張媛婷，夏藝菲，何曉琦，劉 暢，張志國

大慶師范學(xué)院 生物工程學(xué)院，黑龍江 大慶 163712

茶葉在中國已有上千年的歷史。茶葉在飲品中擁有崇高地位的原因在于它含有大量的茶多酚[1]。茶多酚具有抗氧化、延緩衰老、降血脂和降血糖等功能，并對人體無毒副作用[2]。中國茶葉物產(chǎn)豐富，種類繁多[3]，科學(xué)高效提取茶葉中的茶多酚具有重要意義。

目前，茶多酚常用的提取方法有溶劑萃取法、離子沉淀法和超聲波輔助浸提法等[4]。超聲波輔助浸提法工藝簡單、提取溫度低、產(chǎn)品得率高、安全性高[4-5]。超聲波輔助提取茶多酚雖然在國內(nèi)已有大量研究，但各研究所得工藝參數(shù)相差很大[6-7]。我國茶葉分為綠茶、白茶、黃茶、青茶、紅茶和黑茶等六大類，本文主要探討超聲波提取綠茶和白茶中茶多酚的優(yōu)化工藝，同時通過羥基自由基清除實驗、DPPH自由基清除實驗和總抗氧化能力實驗測定評價兩種茶葉中茶多酚的抗氧化活性，以期為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

綠茶：浙江浦江，春茶，一級；白茶：福建南平，春茶，一級。

1.2 試劑與儀器

茶多酚，上海源葉生物科技有限公司；TPTZ（三吡啶三吖嗪），sigma-Aldrich公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼），sigma-Aldrich公司；無水乙醇、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

AGBP210S電子天平，Sartorius公司；UV-1700紫外可見分光光度計，上?？茖W(xué)精密儀器廠；SK3310HP型超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶多酚的提取

綠茶、白茶→粉碎過篩（40目）→加入一定濃度乙醇超聲提取→過濾→茶多酚提取液。

1.3.2 茶多酚含量測定

稱取0.5 g茶多酚，定容至100 mL。分別取 0.0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.4 mL和0.5 mL，加水至10 mL，加酒石酸亞鐵溶液5 mL，混勻后加磷酸緩沖液至刻度，混勻后放置10 min。550 nm測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)酒石酸亞鐵比色法，結(jié)合茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，測定并計算茶多酚提取率[6-8]。

1.3.3 單因素實驗

按“1.3.1”實驗，考察超聲溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）、料液比（1∶10 g/mL、1∶20 g/mL、1∶30 g/mL、1∶40 g/mL、1∶50 g/mL、1∶60 g/mL）、乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%、100%）和超聲時間（10 min、30 min、50 min、70 min、90 min、110 min）對茶多酚提取率的影響。

1.3.4 正交試驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，進(jìn)行L9（34）正交試驗（表1、表2）。

表1 綠茶正交試驗因素水平設(shè)計表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for green tea

表2 白茶正交試驗因素水平設(shè)計表Table 2 Factors and levels of orthogonal test for white tea

1.3.5 茶多酚抗氧化活性測定

茶多酚清除羥基自由基能力的測定參照謝丹丹的方法進(jìn)行[10]；清除DPPH自由基能力的測定參照奕志英和陳安徽的方法進(jìn)行[11-12]；總抗氧化能力的測定參照楊皓彬和黃婷的方法進(jìn)行[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

得到回歸方程為：y = 0.0035x-0.0019，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9991，x為茶多酚濃度，y為吸光度值。茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 茶多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of tea polyphenols

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 超聲溫度對茶多酚提取率的影響

由圖2可知：當(dāng)超聲溫度為70℃時，綠茶和白茶中茶多酚提取率達(dá)到峰值，溫度再升高提取率下降。這可能是因為隨著溫度的升高，茶多酚類物質(zhì)在溶劑中的溶解度增加，從而使得其提取率升高，但是由于茶多酚類物質(zhì)不耐高溫，溫度過高會使得茶多酚的結(jié)構(gòu)被破壞，從而最終使茶多酚的提取率降低。因此，提取茶多酚的適宜溫度為70℃。

