蔡 翔，胡桂萍，王禮獻，楊普香

江西省蠶桑茶葉研究所/江西省茶葉質(zhì)量與安全控制重點實驗室，江西 南昌 330202

江西省茶產(chǎn)業(yè)歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，茶葉品質(zhì)優(yōu)良，據(jù)資料統(tǒng)計已有地方品種多達三百個，主要分布于贛中北、贛西北、贛中和贛南區(qū)域[1]，如婺源縣已記載的地方品種就有86個。但截至目前，江西省茶葉地理標(biāo)志產(chǎn)品只有4個，為狗牯腦茶、廬山云霧茶、瑤里嫩蕊和婺源綠茶[2]。究其原因，主要是茶樹資源收集與保藏等工作底子薄、起步晚，茶樹資源遺傳評價也未形成全面信息，直接影響了地方優(yōu)良茶樹品種的開發(fā)和利用。

現(xiàn)有研究表明植物資源遺傳評價主要通過形態(tài)學(xué)水平、細胞學(xué)水平、生理生化水平和DNA分子水平[3]，但主要以DNA分子水平分析遺傳多樣性居多。常用的分子標(biāo)記技術(shù)有SSR、AFLP、ISSR，RFLP和SNP等，其中SSR標(biāo)記技術(shù)比較成熟，具有操作簡單、穩(wěn)定性好、高度重復(fù)性和多態(tài)性好等優(yōu)點，已經(jīng)在水稻[4-5]、菜心[6]及大豆[7-8]等農(nóng)作物的研究中應(yīng)用廣泛，也在茶樹遺傳多樣性分析中得到大范圍應(yīng)用[9-10]。如王麗鴛等[11]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了西湖龍井群體的91個單株的遺傳多樣性；王旭等[12]基于33對SSR引物標(biāo)記分析了84個茶樹品種的遺傳多樣性。但對江西茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的研究鮮見報道，尤其是利用SSR標(biāo)記分析江西茶樹種質(zhì)資源多樣性未見報道。

茶樹品種是茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，近年來江西茶產(chǎn)業(yè)受到高度重視，進行茶樹品種選育已成為當(dāng)前江西茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要研究方向。本研究擬采用SSR標(biāo)記對江西贛東北茶樹種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，以期為江西茶樹新品種的改良、培育和評價等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試的17個茶樹樣品（表1）采自江西省蠶桑茶葉研究所，春季采摘無病蟲害感染的新葉，存于-70℃冰箱中，放入冰箱前用液氮迅速冷凍，后續(xù)試驗備用。

表1 樣品編號、名稱及原產(chǎn)地Table 1 Number, name and origin of samples

1.2 DNA的提取

基因組DNA提取的方法參考黃建安等[13]改進的CTAB法，其完整性用濃度為2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度（OD260 /280比值），并稀釋至20 ng/μL保存于-20℃冰箱，用于后續(xù)PCR擴增。

1.3 SSR引物合成

隨機選擇40條SSR引物，SSR引物參照楊陽等[14]、Fang等[15]和Ma等[16]引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。選用上梅州、大面白、楮葉齊、福鼎大白、鳳凰水仙、贛茶2號6份不同省份和差異較大的基因組DNA對上述合成引物進行多態(tài)性篩選，選擇多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、條帶清晰的核心引物進行資源的多樣性分析。

熒光標(biāo)記引物（FAM）（5'-CACGACGTTGT AAAACGAC-3'），統(tǒng)一在正向引物（L）的5'端加上與熒光標(biāo)記引物（FAM）一樣的序（CACGACGTTGTAAAACGAC）（表2），均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 9對SSR引物及其序列Table 2 Nine pairs of SSR primers and their sequences

1.4 PCR擴增和產(chǎn)物鑒定

PCR擴增在熱循環(huán)儀（ABI Veriti 96）上進行，PCR擴增反應(yīng)總體積為10 μL：其中包括5 μL 2×TaqPCRMasterMix（包含dNTPs, Taq聚合酶 , MgCl2等）、0.1 μL 10 μmol的 M13-tailed 正向引物、0.3 μL 10 μmol的熒光標(biāo)記引物（FAM）、0.4 μL 10 μmol的反向引物、2 μL DNA 模板和2.2 μLddH2O。PCR擴增反應(yīng)程序為：94℃，4 min；10個循環(huán)：94℃，45 s；63℃，30 s；72℃，30 s；25個循環(huán)：94℃，45 s；53℃，30 s；72℃，30 s；72℃，10 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物寄到上海派森諾生物科技有限公司進行毛細管凝膠電泳，所用儀器為ABI 3700xl DNA Analyzers （Applied Biosystems, 美國），使用GS-500LIZ （Applied Biosystems, 美國）作為內(nèi)標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用人工讀帶的方法，以分子量大小按照A、B、C、D等依次記錄目標(biāo)條帶內(nèi)清晰的條帶。利用POPGENE軟件分析不同引物在17個茶樹品種中擴增的等位基因數(shù)（Observed number of alleles, Na）、有效等位基因（Effective of alleles, Ne）、觀測雜合度（Observed heterozygosity, Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosity, He） 及 Shannon信息指數(shù)（Shannon’s informationindex, I）。通過PowerMarker分析主要等位基因頻率（Majorallele frequency）、基因型數(shù)（Genotype）和多態(tài)性信息量（polymorphisminformation content, PIC），再計算17個品種間的Nei’s遺傳距離，基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建 Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)進化樹，進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹資源的SSR多態(tài)性

