吳雨泉，杜紫微，李佳珍，王一碩,2*，石延榜,2

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南省中藥生產(chǎn)一體化工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046

克服癌癥是人類面臨的難題之一。據(jù)美國癌癥研究協(xié)會（AACR）發(fā)布的2017年癌癥進展報告指出[1]，至2035年全球每年癌癥新發(fā)病例數(shù)可能增加至2400萬例，這將給人們的生命健康及社會的經(jīng)濟負擔(dān)帶來嚴重的威脅。然而，有學(xué)者認為植物化學(xué)物對多種癌癥有預(yù)防作用[2]，尚可通過日常飲食予以攝入。

中國茶文化歷史悠久，品種眾多，其養(yǎng)生保健作用深受廣大消費者的喜愛。茶的藥用價值最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，素有“神農(nóng)嘗百草，日遇七十二毒，得荼而解之”之說。目前，茶葉已涉及食品、藥品和保健品等多個領(lǐng)域?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，茶葉中主要富有茶多酚類[3]、生物堿[4]和氨基酸類等[5]化學(xué)成分。盡管茶葉對癌癥的防治具有潛在的積極作用[6-8]，但涉及的潛在分子機制仍然不明晰。基于此，本文通過生物信息技術(shù)、多向藥理學(xué)及網(wǎng)絡(luò)分析等融為一體的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[9]，對茶葉中主要化學(xué)成分進行抗癌作用先驗性探究，以期為揭示茶葉抗癌的科學(xué)內(nèi)涵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 茶葉成分與靶標的收集

通過知網(wǎng)文獻，搜集茶葉中主要的化學(xué)成分；把所收集到的成分在化源網(wǎng)（www.chemsrc. com）數(shù)據(jù)庫中確定其結(jié)構(gòu)式，并使用Chembiodraw 軟件手動畫取，保存為“CDX”格式；將所有的化學(xué)結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入SwissTarget Prediction（www.sib.swiss）數(shù)據(jù)庫，預(yù)測其作用靶點。

1.2 茶葉成分-靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓撲學(xué)分析

將上述獲得的成分與靶點導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)；利用“Analysis network”工具對該網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，以Degree值表示重要節(jié)點，其值越大，表明在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.3 茶葉成分-疾病的交集靶點分析

以“Cancer”為關(guān)鍵詞，在Genecards和DrugBank 兩個數(shù)據(jù)庫中檢索癌癥的疾病靶點。其中，Genecards數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果通過多次篩選“Relevance score”值的中位數(shù)，以獲得相關(guān)度高的靶點信息。將兩個數(shù)據(jù)庫所搜集的信息合并，刪除重復(fù)項后保存；再將成分靶點與疾病靶點導(dǎo)入Venn（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn）獲得交集靶點。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點篩選

通過String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）分析互作靶點。將物種選擇“人類”并隱藏游離節(jié)點，其他參數(shù)保持默認值，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)；利用Cytoscape 3.7.2 軟件中進行可視化分析，并根據(jù)Degree值的中位數(shù)篩選核心靶點。

1.5 GO與KEGG富集分析

將[1.4]獲得的核心靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫（https://Metascape.org），物種選擇“人類”，對其進行GO生物功能富集分析，包括生物過程（Biological process，BP）、細胞組成（Cell composition，CC）和分子功能（Molecular function，MF）；KEGG通路富集分析使用同一數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉成分與靶標的收集結(jié)果

通過文獻研究[4,10-12]，最終納入兒茶素（Catechin）、表兒茶素（Epicatechin）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate）、兒茶素沒食子酸酯（Catechin gallate）、咖啡堿（Theobromine）、蘆丁（Rutin）、天門冬氨酸（Aspartic acid）、精氨酸（Argininic acid）、谷氨酸（L-glutamic acid）、茶氨酸（L-Theanine）和茶黃素（Theaflavin）共13種化學(xué)成分；將各成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入 SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中，共計得到391個靶點，去重整合后最終得到165個靶點。

