右室心外膜單極和雙極電壓比野生型小鼠顯著降低,提示純合模型小鼠右室瘢痕的存在是形成折返環(huán)、引起快速性心律失常的基礎(chǔ)。而Hom 組小鼠左室單極和雙極電壓與野生型相比也出現(xiàn)了降低,但未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可能與ARVC累積左、右室的進(jìn)程差異相關(guān)。

為了研究DSG2所致ARVC的致病機(jī)制,近些年來(lái)有不同的疾病模型得以建立。在高表達(dá)型DSG2N271S突變的轉(zhuǎn)基因小鼠中,大于5周齡的小鼠均出現(xiàn)心室的纖維化取代正常心肌組織[10]。其他研究也構(gòu)建了DSG2蛋白EC1-2的基因敲除小鼠,12周齡后所有小鼠均出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的纖維瘢痕改變,而雜合子小鼠無(wú)上述病理表型[11]。本研究中Hom 組小鼠出現(xiàn)以右室為主的心室纖維化,而Het組小鼠未出現(xiàn)類(lèi)似的病理改變,僅出現(xiàn)右室心肌細(xì)胞排列紊亂,而隨著小鼠周齡的增加,Het小鼠是否會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似于Hom 組小鼠的病理表型,還需進(jìn)一步觀察更大周齡的小鼠的病理表型特征。

在本研究中,DSG2F536C點(diǎn)突變基因敲入純合子小鼠在10周齡時(shí)右室心外膜單、雙極電壓均明顯降低,心肌纖維化程度顯著。左室纖維化不明顯,相應(yīng)電壓標(biāo)測(cè)也未測(cè)得顯著差異,提示心外膜電壓變化與心肌纖維化存在潛在關(guān)聯(lián)。