圖2 超聲溫度對茶多酚提取率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of tea polyphenols

2.2.2 料液比對茶多酚提取率的影響

由圖3可知：當(dāng)料液比小于1∶50 g/mL時，綠茶和白茶中茶多酚的提取率隨著料液比的增大逐漸升高，當(dāng)料液比大于1∶50 g/mL時，綠茶和白茶中茶多酚的提取率隨著料液比的增大而有所下降。分析可知，在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，料液比的增加有利于茶葉中茶多酚的溶出，使茶多酚溶解度增大，但當(dāng)料液比到達(dá)一定數(shù)值后，溶劑中蛋白質(zhì)與果膠等雜質(zhì)的含量也增加，從而抑制茶葉中茶多酚的溶出，最終使得茶葉中茶多酚的提取率降低。可見，提取綠茶和白茶中茶多酚適宜料液比均為1∶50 g/mL。

圖3 料液比對茶多酚提取率的影響Figure 3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of tea polyphenols

2.2.3 乙醇濃度對茶多酚提取率的影響

由圖4可知：當(dāng)乙醇濃度為80%和90%時，綠茶和白茶茶多酚提取率分別達(dá)峰值。再增加乙醇濃度，提取率降低，可能是由于溶劑與多酚物質(zhì)的極性相似程度降低[15]。因此，提取綠茶和白茶中茶多酚的適宜乙醇濃度分別為80%和90%。

圖4 乙醇濃度對茶多酚提取率的影響Figure 4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of tea polyphenols

2.2.4 超聲時間對茶多酚提取率的影響

由圖5可知：當(dāng)超聲時間為90 min時，綠茶茶多酚提取率達(dá)到峰值；當(dāng)超聲時間為70 min時，白茶茶多酚提取率達(dá)到峰值。上述現(xiàn)象主要是因為超聲時間越長茶葉中的茶多酚溶出的越多，但是茶多酚不穩(wěn)定，隨著超聲時間的延長茶多酚會被逐漸破壞，從而使其提取率降低。可見，提取綠茶和白茶中茶多酚的適宜超聲時間分別為90 min和70 min。

圖5 超聲時間對茶多酚提取率的影響Figure 5 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of tea polyphenols

2.3 正交試驗結(jié)果

由表3可知，綠茶茶多酚的最佳提取條件為：超聲溫度60℃，料液比1∶50 g/mL，乙醇濃度70%，超聲時間110 min。

表3 綠茶正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of green tea

由表4可知，白茶茶多酚的最佳提取因素為：超聲溫度為70℃，料液比為1∶60 g/mL，乙醇濃度80%，超聲時間90 min。

表4 白茶正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of white tea

以超聲溫度為誤差項進(jìn)行方差分析。由表5可知，各因素對綠茶茶多酚提取率影響的主次順序為超聲時間、乙醇濃度、料液比、超聲溫度，與極差結(jié)果相符，其中超聲時間對綠茶茶多酚提取率具有顯著影響。

表5 綠茶正交試驗方差分析表Table 5 Analysis of variance of green tea orthogonal test

以超聲溫度為誤差項進(jìn)行方差分析。由表6可知，各因素對白茶茶多酚提取率影響的主次順序為乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度與極差結(jié)果相符，其中乙醇濃度對白茶茶多酚提取率具有顯著影響。

