李 磊,孔倩倩,鈕 威，王 麗，牛璐璐,余漢忠△

1.江蘇省徐州市第三人民醫(yī)院檢驗科,江蘇徐州 221000；2.中國礦業(yè)大學(xué)/江蘇省徐州市第一人民醫(yī)院檢驗科,江蘇徐州 221009

高血壓是引起各種心腦血管意外的最主要危險因素[1]。現(xiàn)階段我國迫切需要改善人們對高血壓的認(rèn)知，提升全民對高血壓的防治意識[2]。應(yīng)根據(jù)血壓測量值和不同危險因素的評估來制訂高血壓治療方案。醫(yī)生根據(jù)患者的具體情況判斷患者最適合維持的血壓水平，采取針對性的預(yù)防和治療措施，從而降低心腦血管事件的發(fā)生概率[3]。

載脂蛋白E(ApoE)是一種由單鏈多肽聚合而形成的糖蛋白，它含有299個氨基酸，基因定位于人類19 號染色體的長臂上(13q13.2)。ApoE的3種主要異構(gòu)體E2、E3、E4分別由3 種共顯性等位基因ε2、ε3、ε4所編碼。3種異構(gòu)體間的單個氨基酸替換及它們與4種受體親和程度的差異，決定了ApoE結(jié)構(gòu)基因的遺傳多態(tài)性[4]。人群中3種等位基因的表達方式不同，可以形成6種不同的ApoE表型：3種純合子E2/2、E3/3、E4/4，3種雜合子E2/3、E2/4、E3/4，它們對應(yīng)的基因型分別為ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4。ApoE基因多態(tài)性與血脂代謝異常密切相關(guān)，近年來，關(guān)于ApoE基因多態(tài)性與糖尿病腎病、腦梗死、阿爾茨海默病等多種疾病之間的關(guān)系被廣泛報道[5-7]。但對于ApoE基因多態(tài)性能否影響高血壓患者的血壓水平，以及ApoE等位基因頻率在高血壓人群中的分布尚不十分清楚。本研究選取徐州地區(qū)臨床收治的確診高血壓患者為研究對象，了解ApoE等位基因在高血壓人群中的分布情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取徐州市第一人民醫(yī)院2017年1月至2018年1月收治的臨床確診高血壓患者97例作為高血壓組，選取同期非高血壓住院患者106例作為對照組。高血壓組:男性58例，女性39例；平均年齡(58.61±12.15)歲；對照組：男性66例，女性40例；平均年齡(54.29±11.92)歲。2組患者年齡和性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)：所有入組患者均符合1978年WHO建議的高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，即收縮壓≥160 mm Hg和(或)舒張壓≥90 mm Hg。排除冠心病，糖尿病，腦、肝、腎疾病，血脂異常及服用降壓藥物的患者。等位基因頻率計算方法：ε2、ε3、ε4 3種等位基因出現(xiàn)的頻次分別與這3種等位基因在每組中出現(xiàn)的總頻次的百分比。

1.2儀器與試劑 全血基因DNA提取試劑盒(離心柱型，產(chǎn)品批號Q5906)購自根生化科技(北京)有限公司，人類ApoE和SLCO1B1基因檢測試劑盒(產(chǎn)品批號17111506)購自武漢友芝友生物科技有限公司。無水乙醇、杭州博日全自動熒光檢測PCR擴增儀、各種加樣器、加樣吸頭等。