2.2 茶葉成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與拓撲分析學(xué)結(jié)果

將[2.1]收集到的成分和靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建茶葉成分-靶點絡(luò)。圖1顯示，該網(wǎng)絡(luò)由178個節(jié)點（13個成分，165個靶點）和391條邊組成。圖中綠色八邊形表示納入茶葉的主要成分，藍色菱形為靶點。使用“Analysis network”對該網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學(xué)分析，進而獲得Degree、BetweennessCentrality、ClosenessCentrality等多個參數(shù)值；其圖形大小與顏色深淺與Degre值成正相關(guān)；Degree中位數(shù)為1，BetweennessCentrality中位數(shù)為0，ClosenessCentrality中 位 數(shù) 為0.268 404 91。Degree大于兩倍中位數(shù)（≥2）的有80個節(jié)點，占44.9%。根據(jù)Degree值大小，排名前三位的成分有 Epicatechin gallate、Catechin gallate、Gallocatechin gallate 和 Epigallocatechin gallate；排名前三位的靶點有CA12、CA1、CA2、PTGS1，提示這些成分和靶點可能與癌癥密切相關(guān)。網(wǎng)絡(luò)拓撲基本信息見表1。

圖1 茶葉13種化學(xué)成分-靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Figure 1 Network construction of 13 chemical components-targets in tea

表1 茶葉成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點的網(wǎng)絡(luò)拓撲信息Table 1 Network topology information of key nodes in tea composition-target network

2.3 茶葉成分-疾病的交集靶點結(jié)果

以“Cancer”為關(guān)鍵詞，在DrugBank數(shù)據(jù)庫中查詢得到58個靶點；同時在 Genecards數(shù)據(jù)庫中查詢得到候選靶點25 460個，通過“Relevance score”取三次中位數(shù)（n≥7.06）篩選得到3327個相關(guān)疾病靶點。將兩個數(shù)據(jù)庫得到的結(jié)果歸一整合，共得到3350個疾病靶點；Venn圖顯示，藥物與疾病的交集靶點共79個，提示這些靶點可能是茶葉治療癌癥的潛在靶點（圖2）。

圖2 茶葉成分-疾病交集靶點的Venn圖Figure 2 Venn diagram of tea composition-disease intersection target

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

將79個關(guān)鍵靶點導(dǎo)入String生物分析平臺，物種選擇為“人類”，分析其互作關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)顯示共有79個節(jié)點683條邊（超過預(yù)期值208），平均每個節(jié)點的Dgree值為17.3；有5個游離節(jié)點，將游離節(jié)點隱藏后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，并根據(jù) Degree 中位數(shù)（n≥14）選取核心靶點，結(jié)果如圖3所示。圖中顯示共有40個節(jié)點440條邊，節(jié)點的大小和顏色的深淺與Degree值成正相關(guān)，邊的粗細代表Combine score值的大小，邊越粗值越大。Degree值排名前十位的核心靶點有IL6、VEGFA、TNF、CASP3、EGFR、PTGS2、ESR1、MMP9、JUN、CCL2和CREB1，提示這些靶點可能是茶葉治療癌癥的核心靶點。

圖3 核心靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of core target

2.5 茶葉成分-疾病靶點的GO及KEGG富集分析

2.5.1 茶葉成分-疾病靶點的GO富集分析

將[2.4]項下的40個核心靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫，物種選擇為“人類”，共確定4540個GO條目（P< 0.01），其中BP有3739個條目，涉及積極調(diào)控細胞遷移（positive regulation of cell migration）、調(diào)節(jié)平滑肌細胞增殖（regulation of smooth muscle cell proliferation）、對氧氣水平的反應(yīng)（response to oxygen levels）和白細胞分化（leukocyte differentiation）等；CC共有393個條目，涉及膜筏（membrane raft）、細胞質(zhì)核周區(qū)域（perinuclear region of cytoplasm）、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體（transcription factor complex）和 粘 附 連 接（adherens junction） 等；MF有408個條目，涉及細胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、內(nèi)肽酶活性（endopeptidase activity）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）和一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑活性（nitric-oxide synthase regulator activity）等。如圖4所示，校正P值前十位條目的標準分數(shù)（z-score)。

