顏 楠，韓 峰，劉家云

空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710032

D-二聚體(D-D)是交聯(lián)纖維蛋白在纖溶酶的作用下形成的一種特異性降解產(chǎn)物[1]。在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程的后期，纖維蛋白原在凝血酶的作用下形成纖維蛋白單體(FM),它們彼此以氫鍵發(fā)生聚合形成纖維蛋白單體聚合物(SFM)。 SFM在FXⅢa和鈣離子作用下，最后形成交聯(lián)纖維蛋白凝塊[2]。在纖溶酶的作用下，除了生成X′、Y′、D、E′碎片外，還生成D-D及不同相對(duì)分子質(zhì)量的D-D片段復(fù)合物，這些產(chǎn)物統(tǒng)稱(chēng)為纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)[3]。D-D檢測(cè)盡管其診斷特異度不高，但靈敏度高，陰性預(yù)測(cè)值高，使其在活動(dòng)性深靜脈血栓形成和肺栓塞(PE)的排除診斷、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的診斷、原發(fā)與繼發(fā)性纖溶的鑒別診斷、溶栓治療檢測(cè)等方面都具有重要價(jià)值[4]。目前，D-D 檢測(cè)方法多樣，包括半定量膠乳凝集法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法、基于膠乳凝集的免疫比濁法等[5]。因膠乳凝集的免疫比濁法可以定量，靈敏度高、試劑穩(wěn)定、價(jià)格適中、檢測(cè)快速，目前應(yīng)用最廣泛[6]。

Sysmex CS5100在全國(guó)大中型醫(yī)院已被廣泛使用，檢測(cè)D-D的方法多為免疫比濁法[7]，其原理均是基于抗原抗體按一定分子比例結(jié)合的反應(yīng)。當(dāng)D-D水平顯著升高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)而造成假陰性結(jié)果。因此，及時(shí)對(duì)水平過(guò)高的標(biāo)本進(jìn)行稀釋處理才能確保高水平D-D臨床標(biāo)本檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

因FDP為纖維蛋白原與交聯(lián)纖維蛋白降解產(chǎn)物的總稱(chēng)，而D-D僅為交聯(lián)纖維蛋白的降解產(chǎn)物，所以在理論上FDP水平應(yīng)大于D-D水平，但近些年D-D假性增高現(xiàn)象越來(lái)越多，使FDP與D-D水平出現(xiàn)倒置現(xiàn)象。因同一種D-D檢測(cè)系統(tǒng)與試劑盒有時(shí)也存在一定的方法學(xué)局限性，易受各種干擾因素的影響，給臨床診斷造成誤判，給臨床醫(yī)生與檢驗(yàn)人員帶來(lái)極大的困擾。雖然本實(shí)驗(yàn)室使用的試劑中加入了異嗜性抗體(HA)的封閉試劑，但也不可保證將干擾完全排除。作為實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員，當(dāng)遇到FDP與D-D結(jié)果倒置的情況時(shí)，要及時(shí)對(duì)結(jié)果做出正確的分析與判斷，并通過(guò)稀釋等辦法及時(shí)進(jìn)行糾正，使D-D檢測(cè)能夠得到一個(gè)相對(duì)準(zhǔn)確的結(jié)果。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2019年4月至2020年10月門(mén)診與住院患者，分為D-D假陽(yáng)性組和D-D假陰性組，D-D假陰性組收集D-D≤5 mg/L,FDP≤20 μg/mL范圍內(nèi)的結(jié)果50例，男26例，女24例，年齡25～57歲，平均(42.24±14.08)歲；D-D>5～10 mg/L,FDP>20 μg/mL范圍內(nèi)的結(jié)果50例，男29例，女21例，年齡33～63歲，平均(45.44±10.08)歲；D-D>10 mg/L,FDP>20 μg/mL范圍內(nèi)的結(jié)果50例，男27例，女23例;年齡42～71歲，平均(54.24±12.21)歲。D-D假陽(yáng)性組收集D-D與FDP結(jié)果倒置的患者35例，男11例，女24例，年齡25～60歲，平均(44.49±10.67)歲。所有患者均排除溶血、黃疸、脂血與高水平類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)等影響的標(biāo)本[8-9]。

1.2儀器與試劑 儀器為日本Sysmex公司生產(chǎn)的Sysmex CS5100全自動(dòng)凝血分析儀。D-D檢測(cè)試劑盒與質(zhì)控品均為德國(guó)Siemens公司生產(chǎn)。FDP檢測(cè)試劑盒與其質(zhì)控品為日本積水醫(yī)療株式會(huì)社生產(chǎn)。