1.3方法

1.3.1全血基因DNA提取 (1)采集患者乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝靜脈全血2 mL，充分混勻后吸取200 μL全血加入1.5 mL EP離心管中，再加入20 μL 蛋白酶K溶液。(2)在上述試管中加入200 μL GB緩沖液，充分混勻，置56 ℃ 10 min，其間顛倒混勻數(shù)次。(3)試管中再加入200 μL無水乙醇，充分混勻。(4)將上一步所得混合溶液全部轉(zhuǎn)移到吸附柱CB3中(吸附柱提前放入收集管中)，12 000 r/min離心30 s，棄去收集管中的廢液。(5)向上述吸附柱CB3中再加入500 μL GD緩沖液，12 000 r/min離心30 s，棄去收集管中的廢液。(6)再向吸附柱CB3中加入600 μL 的PW緩沖液，12 000 r/min離心30 s，棄去收集管中的廢液。(7)重復(fù)第6步操作。(8)12 000 r/min離心2 min后將吸附柱CB3置室溫開蓋放置5 min，使乙醇充分揮發(fā)。(9)將處理后的吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個新的1.5 mL離心管中，將100 μL TB洗脫緩沖液懸空滴加于吸附膜中間位置，于室溫放置4 min，12 000 r/min離心2 min，收集離心后的液體，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2APOE基因型檢測 (1)取出人類ApoE和SLCO1B1基因檢測試劑盒，室溫平衡解凍30 min，每個反應(yīng)管中分別加入23 μL E2和E4反應(yīng)液。(2)將提取后的待測樣本基因組DNA、弱陽性對照和空白對照各2 μL分別加入上述反應(yīng)管中。(3)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋，于杭州博日全自動熒光檢測PCR擴增儀上檢測。(4)杭州博日全自動熒光檢測PCR擴增儀APOE2 526C-FAM通道、APOE2 526T-VIC通道、APOE4 388T-FAM通道、APOE4 388C-FAM通道、內(nèi)標(biāo)基因-ROX通道分別采集熒光信號。(5)PCR反應(yīng)條件：37 ℃ 10 min，1次循環(huán)→95 ℃ 5 min，1次循環(huán)，95 ℃ 15 s→60 ℃ 60 s，共40次循環(huán)，每次循環(huán)結(jié)束讀取熒光信號。

2 結(jié) 果

2.12組患者ApoE表型比較 ApoE表型分布在高血壓組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，2組患者都以ε3/ε3表型最為常見，高血壓組和對照組ε3/ε3表型分別占80.41%和75.47%。見表1。

表1 2組患者ApoE表型比較[n(%)]

2.22組患者ApoE等位基因頻率比較 高血壓組與對照組的ApoE等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，2組ε3等位基因檢出頻率最高。見表2。

表2 2組患者ApoE等位基因頻率比較[n(%)]

2.3不同ApoE表型患者收縮壓及舒張壓水平比較 對照組ApoE E2、E3、E4表型患者收縮壓及舒張壓水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，E4表型患者(ε4等位基因攜帶者)收縮壓及舒張壓較其他等位基因攜帶者高。高血壓組ApoE E2、E3、E4表型患者收縮壓水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，E4表型患者(ε4等位基因攜帶者)收縮壓較其他等位基因攜帶者高。見表3。

表3 ApoE E2、E3、E4表型患者收縮壓及舒張壓水平比較

3 討 論

ApoE在不同人群中的表型不一致，存在基因多態(tài)性。人群中ApoE等位基因頻率最常見的是ε3,本研究結(jié)果與此相同。而ε2、ε4可能是天然進化過程中某一核苷酸突變形成的，在人群中占比較少。有研究表明，ApoE等位基因頻率在不同國家有所不同，在各種疾病中，ApoE等位基因頻率的分布亦有所不同[9-11]。血脂水平受ApoE基因多態(tài)性的調(diào)控，進而決定和影響動脈粥樣硬化病變的發(fā)生和發(fā)展，ApoE基因多態(tài)性還存在種族差異，但結(jié)論尚不完全統(tǒng)一[12-14]。本研究主要探討徐州地區(qū)ApoE等位基因多態(tài)性對高血壓患者的影響，結(jié)果顯示，對照組與高血壓組患者ApoE表型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且都以ε3/ε3表型最為常見。ApoE等位基因頻率在高血壓組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，ε3等位基因頻率檢出率在2組均最高。不同ApoE表型在對照組間收縮壓及舒張壓水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，E4表型患者(ε4等位基因攜帶者)收縮壓及舒張壓較其他等位基因攜帶者高。高血壓組患者中，ApoE E2、E3、E4表型患者收縮壓水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，E4表型患者(ε4等位基因攜帶者)收縮壓較其他等位基因攜帶者高，而ApoE基因多態(tài)性與舒張壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

本研究結(jié)果顯示，ApoE等位基因ε4可能是高血壓病發(fā)生、發(fā)展的危險因素之一。若能在無其他危險因素存在的高血壓人群中進行ApoE等位基因頻率的分析，并采用分子生物學(xué)技術(shù)對ApoE結(jié)構(gòu)和功能進行深入分析，進一步揭示其對其高血壓或其他疾病的機制，有望在高血壓的早期預(yù)防和干預(yù)方面有所突破。由于本研究采納的數(shù)據(jù)基數(shù)太小，且不同地區(qū)和人群ApoE等位基因分布也會有差異，下一步將擴大研究范圍，為ApoE等位基因多態(tài)性對高血壓患者的影響提供更詳實的依據(jù)。