圖4 茶葉成分-靶點的GO富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of tea components-targets

2.5.2 茶葉成分-疾病靶點的KEGG信號通路富集分析

將[2.4]項下的40個核心靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫，物種選擇為“人類”，進行KEGG信號通路功能富集分析，最終共確定353個條目（P< 0.01），根據(jù)校正后P值的大小取前20位通路，見圖5氣泡圖。結(jié)果顯示，主要涉及癌癥的途徑（Pathways in cancer）、癌癥中蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、小細胞肺癌（Small cell lung cancer）、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)（Transcriptional misregulation in cancer）和前列腺癌（Prostate cancer）等。以上結(jié)果表明，茶葉中13種化學(xué)成分與抗癌作用密切相關(guān)，基本信息見表2。

表2 茶葉成分-疾病靶點的前20位KEGG信號通路富集結(jié)果Table 2 Enrichment results of the top 20 KEGG signaling pathways of tea components-disease targets

圖5 茶葉成分-疾病靶點的KEGG信號通路富集分析氣泡圖Figure 5 Bubble chart of enrichment analysis of KEGG signaling pathway of tea components-disease targets

2.6 茶葉成分-靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

綜合上述分析得到的成分-靶點-通路結(jié)果，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。由圖6所示，涉及茶葉參與癌癥調(diào)控的成分有11個，由紅色圓形所示；靶點31個，由黃色圓形所示；綠色圓形表示為通路，其圖形面積大小和顏色深淺與Degree值成正相關(guān)。其中，Aspartic acid與L-glutamic acid無對應(yīng)靶點和通路。排名前十位的靶點有VEGFA、MAPK14、MMP2、MMP9、EGFR、IL6、CDK2、STAT1、TNF、CASP3、JUN、MET、NOS3和CREB1，提示這些靶點可能是茶葉治療癌癥的重要靶點。

圖6 茶葉成分-靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Figure 6 Network construction of tea components-targets-pathways

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著我國醫(yī)療技術(shù)蓬勃發(fā)展，癌癥的治療手段也邁進了全新時代。分子靶向治療與生物免疫治療等現(xiàn)代化治療技術(shù)在臨床得到日益廣泛的應(yīng)用[13]。然而，生活習(xí)慣、工作環(huán)境、遺傳與衰老等可能是誘發(fā)機體組織癌變的主要因素[14-16]，因此抗癌重在預(yù)防。中醫(yī)素有“藥食同源”之說，認為食療的綜合調(diào)攝是防治癌癥的重要方式[17]。而茶葉因其獨特的功效與滋味，最終被確定為一種可長期飲服的飲料[18]。唐代《本草拾遺》[19]記載：“諸藥為各病之藥，茶為萬病之藥?！爆F(xiàn)代研究表明，茶葉具有顯著的抗癌作用[6-8]。本文通過文獻調(diào)研[4,10-12]，最終納入茶葉中13種主要成分進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，為進一步探究茶葉抗癌的科學(xué)內(nèi)涵以及茶葉的二次開發(fā)提供新思路。

3.1 茶葉“成分-靶點”抗癌作用

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果表明，13種茶葉化學(xué)成分涉及165個靶點；合并DrugBank和Genecards數(shù)據(jù)庫共收集癌癥相關(guān)靶點3350個，其成分與疾病的交集靶點有79個；PPI網(wǎng)絡(luò)確認IL6、VEGFA和TNF等40個核心靶點。