1.3方法 D-D假陰性組：清晨空腹抽取1∶9枸櫞酸鈉抗凝血。1 500×g離心15 min后分離血漿，采用日本Sysmex公司生產(chǎn)的Sysmex CS5100全自動(dòng)凝血分析儀及相應(yīng)的配套試劑進(jìn)行檢測(cè)。選取本院2019年4月至2020年10月門(mén)診與住院病例，分別收集D-D≤5 mg/L,FDP≤20 μg/mL范圍內(nèi)的結(jié)果50例；D-D>5～10 mg/L,FDP>20 μg/mL范圍內(nèi)的結(jié)果50例；D-D>10 mg/L,FDP>20 μg/mL范圍內(nèi)的結(jié)果50例。將3種范圍的D-D結(jié)果分別進(jìn)行各梯度稀釋檢測(cè)并計(jì)算回收率。

D-D假陽(yáng)性組：清晨空腹抽取1∶9枸櫞酸鈉抗凝血。1 500×g離心15 min后分離血漿，采用日本Sysmex公司生產(chǎn)的Sysmex CS5100全自動(dòng)凝血分析儀及相應(yīng)的配套試劑進(jìn)行測(cè)定。選取本院2019年4月至2020年10月門(mén)診與住院患者，收集D-D與FDP結(jié)果倒置的患者35例，將D-D與FDP結(jié)果分別進(jìn)行各梯度稀釋檢測(cè)并計(jì)算回收率。

2 結(jié) 果

2.1假陰性組 將收集好的范圍在D-D≤5 mg/L,FDP≤20 μg/mL的標(biāo)本(共50例)經(jīng)儀器固定稀釋模式(1/8、1/16)分別做D-D稀釋檢測(cè)，然后將D-D稀釋后的結(jié)果分別與原倍結(jié)果進(jìn)行比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且計(jì)算回收率均在(100±10)%范圍內(nèi)。將收集好的范圍在D-D>5 mg/L,FDP>20 μg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)本(共100例)經(jīng)儀器固定稀釋模式(1/8、1/16)分別做D-D稀釋檢測(cè)，然后將D-D稀釋后的結(jié)果與原倍結(jié)果進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且計(jì)算回收率均不在(100±10)%范圍內(nèi)。見(jiàn)表1。

表1 3種收集范圍的D-D原倍與稀釋后的結(jié)果比較

2.2假陽(yáng)性組 將收集好的D-D與FDP結(jié)果倒置的患者35例，經(jīng)儀器固定稀釋模式(1/8、1/16)分別對(duì)D-D與FDP結(jié)果做稀釋檢測(cè)，然后將其稀釋后的結(jié)果分別與原倍結(jié)果進(jìn)行比較，其中 D-D原倍結(jié)果與各梯度稀釋后結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且回收率均不在(100±10)%范圍內(nèi)。FDP原倍結(jié)果與各梯度稀釋后結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且回收率均在(100±10)%范圍內(nèi)。見(jiàn)表2。

表2 D-D、FDP原倍與稀釋后的結(jié)果比較

3 討 論

免疫比濁法檢測(cè)D-D的原理是當(dāng)試劑與含有D-D片段復(fù)合物的標(biāo)本混合時(shí)，用單克隆抗體共價(jià)包被的聚乙烯顆粒凝集；D-D交聯(lián)的區(qū)域具有立體對(duì)稱(chēng)的結(jié)構(gòu)，即單克隆抗體作用的抗原表位出現(xiàn)2次。因一個(gè)抗體有足夠能力觸發(fā)凝集反應(yīng)，濁度的升高可以用比濁法檢測(cè)，用吸光度表示。與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，最后轉(zhuǎn)換成待檢物質(zhì)的水平。由于D-D是交聯(lián)纖維蛋白降解的最小產(chǎn)物，不同廠家試劑檢測(cè)的是不同相對(duì)分子質(zhì)量的D-D片段的復(fù)合物而不是大家通常認(rèn)為的D-D最小片段。因此，不同廠家試劑很難做到檢測(cè)結(jié)果的一致性。每個(gè)商品化的D-D分析體系都有自己獨(dú)立的用于靜脈血栓排除性診斷的醫(yī)學(xué)決定水平,目前尚無(wú)通用的標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)物[10]。

本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)D-D的方法為免疫比濁法，免疫比濁法的原理是基于抗原抗體的反應(yīng)。而抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)中的比例性是指抗原與抗體只有在比例合適的范圍結(jié)合才是最充分的，此時(shí)形成的復(fù)合物快且多，稱(chēng)為“等價(jià)帶”。如果抗體或抗原過(guò)量，形成的沉淀物少，上清液中可測(cè)出游離的抗體或抗原，這種現(xiàn)象稱(chēng)為“帶現(xiàn)象”[11]。經(jīng)本文驗(yàn)證，當(dāng)在D-D>5 mg/L,同時(shí)FDP>20 μg/mL的情況下FDP水平越高，患者血漿中的含D-D片段復(fù)合物也就越多，即D-D存在“抗原過(guò)量”現(xiàn)象。此時(shí)檢測(cè)得到的結(jié)果并不是真實(shí)的D-D水平。及時(shí)對(duì)“抗原過(guò)量”的標(biāo)本進(jìn)行稀釋處理才能確保高水平D-D臨床標(biāo)本測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于稀釋倍數(shù)越大，結(jié)果準(zhǔn)確性越低，建議選擇較小的稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

