丁 麗，張 瑞

空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710032

先天性代謝異常又稱遺傳代謝病，大多屬于隱性基因遺傳性疾病，多數(shù)在嬰兒期內(nèi)起病，發(fā)病的機(jī)制復(fù)雜，尤其是臨床表現(xiàn)的多樣性和檢測指標(biāo)缺乏特異性導(dǎo)致遺傳代謝病的精準(zhǔn)診斷和治療困難[1-3]。遺傳代謝病的診斷和治療依賴于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗和一些非特異性的生化指標(biāo),多數(shù)情況下，臨床醫(yī)生只能根據(jù)經(jīng)驗推測遺傳代謝病的可能性而難以做出具體病因診斷[4-5]。近年來，隨著臨床診斷學(xué)的不斷發(fā)展，液相色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)在臨床診斷尤其是遺傳代謝病篩查中的應(yīng)用越來越廣泛[6-8]，但是目前遺傳代謝病篩查大部分只檢測13種氨基酸，本研究利用衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法建立了22種氨基酸全血檢測方法，擴(kuò)大了氨基酸的檢測種類，將其運用于新生兒及兒童遺傳代謝病篩查，并分析該檢測方法的各種影響因素，為相關(guān)疾病診斷的進(jìn)一步發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年5月至2018年1月西部5省部隊在空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院自愿選擇衍生化串聯(lián)質(zhì)譜篩查的2 869例各項醫(yī)學(xué)檢測指標(biāo)均正常的3 d至1歲新生兒及兒童為研究對象。出生后3～28 d設(shè)為新生兒組(n=1 926)，男999例,女927例；>28 d至1歲設(shè)為兒童組(n=943)，男490例，女453例。通過檢測健康新生兒及兒童外周血中22種氨基酸濃度來確定本實驗室的正常上、下限值，22種氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、同型半胱氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、六氫哌啶羧酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。本研究雖然同時得到了22種氨基酸的結(jié)果，但是由于論文篇幅有限，為了結(jié)果的系統(tǒng)性、科學(xué)性、可比性，選擇甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸為代表進(jìn)行分析討論。

1.2標(biāo)本收集與保存 兒童組：研究對象于上午7：00-9:00空腹采集末梢血滴于專用采血濾紙上，形成幾個均勻血斑，完全滲透，待自然晾干后，封于塑料袋內(nèi)，-20 ℃冰箱保存待檢。新生兒組：新生兒出生3 d后，哺乳多次，采足后跟血于專用采血濾紙上，完全滲透，待自然晾干后，封于塑料袋內(nèi)，-20 ℃冰箱保存待檢。

1.3儀器與試劑 API3200串聯(lián)質(zhì)譜儀購自美國AB生物應(yīng)用系統(tǒng)公司，高效液相色譜儀購自美國安捷侖公司(Agilent1200)，96孔板加熱吹干裝置購自杭州奧盛公司(MD200)。甲醇、正丁醇、乙酰氯、乙腈等試劑購自美國Thermo Fisher公司，均為色譜級。將正丁醇和乙酰氯按體積比9∶1配制成3 mol/L的鹽酸正丁醇溶液作為衍生化試劑備用，96孔板購自博奧公司。實驗中所用氮氣的純度在99.9%以上。12種氨基酸內(nèi)標(biāo)，包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸，用甲醇溶解并稀釋配制成萃取液,4 ℃保存,1個月內(nèi)用完。

1.4檢測方法 (1)樣本處理方法：用打孔器在干血濾紙片上制直徑3 mm的圓形血濾紙片(4個質(zhì)控、1個空白),將其置于96孔板中,每孔加入1.3中制備的萃取液100 μL,室溫密封震蕩15 min萃取血片中的22種氨基酸,然后轉(zhuǎn)移萃取液至另一個96孔板,40 ℃加熱氮氣吹干,再加入60 μL1.3中制備的衍生化試劑，Teflon膜覆蓋,置于65 ℃恒溫箱內(nèi)反應(yīng)20 min,隨后40 ℃氮氣吹干,再加入100 μL 80%乙腈溶解,鋁膜覆蓋,串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。(2)儀器設(shè)置狀態(tài)：乙腈作為流動相,設(shè)置液相色譜的流速為300 μL/min,進(jìn)樣量為20 μL，質(zhì)譜檢測中性氨基酸采用中性丟失掃描[中性丟失片斷質(zhì)荷比為102 Da,掃描范圍為140～280 m/z]和多反應(yīng)監(jiān)測2種模式,每個樣本22種氨基酸檢測只需要2 min。(3)資料分析：采用美國AB生物應(yīng)用系統(tǒng)公司ChemoView 2.0.2軟件進(jìn)行定量分析,根據(jù)經(jīng)過衍生化的22種氨基酸及其同位素內(nèi)標(biāo)的離子峰強(qiáng)度,得出所測樣本中22種氨基酸的濃度。

