蔡 翔，胡桂萍，王禮獻(xiàn)，楊普香

江西省蠶桑茶葉研究所/江西省茶葉質(zhì)量與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330202

江西省茶產(chǎn)業(yè)歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，茶葉品質(zhì)優(yōu)良，據(jù)資料統(tǒng)計(jì)已有地方品種多達(dá)三百個(gè)，主要分布于贛中北、贛西北、贛中和贛南區(qū)域[1]，如婺源縣已記載的地方品種就有86個(gè)。但截至目前，江西省茶葉地理標(biāo)志產(chǎn)品只有4個(gè)，為狗牯腦茶、廬山云霧茶、瑤里嫩蕊和婺源綠茶[2]。究其原因，主要是茶樹(shù)資源收集與保藏等工作底子薄、起步晚，茶樹(shù)資源遺傳評(píng)價(jià)也未形成全面信息，直接影響了地方優(yōu)良茶樹(shù)品種的開(kāi)發(fā)和利用。

現(xiàn)有研究表明植物資源遺傳評(píng)價(jià)主要通過(guò)形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞學(xué)水平、生理生化水平和DNA分子水平[3]，但主要以DNA分子水平分析遺傳多樣性居多。常用的分子標(biāo)記技術(shù)有SSR、AFLP、ISSR，RFLP和SNP等，其中SSR標(biāo)記技術(shù)比較成熟，具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、高度重復(fù)性和多態(tài)性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在水稻[4-5]、菜心[6]及大豆[7-8]等農(nóng)作物的研究中應(yīng)用廣泛，也在茶樹(shù)遺傳多樣性分析中得到大范圍應(yīng)用[9-10]。如王麗鴛等[11]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了西湖龍井群體的91個(gè)單株的遺傳多樣性；王旭等[12]基于33對(duì)SSR引物標(biāo)記分析了84個(gè)茶樹(shù)品種的遺傳多樣性。但對(duì)江西茶樹(shù)種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，尤其是利用SSR標(biāo)記分析江西茶樹(shù)種質(zhì)資源多樣性未見(jiàn)報(bào)道。

茶樹(shù)品種是茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，近年來(lái)江西茶產(chǎn)業(yè)受到高度重視，進(jìn)行茶樹(shù)品種選育已成為當(dāng)前江西茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要研究方向。本研究擬采用SSR標(biāo)記對(duì)江西贛東北茶樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為江西茶樹(shù)新品種的改良、培育和評(píng)價(jià)等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試的17個(gè)茶樹(shù)樣品（表1）采自江西省蠶桑茶葉研究所，春季采摘無(wú)病蟲(chóng)害感染的新葉，存于-70℃冰箱中，放入冰箱前用液氮迅速冷凍，后續(xù)試驗(yàn)備用。

表1 樣品編號(hào)、名稱(chēng)及原產(chǎn)地Table 1 Number, name and origin of samples

1.2 DNA的提取

基因組DNA提取的方法參考黃建安等[13]改進(jìn)的CTAB法，其完整性用濃度為2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度（OD260 /280比值），并稀釋至20 ng/μL保存于-20℃冰箱，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

1.3 SSR引物合成

隨機(jī)選擇40條SSR引物，SSR引物參照楊陽(yáng)等[14]、Fang等[15]和Ma等[16]引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。選用上梅州、大面白、楮葉齊、福鼎大白、鳳凰水仙、贛茶2號(hào)6份不同省份和差異較大的基因組DNA對(duì)上述合成引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，選擇多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、條帶清晰的核心引物進(jìn)行資源的多樣性分析。

熒光標(biāo)記引物（FAM）（5'-CACGACGTTGT AAAACGAC-3'），統(tǒng)一在正向引物（L）的5'端加上與熒光標(biāo)記引物（FAM）一樣的序（CACGACGTTGTAAAACGAC）（表2），均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 9對(duì)SSR引物及其序列Table 2 Nine pairs of SSR primers and their sequences