在檢測(cè)中當(dāng)遇到D-D與FDP結(jié)果不匹配的現(xiàn)象時(shí)，這是由于各個(gè)科室的患者存在個(gè)體差異，各個(gè)檢測(cè)試劑盒與各個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)局限性等因素共同導(dǎo)致的。在免疫法測(cè)定中，影響結(jié)果的干擾因素較多[12]，這些干擾因素是一些與被檢物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同但活性相似的物質(zhì)，如HA[13]、RF[14]、自身抗體、和其他蛋白等[15]。其中HA是通過(guò)已知或未知抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的一類(lèi)高滴度、能與多個(gè)物種的免疫球蛋白發(fā)生相對(duì)較弱結(jié)合的多重特異性免疫球蛋白[16-17]，人抗動(dòng)物抗體的產(chǎn)生通常有已知的動(dòng)物免疫球蛋白治療史或接觸史，而HA通常包含天然抗體和因接觸未知的動(dòng)物蛋白而產(chǎn)生的自身抗體，目前所使用的免疫試劑抗體大多源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,體內(nèi)含HA的患者在做免疫檢測(cè)，HA通常與試劑抗體的Fc區(qū)表位或V(a b′) 2區(qū)域的決定簇結(jié)合從而對(duì)結(jié)果造成干擾。而RF是一類(lèi)以自身變性IgG為靶細(xì)胞的抗體，是一種經(jīng)典的人免疫球蛋白，可以分為 IgM、IgA、IgG及IgE 4類(lèi)。RF可與IgG Fc片段結(jié)合，與抗體發(fā)生聚集作用是RF干擾機(jī)制之一[18]。RF能橋聯(lián)捕獲抗體和檢測(cè)抗體從而引起干擾，能結(jié)合IgG分子Fc片段的抗原決定簇，使IgG致敏膠乳顆粒出現(xiàn)非特異性凝集反應(yīng)。針對(duì)這些干擾因素雖然可以通過(guò)稀釋法、使用異嗜性抗體阻滯劑、阻斷試劑盒等方法來(lái)消除一定的干擾[19]，但是由于標(biāo)本中干擾物質(zhì)的來(lái)源是未知的，不能夠準(zhǔn)確地針對(duì)其結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行操作，所以目前尚未有一個(gè)完全消除干擾的方法。如果標(biāo)本中干擾物質(zhì)的水平不是很高，且它所造成的干擾不是很大時(shí)，稀釋法是一種簡(jiǎn)單易行減少干擾的方法，但可能不能完全消除。經(jīng)本研究驗(yàn)證，對(duì)FDP與D-D出現(xiàn)倒置的標(biāo)本進(jìn)行稀釋后，確實(shí)降低了干擾物質(zhì)的水平，原有的干擾強(qiáng)度可明顯減小。當(dāng)遇到此種情況時(shí)可以通過(guò)將D-D與FDP結(jié)果同時(shí)稀釋的方法來(lái)解決倒置的問(wèn)題。但如果個(gè)別標(biāo)本通過(guò)此方法仍然無(wú)法解決，要積極了解患者的相關(guān)病史，看患者是否患有免疫相關(guān)的疾病與有無(wú)用藥等情況，有條件的實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)其他可以排除干擾的辦法來(lái)解決。如果暫時(shí)未能找到原因，發(fā)出報(bào)告時(shí)要做好備注并與臨床醫(yī)生進(jìn)行詳細(xì)的溝通，為其講解本實(shí)驗(yàn)方法學(xué)存在局限性的可能，請(qǐng)其結(jié)合患者的病史、臨床表現(xiàn)與其他檢查結(jié)果一起綜合分析。

在檢測(cè)D-D時(shí)一定要聯(lián)合檢測(cè)FDP，否則將無(wú)法對(duì)D-D的檢測(cè)結(jié)果是否存在假陰性或假陽(yáng)性做出正確判斷。D-D不是一個(gè)完全獨(dú)立的指標(biāo)，單靠這一個(gè)指標(biāo)不能完整地診斷患者病癥，需要結(jié)合病史、其他檢查才能對(duì)患者做出一個(gè)全面、綜合的評(píng)估。檢驗(yàn)工作者需要加強(qiáng)與臨床醫(yī)生的溝通，對(duì)標(biāo)本結(jié)果做出合理的解釋?zhuān)材軒椭R床給出合理的診療方案。保證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性只是日常工作中的一部分，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室與臨床的共同合作，互相溝通，可以及早對(duì)患者進(jìn)行診斷與治療，減少患者痛苦，讓患者花最短的時(shí)間、最少的費(fèi)用得到最好的診治，才能實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室與臨床工作的真正價(jià)值。