表6 白茶正交試驗方差分析表Table 6 Analysis of variance of white tea orthogonal test

2.4 茶多酚的抗氧化活性

2.4.1 清除羥基自由基能力

由圖6可知：綠茶茶多酚、白茶茶多酚以及Vc對羥基自由基最高清除率分別為：綠茶94.74%、白茶78.95%和Vc 57.90%。綠茶茶多酚、白茶茶多酚以及Vc對羥基自由基的清除率隨著濃度的增加而逐漸升高，當(dāng)綠茶茶多酚濃度達(dá)到150.00 μg/mL時，清除率增加逐漸變緩；白茶茶多酚濃度達(dá)到125.00 μg/mL時，清除率增加逐漸變緩；Vc對羥基自由基的清除率遠(yuǎn)小于綠茶和白茶中茶多酚對羥基自由基的清除率，即茶多酚的抗氧化能力強(qiáng)于Vc。根據(jù)清除率擬合曲線，得到綠茶茶多酚、白茶茶多酚以及Vc對羥基自由基的IC50分別為76.76 μg/mL、101.29 μg/mL 和 145.17 μg/mL。比較可知，對羥基自由基的IC50大小順序為：綠茶茶多酚<白茶茶多酚

圖6 茶多酚清除羥基自由基能力Figure 6 Hydroxyl radical scavenging ability of tea polyphenols

2.4.2 清除DPPH自由基能力

由圖7可知：綠茶茶多酚、白茶茶多酚以及Vc對DPPH最高清除率分別為：綠茶97.96%、白茶86.28%和Vc 36.17%。綠茶茶多酚、白茶茶多酚以及Vc對DPPH自由基清除率隨著濃度的增加而逐漸升高，當(dāng)綠茶茶多酚濃度達(dá)到75.00 μg/mL時，清除率增加逐漸變緩；白茶茶多酚濃度達(dá)100.00 μg/mL時，清除率增加而逐漸變緩；Vc的最大清除率遠(yuǎn)小于綠茶和白茶中茶多酚清除率，即茶多酚的抗氧化能力強(qiáng)于Vc。根據(jù)清除率擬合曲線，得到綠茶茶多酚、白茶茶多酚以及Vc對DPPH自由基的IC50分別為 47.53 μg/mL、69.55 μg/mL 和 156.12 μg/mL。比較可知，DPPH自由基的IC50大小順序為：綠茶茶多酚<白茶茶多酚

圖7 茶多酚清除DPPH自由基能力Figure 7 DPPH radical scavenging ability of tea polyphenols

2.4.3 總抗氧化能力

由圖8可知：在一定范圍內(nèi)，F(xiàn)RAP值隨茶多酚濃度增加而增大，樣品濃度與FRAP值呈正相關(guān)。相同濃度時，F(xiàn)RAP值越大代表物質(zhì)的總抗氧化能力越強(qiáng)。可見，綠茶和白茶中茶多酚的FRAP值遠(yuǎn)高于陽性對照Vc。因此，茶多酚的總抗氧化能力遠(yuǎn)強(qiáng)于Vc，并且綠茶總抗氧化能力強(qiáng)于白茶總抗氧化能力。

圖8 茶多酚總抗氧化能力Figure 8 Total antioxidant ability of tea polyphenols

3 結(jié)論與討論

本試驗采用超聲波輔助提取技術(shù)，通過單因素試驗和正交試驗，得到綠茶和白茶中茶多酚的最佳提取工藝為：綠茶超聲溫度60℃、料液比1∶50 g/mL、乙醇濃度70%、超聲時間110 min，白茶超聲溫度70℃、料液比1∶60 g/mL、乙醇濃度80%、超聲時間90 min。兩種茶葉中茶多酚的提取率分別為：綠茶19.68%，白茶12.07%。張素霞等利用超聲波輔助提取技術(shù)得到綠茶茶多酚的提取率為11.13%[16]。楊皓彬等采用水提法提取白茶中茶多酚，提取率為5.65%[13]。與張素霞、楊皓彬的提取工藝相比較，本試驗得出的最佳提取工藝均可更高效的提取出綠茶和白茶中的茶多酚。

抗氧化試驗中，對羥基自由基的IC50值分別為：綠茶茶多酚76.76 μg/mL、白茶茶多酚101.29 μg/mL 和 Vc 145.17 μg/mL；對 DPPH 自由基的IC50值分別為：綠茶茶多酚47.53 μg/mL、白茶茶多酚 69.55 μg/mL 和 Vc 156.12 μg/mL。比較可知，對羥基自由基和DPPH自由基的IC50值：綠茶茶多酚<白茶茶多酚