劉立立，楊進威，姜如云，姜玉梅，李永春，李磊

（河南農業(yè)大學農學院／河南農業(yè)大學國家小麥工程技術研究中心，河南 鄭州 450046）

MicroRNAs（miRNAs）是由21～24個核苷酸（nts）組成的具有重要調節(jié)功能的非編碼小RNA分子［1，2］。隨著近年來高通量測序技術的發(fā)展改進，越來越多的miRNAs被識別鑒定出來。研究表明，miRNAs不僅可以調節(jié)植物的生長發(fā)育和生理過程，在逆境脅迫過程中也發(fā)揮調節(jié)作用［3，4］。因此，探究miRNAs在植物生長發(fā)育過程中的作用機制和逆境響應機制對研究開發(fā)植物潛力有著重要意義。

大量研究發(fā)現(xiàn)，miR396在不同物種生長發(fā)育與逆境脅迫響應過程中發(fā)揮重要的作用。水稻中osa－miR396通過調節(jié)靶基因GRF對水稻產量以及籽粒大小產生影響［5］。大豆中gma－miR396與GRF之間調控的穩(wěn)態(tài)關系對其根的生長發(fā)育發(fā)揮著重要作用［6］。在擬南芥中ath－miR396通過與其他miRNAs相互作用共同參與溫度、干旱等非生物脅迫過程［7］。在匍匐剪股穎中過表達osa－miR396c，結果引起剪股穎株型發(fā)生改變進而提高植株對非生物脅迫的抗性［8］。同時發(fā)現(xiàn)在棉花［9］、擬南芥［7］等植物中，miR168、miR171、miR396等miRNAs通過轉錄后調控來響應溫度、干旱脅迫過程，這為miRNAs在極端溫度下的作用提供了新的認識。然而目前在小麥中taemiR396介導的非生物應激反應機制尚不明確。本研究著重分析tae－miR396b的染色體位置、序列特征、時空表達及其對逆境脅迫的響應模式，為明確tae－miR396b在小麥生長發(fā)育及非生物脅迫響應過程中的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

小麥不同組織材料及處理：選取在大田條件下正常生長的中國春（CS）、京841（J841）、豫麥18（YM18）、鄭麥004（ZM004）和矮抗58（AK58）成熟的種子和揚花期的穗下節(jié)、旗葉、節(jié)間、節(jié)，于－80℃中保存?zhèn)溆?；選取籽粒飽滿的上述品種的干種子，利用1.5%的H2O2表面消毒10 min，用滅菌水清洗后，擺放于玻璃培養(yǎng)皿中在光照培養(yǎng)箱（光照強度為240 mmol·m－2·s－1，25℃條件下光照16 h，18℃下黑暗8 h）內培養(yǎng)，待小麥長到二葉一心時取根系和葉片，液氮速凍后于－80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

高低溫脅迫材料及處理：選取豫麥18和京841飽滿種子，表面消毒后擺放入玻璃培養(yǎng)皿中，在光照培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待小麥長到二葉一心時，將麥苗分別轉至4℃和42℃的恒溫光照培養(yǎng)箱中進行模擬高低溫脅迫處理；分別在處理0、0.5、1、2、6、12、24 h和48 h時取根系、葉片和莖尖組織，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生物信息學分析

利用miRBase數(shù)據庫（http：／／www.mirbase.org／）對不同物種miR396的信息進行檢索；利用Ensembl Plants（http：／／plants.ensembl.org／Triticum_aestivum／Info／Index）數(shù)據庫，對miR396的染色體進行定位分析；利用RNA Folding Form（http：／／unafold.rna.albany.edu／？q＝mfold／rnafolding－form），對pre－miR396b序列的莖環(huán)結構進行預測分析；利用Plant CARE（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／plantcare／html／），對miRNA上游區(qū)域中的啟動子元件進行預測分析；利用Primer premier 5.0軟件設計引物。

1.3 RNA的提取和TaMIR396b片段克隆

組織材料的RNA提取按照TransZol試劑盒（全式金，北京）說明書操作進行；籽粒材料的RNA提取按照TransZol Plant試劑盒（全式金，北京）說明書操作進行。

RNA質量檢測：將提取的總RNA利用瓊脂糖凝膠電泳技術檢測其質量，利用紫外分光光度計測量其濃度，將檢測到的完整的RNA用于下一步反轉錄。

RNA的反轉錄：用于克隆TaMIR396b基因的cDNA，按照FastKing RT Kit With gDNase（天根，北京）的說明書進行反轉錄；用于tae－miR396b表達特性分析的cDNA的反轉錄，按照TransScript?miRNA First－Strand cDNA Synthesis Super-Mix試劑盒（全式金，北京）的說明書進行反轉錄。合成得到的cDNA于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