1.5影響因素的考察

1.5.1抗凝劑使用對檢測結(jié)果的影響 采用3種方式[直接采末梢血于干濾紙片上、采靜脈血于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的真空管混勻后滴于干濾紙片上、采靜脈血于含有肝素抗凝劑的真空管混勻后滴于干濾紙片上]來考察抗凝劑的使用對本方法的檢測結(jié)果是否有影響。

1.5.2標(biāo)本保存時間對檢測結(jié)果的影響 將標(biāo)本自然晾干放置1、7、14、21、28、35 d后的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，考察標(biāo)本保存時間對檢測結(jié)果的影響。

1.5.3不同氮氣吹干時間對檢測結(jié)果的影響 在50 ℃、0.2 MPa氮氣吹干條件下考察氮氣吹干10、15、20 min對檢測結(jié)果的影響。

1.5.4內(nèi)標(biāo)液保存時間對檢測結(jié)果的影響 選擇內(nèi)標(biāo)液于4 ℃保存1、7、14、21、28、42、56 d后進(jìn)行檢測，考察內(nèi)標(biāo)液保存時間對檢測結(jié)果的影響。

1.6方法性能驗證 參照美國食品及藥物管理局的生物分析方法[9]，驗證建立的衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測22種氨基酸的基本性能。

1.6.1定量檢出限 系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度重復(fù)檢測5次，將同時滿足變異系數(shù)(CV)<20.0%,偏倚<20.0%。

1.6.2精密度評價 使用高、中、低3個濃度的混合全血作為待測樣本，分別同時檢測20次，評價批內(nèi)精密度。將混合全血制成的濾紙片在-20 ℃保存，連續(xù)檢測5 d，每天重復(fù)3次，評價批間精密度。

1.6.3回收試驗 在已知濃度的全血中同時加入2種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為待測樣本，每份樣本重復(fù)檢測3次，取均值，并與理論值進(jìn)行比較，計算回收率?；厥章试?0.0%～120.0%判斷為可接受。

1.6.4準(zhǔn)確度評價 取2份已知濃度的全血標(biāo)本，重復(fù)檢測3次取均值，偏倚<10.0%判斷為可接受。

2 結(jié) 果

2.1抗凝劑使用對氨基酸檢測結(jié)果的影響 EDTA可使檢測結(jié)果降低，肝素抗凝劑可使檢測結(jié)果升高，故臨床標(biāo)本采集不宜使用抗凝血，使用新鮮末梢血制成的干血片可以用于氨基酸的檢測。使用不同抗凝劑的結(jié)果見表1。

表1 抗凝劑使用對氨基酸檢測結(jié)果的影響

2.2標(biāo)本保存時間對檢測結(jié)果的影響 部分氨基酸指標(biāo)隨著保存時間的延長而降低，故建議4 ℃保存標(biāo)本并在2周以內(nèi)檢測。標(biāo)本保存時間對檢測結(jié)果的影響見表2。

表2 標(biāo)本保存時間對氨基酸檢測結(jié)果的影響

2.3不同氮氣吹干時間對檢測結(jié)果的影響 吹干10 min檢測指標(biāo)普遍偏低，吹干20 min氨基酸指標(biāo)偏移較小，選擇20 min吹干氨基酸均較為理想。不同氮氣吹干時間條件下的檢測結(jié)果見表3。

表3 不同氮氣吹干時間對氨基酸檢測結(jié)果的影響

2.4內(nèi)標(biāo)液保存時間對檢測結(jié)果的影響 同位素內(nèi)標(biāo)復(fù)溶后會逐漸分解或衰減，致使標(biāo)準(zhǔn)降低，檢測結(jié)果增高，1個月左右個別指標(biāo)變化達(dá)10.0%，建議同位素內(nèi)標(biāo)復(fù)溶后盡快使用，4 ℃冰箱保存效期為1個月左右。內(nèi)標(biāo)液在不同保存時間下的實驗結(jié)果見表4。