依據(jù)表1成分-靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)果分析，Dgree值排名前三位的成分分別是Epicatechin gallate、Catechin gallate、Gallocatechin gallate 和Epigallocatechin gallate，同屬茶多酚類化合物。

Epigallocatechin gallate是茶葉中含量最豐富的茶多酚類成分，約占兒茶素總量的50%～80%[20]。在癌癥的調(diào)控氧化應(yīng)激、阻滯腫瘤細胞周期、抑制腫瘤血管生成和誘導(dǎo)癌細胞凋亡等分子機制方面發(fā)揮著重要作用[21]。CASP3是Caspase家族中介導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子，馮強[22]認為綠茶提取物Epigallocatechin gallate可能是MCF-7細胞中Caspase3蛋白活性增強的主要因素，對乳腺癌細胞有一定的抑制作用；Chen[23]課題組研究發(fā)現(xiàn)，Epigallocatechin gallate處理可致腎細胞癌細胞中MMP-2（基質(zhì)金屬蛋白酶2）和MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶9）的下調(diào)，表明具有一定的抗癌作用；另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[24]該成分可抑制肝癌細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡, 其機制可能與TNF-α（腫瘤壞死因子-α）等炎癥信號分子表達的變化有關(guān)。

Epicatechin gallate屬黃烷醇類化合物。Kürbitz C 研究發(fā)現(xiàn)[25]，Epicatechin gallate和Catechin gallate對人胰管腺癌細胞的抑制效果比Epigallocatechin gallate強，尤其是Epicatechin gallate可抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化，并因此分泌促炎和侵襲促進蛋白；從成分的安全性角度來看，Epicatechin gallate可誘導(dǎo)人口腔癌細胞的凋亡，但對正常的細胞無明顯影響[26]，表明該化合物對癌癥的治療安全有效。

此外，還存在一些Degree相對值不高但對癌癥細胞有抑制作用的成分。在Theobromine與L-Theanine兩種成分對二甲基肼誘導(dǎo)的結(jié)腸癌抑制作用的研究中發(fā)現(xiàn)[27]，兩種成分單獨或組合使用均通過下調(diào)Akt / mTOR和JAK2 /STAT3途徑以及增加Smad 2腫瘤抑制因子來抑制腫瘤發(fā)生，其中組合使用時治療作用更顯著。Theaflavin是一類具有苯駢卓酚酮環(huán)結(jié)構(gòu)的天然化合物。Tan[28]研究表明，Theaflavin通過誘導(dǎo)細胞周期停滯，對人結(jié)腸癌SW480和SW620細胞的增殖具有抑制作用，但對正常細胞的毒性較低，提示安全指數(shù)較高。

3.2 茶葉抗癌的核心靶點與作用機制

根據(jù)[2.4]項下PPI提取的核心靶點，獲得排名前十位的靶點有IL6、VEGFA、TNF、CASP3、EGFR、PTGS2、ESR1、MMP9、JUN、CCL2和CREB1，其中IL-6、TNF與CCL2屬于炎癥因子，它們都與免疫炎癥及組織壞死相關(guān)；在[2.5.2]項下KEGG通路分析顯示，茶葉涉及多種癌癥的相關(guān)通路、PI3K-Akt信號通路和NF-κB等信號通路，這些通路與炎癥浸潤和氧化應(yīng)激有關(guān)。