1.4 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物鑒定

PCR擴(kuò)增在熱循環(huán)儀（ABI Veriti 96）上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為10 μL：其中包括5 μL 2×TaqPCRMasterMix（包含dNTPs, Taq聚合酶 , MgCl2等）、0.1 μL 10 μmol的 M13-tailed 正向引物、0.3 μL 10 μmol的熒光標(biāo)記引物（FAM）、0.4 μL 10 μmol的反向引物、2 μL DNA 模板和2.2 μLddH2O。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，4 min；10個(gè)循環(huán)：94℃，45 s；63℃，30 s；72℃，30 s；25個(gè)循環(huán)：94℃，45 s；53℃，30 s；72℃，30 s；72℃，10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物寄到上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳，所用儀器為ABI 3700xl DNA Analyzers （Applied Biosystems, 美國(guó)），使用GS-500LIZ （Applied Biosystems, 美國(guó)）作為內(nèi)標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用人工讀帶的方法，以分子量大小按照A、B、C、D等依次記錄目標(biāo)條帶內(nèi)清晰的條帶。利用POPGENE軟件分析不同引物在17個(gè)茶樹(shù)品種中擴(kuò)增的等位基因數(shù)（Observed number of alleles, Na）、有效等位基因（Effective of alleles, Ne）、觀測(cè)雜合度（Observed heterozygosity, Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosity, He） 及 Shannon信息指數(shù)（Shannon’s informationindex, I）。通過(guò)PowerMarker分析主要等位基因頻率（Majorallele frequency）、基因型數(shù)（Genotype）和多態(tài)性信息量（polymorphisminformation content, PIC），再計(jì)算17個(gè)品種間的Nei’s遺傳距離，基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建 Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)資源的SSR多態(tài)性

40對(duì)SSR引物在6份資源中共篩選到9對(duì)擴(kuò)增多態(tài)性較好的核心引物（表2）。9對(duì)引物在17份資源中的擴(kuò)增情況見(jiàn)表3，共擴(kuò)增出32個(gè)等位基因（Na），每對(duì)引物最多擴(kuò)增5個(gè)，最少的2個(gè)；有效等位基因（Ne）平均值為2.89，變異范圍為1.49 ～ 3.98；共檢測(cè)到52個(gè)基因型，其范圍在3 ～ 10個(gè)；引物的觀測(cè)雜合度（Ho）為0.06（TM83） ～ 0.94（TM49）；期望雜合度（He）最大值為0.79（TM107），最小值為0.34（TM83）,平均值為0.62；Shannon信息指數(shù)（I）為0.51 ～ 1.49 ，平均值為1.08；多態(tài)性信息含量（PIC）變異范圍為0.31 ～ 0.73，平均值為0.54，其中PIC值最高的是引物TM107。PIC≥0.50的引物有6個(gè)，占多態(tài)性引物總數(shù)的2/3，表明總體上這些引物多態(tài)性情況良好。

表3 17個(gè)參試茶樹(shù)品種SSR標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Amplification information of SSR markers in 17 tested tea cultivars

2.2 茶樹(shù)品種親緣關(guān)系分析

根據(jù)篩選出的9對(duì)多態(tài)性引物擴(kuò)增譜帶，分析等位基因出現(xiàn)頻率，并根據(jù)其計(jì)算Nei's遺傳距離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)17個(gè)茶樹(shù)品種的遺傳距離在0.14 ～ 0.78，其中鉛山群體D和婺茶8號(hào)之間的遺傳距離最大，鉛山群體A和江茶97號(hào)、鉛山群體B和鉛山群體C的遺傳距離最小（表4）。

表4 參試茶樹(shù)品種間的Nei's遺傳距離Table 4 Nei's genetic distance among the tested tea cultivars