表4 內(nèi)標(biāo)液保存時間對氨基酸檢測結(jié)果的影響

2.5方法性能驗證

2.5.1定量檢出限 衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測22種氨基酸的定量檢出限分別為：丙氨酸6.0 μmol/L，精氨酸0.3 μmol/L，天冬氨酸0.3 μmol/L，瓜氨酸0.5 μmol/L，半胱氨酸0.4 μmol/L，谷氨酰胺1.0 μmol/L，谷氨酸3.0 μmol/L，甘氨酸10.0 μmol/L，同型半胱氨酸4.0 μmol/L，組氨酸2.0 μmol/L，亮氨酸3.0 μmol/L，賴氨酸0.8 μmol/L，甲硫氨酸0.8 μmol/L，鳥氨酸1.0 μmol/L，苯丙氨酸1.0 μmol/L，六氫哌啶羧酸2.0 μmol/L，脯氨酸10.0 μmol/L，絲氨酸1.0 μmol/L，蘇氨酸1.0 μmol/L，色氨酸2.0 μmol/L，酪氨酸1.5 μmol/L，纈氨酸3.0 μmol/L。

2.5.2精密度評價 檢測高、中、低3個濃度的混合全血待測樣本中22種氨基酸用于評估氨基酸的精密度，高濃度混合全血待測樣本批內(nèi)CV為5.3%～7.2%，中濃度混合全血待測樣本批內(nèi)CV為5.8%～7.4%，低濃度混合全血待測樣本批內(nèi)CV為5.6%～7.9%；高濃度混合全血待測樣本批間CV為7.1%～8.1%，中濃度混合全血待測樣本批間CV為7.4%～8.3%，低濃度混合全血待測樣本批間CV為7.3%～8.6%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，男、女氨基酸濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.5)。

2.5.3回收試驗 考察加入高、低濃度標(biāo)準(zhǔn)品的待測樣本回收率。當(dāng)加入低濃度標(biāo)準(zhǔn)品時回收率分別為丙氨酸96.1%，精氨酸97.4%，天冬氨酸97.0%，瓜氨酸97.2 %，半胱氨酸97.0%，谷氨酰胺93.4%，谷氨酸96.2%，甘氨酸95.8%，同型半胱氨酸96.2%，組氨酸95.9%，亮氨酸96.4%，賴氨酸96.8%，甲硫氨酸97.2%，鳥氨酸96.5%，苯丙氨酸96.0%，六氫哌啶羧酸96.4%，脯氨酸96.3 %，絲氨酸97.4%，蘇氨酸97.1%，色氨酸96.5%，酪氨酸96.3%，纈氨酸 96.1%。加入高濃度標(biāo)準(zhǔn)品時回收率為丙氨酸97.5%，精氨酸97.8%，天冬氨酸98.0%，瓜氨酸97.7%，半胱氨酸97.5%，谷氨酰胺97.2%，谷氨酸98.1%，甘氨酸97.0%，同型半胱氨酸97.4%，組氨酸97.3%，亮氨酸97.8%，賴氨酸97.5%，甲硫氨酸97.9%，鳥氨酸97.2%，苯丙氨酸97.1%，六氫哌啶羧酸97.6%，脯氨酸97.9%，絲氨酸98.1%，蘇氨酸97.8%，色氨酸97.2%，酪氨酸97.4%，纈氨酸97.3%?？傮w樣本的加標(biāo)回收率為96.1%～98.1%。

2.5.4準(zhǔn)確度評價 標(biāo)本1的偏倚分別為丙氨酸6.1%，精氨酸7.8%，天冬氨酸7.8%，瓜氨酸7.6%，半胱氨酸0.0%，谷氨酰胺5.3%，谷氨酸4.1%，甘氨酸4.1%，同型半胱氨酸4.5%，組氨酸7.4%，亮氨酸8.2%，賴氨酸6.2%，甲硫氨酸6.3%，鳥氨酸5.8%，苯丙氨酸9.3%，六氫哌啶羧酸8.9%，脯氨酸5.8%，絲氨酸6.4%，蘇氨酸9.5%，色氨酸6.0%，酪氨酸5.1%，纈氨酸7.4%。標(biāo)本2的偏倚分別為丙氨酸5.1%，精氨酸4.9%，天冬氨酸6.9%，瓜氨酸9.7%，半胱氨酸10.0%，谷氨酰胺5.5%，谷氨酸3.1%，甘氨酸9.3%，同型半胱氨酸4.7%，組氨酸7.2%，亮氨酸4.6%，賴氨酸5.5%，甲硫氨酸4.4%，鳥氨酸5.7%，苯丙氨酸8.7%，六氫哌啶羧酸5.0%，脯氨酸4.5%，絲氨酸4.2%，蘇氨酸5.6%，色氨酸5.1%，酪氨酸5.5%，纈氨酸5.2%。2個標(biāo)本的偏倚均<10.0%，準(zhǔn)確度判斷為可接受。

