方仕茂，戴宇樵，楊 婷，田小強(qiáng)，田洪軍，劉忠英，潘 科*

1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，貴州 貴陽 550006；

2. 沿河土家族自治縣生態(tài)茶發(fā)展和技術(shù)指導(dǎo)中心，貴州 沿河 565300

沿河縣擁有豐富的古茶樹資源。2016年，中國(guó)茶葉流通協(xié)會(huì)授予沿河縣“中國(guó)古茶樹之鄉(xiāng)”稱號(hào)，全縣茶葉面積達(dá)1.33萬hm2[1]。根據(jù)已有古茶樹資源調(diào)查結(jié)果，該縣下轄思渠、黃土、新景、客田、塘壩、后坪和洪渡等8個(gè)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）35個(gè)村共有古茶樹4萬余株[2]。該地區(qū)古茶樹類型主要分為喬木型和灌木型[3]。不同樹型古茶樹鮮葉內(nèi)含成分具有一定差異[4-5]。目前沿河縣茶企利用古茶樹資源開發(fā)古樹紅茶、古樹綠茶和古樹白茶等產(chǎn)品，對(duì)部分古茶樹鮮葉加工技術(shù)進(jìn)行了探究[6-8]，但對(duì)縣域內(nèi)不同區(qū)域古茶樹鮮葉內(nèi)含成分及區(qū)域內(nèi)產(chǎn)品差異缺乏分析。

茶鮮葉中的多酚類與嘌呤類物質(zhì)是評(píng)估其適制性的重要物質(zhì)，同時(shí)也是影響茶葉色香味品質(zhì)形成的關(guān)鍵物質(zhì)[9-10]，多酚含量等指標(biāo)通常用于品種的選育[4]。古茶樹由于其樹齡及管護(hù)條件不同（如修剪等）呈現(xiàn)一定代謝差異[11]，且在基因表達(dá)方面亦有不同[12]。此外，不同季節(jié)茶樹新梢積累的多酚和嘌呤堿影響著茶葉的適制性；一般而言，夏茶或秋茶較春茶含有更高的酯型兒茶素和咖啡堿，制成相同的茶類其茶湯苦澀味更重。將夏秋茶鮮葉用于加工發(fā)酵類型茶類（如紅茶、黑茶或白茶等），可避免苦澀味重影響茶葉價(jià)值。古茶樹資源稀缺，古樹春茶產(chǎn)量有限，為提高資源利用程度，增加古茶樹產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)秋季灌木型古茶樹鮮葉加工紅茶品質(zhì)進(jìn)行評(píng)估十分必要。

本研究利用HPLC技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析不同樹型（喬木型和灌木型）、區(qū)域及季節(jié)的古茶樹茶鮮葉和干茶中多酚類、嘌呤類等物質(zhì)含量差異，以評(píng)估古茶樹鮮葉的紅茶適制性，可為沿河縣古茶樹資源的合理開發(fā)利用提供解決方案。

1 材料與方法

1.1 茶樣收集

2020年4月1 ～ 17日于后坪鄉(xiāng)和客田鎮(zhèn)收集喬木型一芽二葉鮮葉，于塘壩鎮(zhèn)和新景鎮(zhèn)收集灌木型一芽二葉鮮葉。每次從收集茶青中代表性扦取450 g，并均分3份，用鋁箔紙裝裹，浸入液氮5 min，隨后轉(zhuǎn)入干冰，保存于-80℃冰箱，直至真空冷凍干燥45 h。干茶為收集的部分古茶樹鮮葉經(jīng)萎凋、揉捻、發(fā)酵和干燥加工而成，生物學(xué)取樣3份，每份約250 g。同年9月20 ～ 23日收集沿河縣塘壩鎮(zhèn)秋季紅茶樣，加工和取樣方法與春茶取樣一致。所有樣品均經(jīng)研磨，過40目篩。

1.2 主要儀器與試劑

LC2030C Plus 高效液相色譜儀（日本Shimadzu公 司）， 配 備XBridge BEH C18 Column, 130?, 5μm, 4.6 mm×250 mm, 1/pkg 色譜柱（美國(guó)Waters公司）。乙腈和甲醇均為色譜級(jí)（美國(guó)Tedia公司）。沒食子酸（GA）、表沒食子兒茶素（EGC）、(+) -兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、咖啡堿（CAF）、綠原酸（CA）和可可堿（TB）標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Cato Research Chemicals Inc.）。茶黃素（TF1）、茶黃素-3-單沒食子酸酯（TF-3-G）、茶黃素-3'-單沒食子酸酯（TF-3'-G）和茶黃素-3,3'-雙沒食子酸酯（TFDG）（上海源葉生物技術(shù)公司）。乙腈、甲醇和乙酸（色譜級(jí)，美國(guó)Tedia公司）。

1.3 HPLC分析

兒茶素類、酚酸類和嘌呤堿類化合物提取、檢測(cè)基于GB/T 8313—2018方法執(zhí)行。茶黃素類化合物提取檢測(cè)基于GB/T 30483—2013方法執(zhí)行。繪制濃度（x軸）與同一保留時(shí)間的峰值面積（y軸）的關(guān)系，構(gòu)建每一單標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。總兒茶素（TCs）含量等于各兒茶素即C、GC、EGCG、GCG、EC、EGC、ECG含量之和。茶黃素類（TFs）含量等于TF1、TF-3-G、TF-3'-G和TFDG含量之和。