TaMIR396b片段克?。阂陨鲜龇崔D錄得到的cDNA作為模板，通過引物L01和L02（表1）克隆TaMIR396b片段，對克隆得到產物進行跑膠檢測，將目的片段切膠回收、連接轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單克隆，通過A、B基因組特異引物L03、L04（表1）對重組克隆進行鑒定，挑選與目的條帶大小一致的單克隆，送公司測序分析。

表1 RT－PCR及qRT－PCR引物

1.4 表達特性分析

以上述cDNA作為模板，U6作為內參基因（表1），qRT－PCR體系及程序按照TransStart?Top Green qPCR SuperMix（全式金，北京）說明書進行。qRT－PCR反應程序（兩步法進行）：預變性94℃2 min；變性94℃5 s；退火／延伸60℃10 s；熔解曲線：65～95℃（0.5℃／s，5 s）。反應設置40個循環(huán)進行。qRT－PCR 得到數(shù)據，通過2－△△Ct法計算，用Microsoft Excel作圖分析。

2 結果與分析

2.1 tae－miR396b序列特征分析

通過miRBase數(shù)據庫獲得不同物種中miR396b的成熟序列，序列對比分析結果顯示，不同物種間成熟的miR396b序列高度一致（圖1A），因此該miRNA高度保守，推測其功能可能也具有保守性。利用 EnsemblPlants對 taemiR396b的成熟序列進行基因組對比分析，結果將tae-miR396b定位于第6號染色體的長臂上；通過 NCBI（https：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）進行TaMIR396b的3個部分同源基因序列對比分析，結果表明，3個同源基因部分一致性較高，與6AL序列相比，6BL和6DL的序列一致性分別為90%和95%，且3個同源基因間存在SNP和InDel差異（圖1B）。

通過PlantCARE 網站對TaMIR396b上游2 000 bp的區(qū)域進行啟動子預測分析，結果表明，上游啟動子區(qū)域包含有TATA－box轉錄起始位點、MYB鹽脅迫啟動子元件、MYC抗寒性啟動子功能元件、水楊酸順式響應元件、ABRE脫落酸響應元件、ARE抗氧化調節(jié)元件、G－box和Sp1光響應順式元件、CCGTCC－motif分生組織表達元件、LTR低溫響應元件、GT1－motif光響應元件、RY－element種子特異相關元件等多個調控元件（圖1C）。

圖1 TaMIR396b序列特征分析

2.2 TaMIR396b基因的克隆

通過設計引物L01和L02從中國春、豫麥18和京841的cDNA中分別擴增獲得TaMIR396b基因片段，長度在192 bp左右（圖2A）。將克隆得到的TaMIR396b片段進行回收測序，測序結果利用APE軟件進行序列分析，結果（圖2B）顯示，3個品種間存在SNP和InDel差異，在第47、52、86、88、94、116個核苷酸位置處豫麥18和京841中分別存在1個SNP差異，在77、82個核苷酸位置處存在 InDel差異。將測序結果正確的TaMIR396b序列利用RNA Folding Form網站進行二級結構預測分析，結果（圖2C）表明A、B和D同源基因均能形成特定的莖環(huán)結構。

圖2 TaMIR396b基因的克隆及序列特征分析

2.3 小麥tae－miR396b的組織表達特性

通過對tae－miR396b在5個品種不同組織中的表達模式分析（圖3）表明，tae－miR396b在不同組織中均有表達，但不同組織間的相對表達量存在較大差異，比如，節(jié)間中相對表達量均較高，旗葉中相對表達量均較低。tae－miR396b在5個品種間相對表達量也存在差異，在種子和穗下節(jié)中差異較大。在京841和矮抗58的節(jié)間、穗下節(jié)和節(jié)中，tae－miR396b的相對表達量顯著高于豫麥18、鄭麥004和中國春；在京841和矮抗58的成熟種子中，tae－miR396b的相對表達量顯著低于豫麥18、鄭麥004和中國春。taemiR396b的相對表達量在不同品種間表達存在較大差異，可能與品種發(fā)育特性相關。總體來看，tae－miR396b在5個品種的不同組織中相對表達量均存在差異，推測tae－miR396b在小麥生長發(fā)育過程中發(fā)揮調控作用。