IL6（白細胞介素6）作用的靶細胞很多，包括巨噬細胞、肝細胞、靜止的T細胞、活化的B細胞和漿細胞等。Weber R表示[29]IL-6是骨髓來源的抑制性細胞在腫瘤發(fā)展中產(chǎn)生、積累和激活以及刺激腫瘤細胞增殖與存活及侵襲性與轉(zhuǎn)移的重要因素。因此，IL-6可作為癌癥的陰性預(yù)后標志物；EGFR（表皮生長因子受體）是HER家族成員之一，參與細胞增殖、分裂和周期調(diào)控等過程。茶氨酸及其衍生物可減少EGFR、MET、Akt和子宮頸癌細胞中的NF-κB，在人類宮頸癌中可能具有治療或輔助治療應(yīng)用的潛力[30]；VEGFA（血管內(nèi)皮生長因子）可誘導(dǎo)腫瘤等組織的血管生長，維持腫瘤的生長。VEGFA可激活PI3K[31]，而PI3K參與內(nèi)皮細胞微管的形成，也參與內(nèi)皮細胞增殖、存活、遷移和血管通透性的形成[32]；TNF多由激活的巨噬細胞和免疫細胞（B細胞和T細胞）等產(chǎn)生[33]。前列腺癌組織中存在高表達的TNF-α。此外，TNF-α可刺激生物體產(chǎn)生損傷細胞DNA的分子產(chǎn)物, 從而加速前列腺癌的發(fā)展[34-35]；PTGS2（前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2）是一種已被廣泛研究作為癌癥預(yù)后標志物的酶。PTGS2位于TGFβ的EPHA2信號傳導(dǎo)的下游，PTGS2缺失可逆轉(zhuǎn)T細胞排斥反應(yīng)，并使腫瘤對免疫治療敏感[36]；ESR1（雌激素受體1）的配體結(jié)合域中的體細胞突變是乳腺癌發(fā)展的關(guān)鍵介質(zhì)。胰島素樣生長因子-1（IGF1）是乳腺發(fā)育和腫瘤發(fā)生的重要調(diào)節(jié)劑，而PI3K-Akt軸是介導(dǎo)ESR1突變細胞中增強的IGF1反應(yīng)的主要途徑[37]；MMP9（基質(zhì)金屬蛋白酶9）屬于基質(zhì)金屬肽酶家族成員，它是一類復(fù)雜的內(nèi)肽酶。Tsai等[38]研究表明NF-κB信號通路下游腫瘤進展相關(guān)MMP9與肝癌病灶生長、血管生成和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，NF-κB信號通路抑制可顯著降低其表達；JUN是一種原癌基因蛋白。Jun和Fos蛋白組成的AP-1因子可以調(diào)節(jié)生物學(xué)行為的基因表達，從而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的侵襲性生長、腫瘤血管生成以及腫瘤轉(zhuǎn)移[39]；CCL2（趨化因子配體2）是一類在炎癥和病理條件下引導(dǎo)粒細胞遷移運動的可溶性蛋白分子，可調(diào)節(jié)單核細胞的浸潤和遷移，在腫瘤和基質(zhì)細胞中均高表達，并與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[40]；CREB1（cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1）是真核細胞中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。活化的CREB參與多種信號傳導(dǎo)過程, 調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡及能量代謝，同多種腫瘤的生長及血管形成有關(guān)，能夠介導(dǎo)細胞增殖并誘導(dǎo)細胞抗凋亡模式形成[41]。因此，CREB是一個重要的潛在抗腫瘤藥物作用靶點。

綜上，茶葉抗癌潛在的活性成分可能通過L6、VEGFA、TNF、CASP3、EGFR、PTGS2、ESR1、MMP9、JUN、CCL2和CREB1介導(dǎo)癌癥的相關(guān)通路、PI3K-Akt信號通路與NF-κB等信號通路，參與炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激等過程達到防治癌癥的目的。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探究茶葉潛在的抗癌成分、靶點及作用機制，結(jié)合圖1和表2，發(fā)現(xiàn)茶多酚類可能是抗癌作用的主要成分，多成分多靶點的綜合調(diào)控是茶葉發(fā)揮藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的優(yōu)勢所在。本文僅在理論水平上進行探討，雖然部分能與以往的研究對應(yīng)，但還存在一定的發(fā)掘空間，期望不久的將來隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在實驗水平上能夠揭示更多的科學(xué)內(nèi)涵。