1.4 感官審評(píng)

參照GB/T 23776—2009進(jìn)行。審評(píng)人員5人，其中3女2男，均為貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所研究人員，且均具有高級(jí)審評(píng)員資格。

1.5 數(shù)據(jù)處理

色譜數(shù)據(jù)均基于LabSolutions工作站獲取，進(jìn)一步的分析和圖表可視化通過Excel、IBM SPSS Statistics和Origin 2017 64Bit軟件實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 不同樹型古茶樹茶鮮葉內(nèi)含成分差異

如圖1，喬木型古茶樹鮮葉中咖啡堿（41.04±3.62）和可可堿（4.31±0.47）含量均分別顯著高于灌木型的38.44±2.63 mg/g和3.22±0.97 mg/g。綠原酸和沒食子酸是茶葉中兩個(gè)典型的酚酸化合物，其含量在喬木和灌木鮮葉中的含量無顯著差異，值得注意的是在喬木鮮葉中綠原酸的組內(nèi)含量差異較大（2.73±0.79 mg/g）。

兒茶素是茶葉中含量最豐富的物質(zhì)[13]，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和貢獻(xiàn)的滋味特征不同，分酯型兒茶素和非酯型兒茶素[14]。檢測(cè)結(jié)果表明：?jiǎn)棠拘凸挪铇漉r葉中兒茶素總量為210.32±15.42 mg/g，灌木型為213.29±19.66 mg/g，p = 0.612。其中，喬木型古茶樹鮮葉中酯型和非酯型兒茶素分別為 169.49±9.88 mg/g和 40.82±6.21 mg/g， 而在灌木型古茶樹鮮葉中則分別為165.60±11.61 mg/g和47.69±8.88 mg/g。對(duì)比分析EGCG、ECG和GCG三個(gè)酯型兒茶素含量（圖1），灌木型古茶樹鮮葉中EGCG含量（128.71±9.33 mg/g）與ECG含量（34.61±4.60 mg/g）分別顯著高于喬木型古茶樹鮮葉（119.44±9.12 mg/g、25.71±4.26 mg/g），而GCG在喬木型古茶樹鮮葉中的含量（24.34±4.26 mg/g）則顯著高于灌木型古茶樹鮮葉（2.28±1.09 mg/g）。灌木型古茶樹鮮葉中非酯型兒茶素EGC與EC顯著高于喬木，C含量則相反，GC在兩種樹型鮮葉中差異明顯。

圖1 喬木型和灌木型茶樹鮮葉多酚和嘌呤類物質(zhì)的含量差異（獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，雙尾）Figure 1 Differences in the content of polyphenols and purines in fresh leaves of arbor type and shrub type tea trees （Independent samples t-test, two-tailed）

2.2 不同區(qū)域古樹紅茶內(nèi)含成分差異及品質(zhì)特征

對(duì)收集的新景鎮(zhèn)、客田鎮(zhèn)、后坪鄉(xiāng)和塘壩鎮(zhèn)的古樹紅茶樣中酚類和嘌呤類含量結(jié)合主成分方法進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分。如圖2D可知，基于19個(gè)化合物×69個(gè)樣品數(shù)據(jù)矩陣的主成分分析，共提取特征值大于1的有效主成分3個(gè)，其特征值分別為9.978、3.379和2.247（圖2D-b）。前三個(gè)主成分累計(jì)解釋方差大于82%，其中第一主成分PC1解釋方差為52.515%，第二主成分PC2=17.785%，第三主成分PC3=11.825%（圖2D-a）。由載荷圖2A、圖2B可知，PC1主要由茶黃素（正相關(guān)）和酯型兒茶素（負(fù)相關(guān)）貢獻(xiàn)，PC2則由非酯型兒茶素貢獻(xiàn)（圖2A中的圓點(diǎn)即陰影部分），PC3對(duì)于區(qū)域樣品的區(qū)分不明顯（圖2A、圖2B中的三角形）。由圖2C可知，沿河縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)由于古茶樹鮮葉加工的紅茶內(nèi)含成分存在差異，且后坪鄉(xiāng)和塘壩鎮(zhèn)紅茶樣得到明顯的區(qū)分。新景鎮(zhèn)的茶樣與塘壩鎮(zhèn)樣品接近，客田鎮(zhèn)的樣品則與后坪鄉(xiāng)的樣品聚類明顯。

圖2 主成分分析Figure 2 Principal component analysis

根據(jù)我們收集的樣品類型可以推測(cè)后坪鄉(xiāng)和客田鎮(zhèn)的古茶樹鮮葉為大葉種或形態(tài)學(xué)接近喬木，而新景鎮(zhèn)和塘壩鎮(zhèn)以灌木型為主，因此在鮮葉內(nèi)含成分上有一定差異（圖1）。其次，不同區(qū)域的加工工藝差異，或進(jìn)一步促進(jìn)不同區(qū)域古樹紅茶樣的內(nèi)含成分差異[15]，使得后坪鄉(xiāng)和塘壩鎮(zhèn)的古樹紅茶樣品在PC1上得到很好的區(qū)分，即后坪鄉(xiāng)的紅茶樣相較于塘壩鎮(zhèn)的紅茶樣含有更高的茶黃素類物質(zhì)和含量較少的酯型兒茶素。