基于Nei's遺傳距離，采用NJ法繪制17個(gè)品種的聚類(lèi)圖（圖1）。當(dāng)D = 0.19時(shí)，17個(gè)茶樹(shù)品種基本可以分成4類(lèi)，第Ⅰ類(lèi)包括江茶97號(hào)和婺茶1號(hào)等9個(gè)茶樹(shù)品種，4個(gè)鉛山群體樣品和天柱山鄉(xiāng)群體都聚到了一起，但是同樣來(lái)自鉛山的桐木關(guān)群體和道士坑群體是聚類(lèi)在第Ⅱ類(lèi)，說(shuō)明來(lái)源于同一地方相同的品種不完全都是親緣關(guān)系較近；第Ⅱ類(lèi)包含鉛山縣武夷山鎮(zhèn)西坑鄉(xiāng)桐木關(guān)群體、鉛山縣武夷山鎮(zhèn)西坑鄉(xiāng)道士坑群體、贛茶2號(hào)和婺源6號(hào)4個(gè)品種；第Ⅲ類(lèi)包含江茶3號(hào)、婺茶14號(hào)和浮梁群體3個(gè)品種；第Ⅳ類(lèi)僅有一個(gè)品種婺茶8號(hào)。

圖1 基于Nei's遺傳距離茶樹(shù)品種的聚類(lèi)Figure 1 Neighbor-Joining dendrogram of 17 tested tea cultivars based on Nei's genetic distance

3 討論

為了準(zhǔn)確評(píng)估江西東北茶樹(shù)資源的遺傳多樣性，本研究選用不同省份的6個(gè)國(guó)家級(jí)茶樹(shù)良種，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增與譜帶分析，篩選出了多態(tài)性豐富且穩(wěn)定的核心引物9對(duì)，每對(duì)引物的等位位點(diǎn)數(shù)都小于5或者等于5，平均值為3.56。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物寄到上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)，較之前使用的瓊脂糖凝膠電泳具有更高效、分辨率更高等優(yōu)點(diǎn)。毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)可以顯示擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小，對(duì)產(chǎn)物檢測(cè)的準(zhǔn)確性更高，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)處理的自動(dòng)化[17]。毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)SSR熒光標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物已有報(bào)道運(yùn)用于茶樹(shù)品種的多樣性分析上[18]。

參試的17個(gè)樣品都產(chǎn)自江西省贛東北。其中鉛山群體A、鉛山群體B、鉛山群體C、鉛山群體D、天柱山鄉(xiāng)群體、道士坑群體和桐木關(guān)群體原產(chǎn)地是鉛山；婺茶1號(hào)、婺茶8號(hào)、婺茶14號(hào)、婺源6號(hào)、江茶3號(hào)、江茶97號(hào)、江茶94號(hào)和贛茶2號(hào)原產(chǎn)地是婺源；浮梁廣明和浮梁群體原產(chǎn)地是景德鎮(zhèn)。贛茶2號(hào)是國(guó)家級(jí)品種，原名鄣科1號(hào)，由江西省婺源縣茶葉科學(xué)研究所從福鼎大白茶與婺源種自然雜交后代中選育出來(lái)的。從聚類(lèi)圖可以看出，贛茶2號(hào)與婺源6號(hào)、桐木關(guān)群體和道士坑群體樣品聚為一類(lèi)，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，因此原產(chǎn)地婺源的婺源6號(hào)與贛茶2號(hào)可能有著相同或相近的親本 。

從SSR多態(tài)性分析結(jié)果來(lái)看，多態(tài)性信息含量（PIC）變化范圍較大，在0.31 ～ 0.73；基于Nei’s遺傳距離茶樹(shù)品種的聚類(lèi)圖得出同一縣城的茶樹(shù)品種并不完全聚類(lèi)到一類(lèi)，說(shuō)明相似環(huán)境選育的茶樹(shù)品種，由于異花授粉和長(zhǎng)期的引種馴化，使得群體資源的遺傳背景復(fù)雜，江西省贛東北茶樹(shù)種質(zhì)資源具有相對(duì)豐富的遺傳多樣性。