40對SSR引物在6份資源中共篩選到9對擴增多態(tài)性較好的核心引物（表2）。9對引物在17份資源中的擴增情況見表3，共擴增出32個等位基因（Na），每對引物最多擴增5個，最少的2個；有效等位基因（Ne）平均值為2.89，變異范圍為1.49 ～ 3.98；共檢測到52個基因型，其范圍在3 ～ 10個；引物的觀測雜合度（Ho）為0.06（TM83） ～ 0.94（TM49）；期望雜合度（He）最大值為0.79（TM107），最小值為0.34（TM83）,平均值為0.62；Shannon信息指數(shù)（I）為0.51 ～ 1.49 ，平均值為1.08；多態(tài)性信息含量（PIC）變異范圍為0.31 ～ 0.73，平均值為0.54，其中PIC值最高的是引物TM107。PIC≥0.50的引物有6個，占多態(tài)性引物總數(shù)的2/3，表明總體上這些引物多態(tài)性情況良好。

表3 17個參試茶樹品種SSR標(biāo)記的擴增結(jié)果Table 3 Amplification information of SSR markers in 17 tested tea cultivars

2.2 茶樹品種親緣關(guān)系分析

根據(jù)篩選出的9對多態(tài)性引物擴增譜帶，分析等位基因出現(xiàn)頻率，并根據(jù)其計算Nei's遺傳距離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)17個茶樹品種的遺傳距離在0.14 ～ 0.78，其中鉛山群體D和婺茶8號之間的遺傳距離最大，鉛山群體A和江茶97號、鉛山群體B和鉛山群體C的遺傳距離最小（表4）。

表4 參試茶樹品種間的Nei's遺傳距離Table 4 Nei's genetic distance among the tested tea cultivars

基于Nei's遺傳距離，采用NJ法繪制17個品種的聚類圖（圖1）。當(dāng)D = 0.19時，17個茶樹品種基本可以分成4類，第Ⅰ類包括江茶97號和婺茶1號等9個茶樹品種，4個鉛山群體樣品和天柱山鄉(xiāng)群體都聚到了一起，但是同樣來自鉛山的桐木關(guān)群體和道士坑群體是聚類在第Ⅱ類，說明來源于同一地方相同的品種不完全都是親緣關(guān)系較近；第Ⅱ類包含鉛山縣武夷山鎮(zhèn)西坑鄉(xiāng)桐木關(guān)群體、鉛山縣武夷山鎮(zhèn)西坑鄉(xiāng)道士坑群體、贛茶2號和婺源6號4個品種；第Ⅲ類包含江茶3號、婺茶14號和浮梁群體3個品種；第Ⅳ類僅有一個品種婺茶8號。

圖1 基于Nei's遺傳距離茶樹品種的聚類Figure 1 Neighbor-Joining dendrogram of 17 tested tea cultivars based on Nei's genetic distance

3 討論

為了準(zhǔn)確評估江西東北茶樹資源的遺傳多樣性，本研究選用不同省份的6個國家級茶樹良種，經(jīng)過PCR擴增與譜帶分析，篩選出了多態(tài)性豐富且穩(wěn)定的核心引物9對，每對引物的等位位點數(shù)都小于5或者等于5，平均值為3.56。本實驗擴增產(chǎn)物寄到上海派森諾生物科技有限公司進行毛細管凝膠電泳檢測，較之前使用的瓊脂糖凝膠電泳具有更高效、分辨率更高等優(yōu)點。毛細管凝膠電泳檢測可以顯示擴增產(chǎn)物片段的大小，對產(chǎn)物檢測的準(zhǔn)確性更高，實現(xiàn)了數(shù)據(jù)處理的自動化[17]。毛細管電泳技術(shù)檢測SSR熒光標(biāo)記擴增產(chǎn)物已有報道運用于茶樹品種的多樣性分析上[18]。

參試的17個樣品都產(chǎn)自江西省贛東北。其中鉛山群體A、鉛山群體B、鉛山群體C、鉛山群體D、天柱山鄉(xiāng)群體、道士坑群體和桐木關(guān)群體原產(chǎn)地是鉛山；婺茶1號、婺茶8號、婺茶14號、婺源6號、江茶3號、江茶97號、江茶94號和贛茶2號原產(chǎn)地是婺源；浮梁廣明和浮梁群體原產(chǎn)地是景德鎮(zhèn)。贛茶2號是國家級品種，原名鄣科1號，由江西省婺源縣茶葉科學(xué)研究所從福鼎大白茶與婺源種自然雜交后代中選育出來的。從聚類圖可以看出，贛茶2號與婺源6號、桐木關(guān)群體和道士坑群體樣品聚為一類，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，因此原產(chǎn)地婺源的婺源6號與贛茶2號可能有著相同或相近的親本 。

從SSR多態(tài)性分析結(jié)果來看，多態(tài)性信息含量（PIC）變化范圍較大，在0.31 ～ 0.73；基于Nei’s遺傳距離茶樹品種的聚類圖得出同一縣城的茶樹品種并不完全聚類到一類，說明相似環(huán)境選育的茶樹品種，由于異花授粉和長期的引種馴化，使得群體資源的遺傳背景復(fù)雜，江西省贛東北茶樹種質(zhì)資源具有相對豐富的遺傳多樣性。