2.3 不同季節(jié)古茶樹鮮葉紅茶適制性

咖啡堿是賦予茶湯苦澀味和收斂性的重要物質(zhì)[15]。由表2可知，咖啡堿含量在春、秋兩季的古樹紅茶中無差異（p＞0.05），但顯著高于當(dāng)季的福鼎大白茶品種制成的紅茶。已有研究表明，采用栽培型茶樹品種的春（36.558 ±5.024 mg/g）、夏（38.721 ± 6.059）茶鮮葉制成的綠茶的咖啡堿無顯著差異[16]，這可能是由于古茶樹與栽培種茶樹代謝差異導(dǎo)致的[19]，因此可推測(cè)灌木型古茶樹積累咖啡堿受不同季節(jié)影響較小，且咖啡堿積累代謝較栽培種茶樹強(qiáng)。

表2 春季和秋季古樹紅茶內(nèi)含成分差異（干重 mg/g）Table 2 Differences in the contents of ancient tree black tea in spring and autumn（dry weight mg/g）

春季古茶樹紅茶中非酯型兒茶素、酯型兒茶素、兒茶素總量和茶黃素總量顯著高于同季福鼎大白茶和秋季茶樣，進(jìn)一步的對(duì)比分析古茶樹秋茶的非酯型兒茶素和茶黃素總量與春茶沒有顯著差異，由于茶黃素對(duì)于紅茶茶湯的色澤和豐富度貢獻(xiàn)較大[17]，秋茶在茶湯湯色豐富度方面與春茶接近（表3）。此外，古茶樹秋茶酯型兒茶素（16.72±0.16 mg/g）顯著低于古茶樹春茶（44.20±10.74 mg/g），這與已有的夏秋季鮮葉酯型兒茶素積累較春茶多的研究報(bào)道不一致[15,18]。感官審評(píng)結(jié)果表明，夏秋古茶樹鮮葉加工的紅茶滋味特征與春茶均表現(xiàn)為甜醇等特點(diǎn)，無明顯的苦澀味。值得注意的是，古茶樹春茶中由于取樣數(shù)量較多（7次加工收集樣品），組內(nèi)差異較大，導(dǎo)致數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，從而使得部分組間比較結(jié)果差異不明顯或明顯。總而言之，試驗(yàn)結(jié)果表明，夏秋古茶樹鮮葉具有潛在的利用價(jià)值，但仍需進(jìn)一步評(píng)估春、秋季紅茶鮮味物質(zhì)和香氣特征。

表3 春、秋季節(jié)灌木型古樹紅茶感官審評(píng)Table 3 Sensory evaluation results of shrub type ancient tree black tea in spring and autumn

3 結(jié)論和討論

沿河縣古茶樹資源豐富，資源利用潛力大。但由于該縣域內(nèi)古茶樹分布廣，各區(qū)域品質(zhì)差異較大。此外，由于樹型差異，茶鮮葉質(zhì)量不均勻，限制了資源的開發(fā)利用。本研究明確了喬木型和灌木型古茶樹鮮葉中的多酚類和嘌呤堿類物質(zhì)的代謝差異特點(diǎn)，并以灌木型古茶樹鮮葉加工紅茶探究不同區(qū)域紅茶的品質(zhì)特征，對(duì)比分析了不同季節(jié)加工成的紅茶品質(zhì)差異。

大尺度區(qū)域條件下古茶樹資源的品質(zhì)成分分析已得到報(bào)道[5,19]，同時(shí)從基因水平分析古茶樹的代謝特點(diǎn)[12]。由于古茶樹的樹齡及環(huán)境影響，使得其代謝特征與栽培中有所差異[20]。此外，古茶樹在不同季節(jié)的代謝物變化與栽培種亦有差異，研究表明栽培種在春、夏、秋三季的苦澀類物質(zhì)增加，而鮮味物質(zhì)減少[17]。本研究結(jié)果表明，古茶樹鮮葉酯型兒茶素和咖啡堿等物質(zhì)隨著季節(jié)變化不顯著。加工是影響古茶樹品質(zhì)的另一重要因素，通過合適的加工方式可以重塑茶葉產(chǎn)品品質(zhì)，因而可以規(guī)避不同茶鮮葉品質(zhì)、區(qū)域以及季節(jié)影響，實(shí)現(xiàn)品質(zhì)保障。對(duì)古茶樹資源的適制性評(píng)估，僅從多酚及嘌呤類含量評(píng)估是不完備的，還需評(píng)估古茶樹中游離氨基酸、糖類及揮發(fā)性物質(zhì)等在不同樹型、區(qū)域和季節(jié)的差異，同時(shí)還需系統(tǒng)評(píng)估加工因素對(duì)其品質(zhì)的影響。