2.6實驗室22種氨基酸參考區(qū)間的建立 采用本實驗室建立的衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法在上述優(yōu)化條件下對2014年5月至2018年1月2 869例西部五省自愿在本院篩查的新生兒及兒童全血標(biāo)本進(jìn)行22種氨基酸檢測，通過計算各指標(biāo)的2.5%～97.5%百分位數(shù)初步建立本實驗室新生兒及兒童全血中22種氨基酸的健康人群參考范圍，結(jié)果為丙氨酸88.0～664.0 μmol/L,精氨酸0.0～18.8 μmol/L,天冬氨酸0.0～58.0 μmol/L,瓜氨酸3.4～25.1 μmol/L,半胱氨酸0.0～3.1 μmol/L,谷氨酰胺22.0～204.2 μmol/L,谷氨酸87.0～474.0 μmol/L,甘氨酸125.0～750.0 μmol/L,同型半胱氨酸0.0～28.7 μmol/L,組氨酸31.5～214.6 μmol/L,亮氨酸52.2～286.0 μmol/L,賴氨酸7.3～119.8 μmol/L,甲硫氨酸8.4～58.2 μmol/L,鳥氨酸18.3～122.6 μmol/L,苯丙氨酸20.9～137.0 μmol/L,六氫哌啶羧酸110.0～771.0 μmol/L,脯氨酸317.0～2186.0 μmol/L,絲氨酸48.0～239.0 μmol/L,蘇氨酸16.0～116.0 μmol/L,色氨酸4.0～72.0 μmol/L,酪氨酸15.0～178.0 μmol/L,纈氨酸60.0～265.0 μmol/L。

3 討 論

作為蛋白質(zhì)分子的基本單位，氨基酸無疑是構(gòu)成人體最基本的物質(zhì)之一，其重要性使其一直是科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點[10]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，氨基酸檢測技術(shù)也在不斷發(fā)展，其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的發(fā)展是最典型的代表[11]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)主要是運用液相色譜將待測樣本中的多種成分進(jìn)行分離，再根據(jù)被測物質(zhì)在質(zhì)譜中被離子化的特定質(zhì)荷比的不同帶電粒子,根據(jù)特征離子的質(zhì)量色譜圖及其檢測的離子峰強(qiáng)度,獲得待測化合物的相對分子質(zhì)量、分子式[12-13]。衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法能在2 min內(nèi)完成1個標(biāo)本中22種氨基酸濃度的分析,通過對這些產(chǎn)物濃度的分析,對氨基酸代謝紊亂、有機(jī)酸代謝紊亂等多種遺傳代謝病進(jìn)行篩查和診斷[14-16]。不斷發(fā)展的氨基酸檢測技術(shù)為相對快速診斷遺傳代謝病以指導(dǎo)臨床治療提供了更多的可能性[17-20]。本研究建立本實驗室22種氨基酸的檢測方法衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法，并考察實驗過程的影響因素，研究結(jié)果表明，樣本處理過程的最佳條件為：使用新鮮末梢血制成的干血片于4 ℃保存標(biāo)本2周以內(nèi)檢測，氮氣吹干20 min，同位素內(nèi)標(biāo)復(fù)溶后盡快使用，4 ℃冰箱保存效期為1個月左右。本方法定量檢出限為0.3～10.0 μmol/L；批內(nèi)CV為5.3%～7.9%,批間CV為7.1%～8.6%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,男、女氨基酸濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.5)。加標(biāo)回收率為96.1%～98.1%，偏倚<10.0%。通過分析2014年5月至2018年1月采集的2 869例新生兒及兒童全血中的氨基酸濃度，建立本實驗室新生兒及兒童全血中22種氨基酸的健康人群參考范圍。本研究建立的22種氨基酸快速檢測方法衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法將為臨床醫(yī)生精準(zhǔn)診療遺傳代謝病提供更多的科學(xué)依據(jù)。