圖3 tae－miR396b的組織表達特性分析

2.4 小麥tae－miR396b對高低溫脅迫的響應

在4℃低溫脅迫下（圖4A、4B和4C），taemiR396b在豫麥18和京841中均表現(xiàn)出受低溫脅迫誘導先上調表達而后下調表達的變化趨勢，但兩個品種不同器官間tae－miR396b的表達水平和動態(tài)趨勢存在較大差異。豫麥18和京841葉片中（圖4A），tae－miR396b在脅迫后表達迅速上調，1 h時達到峰值，后下調表達，兩品種均出現(xiàn)上調下降波動。與京841相比，taemiR396b在豫麥18中的表達變化幅度較大，整體來看，豫麥18葉片中該miRNA對低溫脅迫的響應要比京841更快，這可能與豫麥18具有弱春性有關。豫麥18莖尖中（圖4B），tae－miR396b受脅迫1 h后出現(xiàn)快速表達上調，2 h時達到峰值，后表達下調；而京841莖尖中，tae－miRNA則整體表現(xiàn)先緩慢上調表達，12 h達到最高，然后表達下調。根系中（圖4C），京 841的 taemiR396b在脅迫2 h后快速上調表達，6 h時達到峰值，而后迅速下調表達；而在豫麥18中先迅速上調表達，并且分別在0.5 h和6 h出現(xiàn)表達峰值，而后表達下調。該miRNA在葉片、莖尖和根系中表現(xiàn)出相似的表達模式，推測tae－miR396b在小麥低溫脅迫過程中發(fā)揮著一定的作用。

42℃高溫脅迫下，豫麥18和京841葉片中tae－miR396b的表達水平出現(xiàn)先短暫下調表達然后上調表達而后下調表達的變化趨勢，24 h后，豫麥18的tae－miR396b表達趨于平穩(wěn)，而京841又快速上調表達（圖4D）。兩品種莖尖中（圖4E），tae－miR396b在豫麥18中整體表現(xiàn)為受高溫脅迫先表達上調，0.5 h達到峰值而后下調表達，變化趨勢趨于平穩(wěn)；京841中，tae－miR396b表達變化趨勢較大，出現(xiàn)先上調后下調表達然后上調后下調再上調表達的變化趨勢，與豫麥18相比，京841中該miRNA對高溫脅迫處理的響應更加強烈。京841和豫麥18的根系中（圖4F），taemiR396b呈現(xiàn)不同的表達變化趨勢：京841中，tae－miR396b呈現(xiàn)下調－上調－下調－上調－下調表達的變化趨勢，在1 h和6 h出現(xiàn)表達峰值；豫麥18中，tae－miR396b的表達整體呈現(xiàn)出下調的變化趨勢，與豫麥18相比京841具有更高的表達水平。高溫脅迫下，tae－miR396b在兩個品種小麥根系中表達模式差異較大，推測這可能與兩個品種的春冬性有一定的關系；在葉片和莖尖中整體表達趨勢相似，證明該miRNA在小麥高溫脅迫過程中發(fā)揮著一定的作用。

圖4 tae－miR396b在高低溫脅迫過程中的表達模式

3 討論與結論

隨著第一個miRNA 在秀麗線蟲中被發(fā)現(xiàn)［10］，越來越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)。miRNAs通過剪切［11－13］、翻譯抑制［14，15］或DNA甲基化［16，17］三種方式調控靶基因進而對植物的生長發(fā)育及在逆境脅迫響應中發(fā)揮調控作用。在匍匐剪股草中過表達miR396改變葉片大小進而提高植株對逆境的適應性［8］；水稻中miR396通過調節(jié)水稻的株型以及籽粒大小進而對產量產生影響［18］等?；趯嶒炇仪捌诨A研究，發(fā)現(xiàn)miR396b在小麥的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用［19］。本研究結果表明，tae－miR396b基因在小麥不同組織部位均有表達，且在節(jié)間相對表達量較高，說明該基因廣泛參與了小麥各組織的發(fā)育過程。通過對tae－miR396b基因上游調控區(qū)域啟動子預測分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域存在著一些與生長發(fā)育相關的調控元件，如CCGTCC－motif分生組織表達元件、TCA水楊酸響應順式元件和RY－element種子特異相關元件等多個調控元件，這些啟動子元件可能是影響tae－miR396b在不同組織中存在差異表達的重要因素。

miRNAs在植物中的作用涉及到生長、發(fā)育、代謝調控等各個方面，包括種子萌發(fā)［20］、活性氧清除［21］、激素信號轉導［22］、植物器官形態(tài)發(fā)育［23］以及逆境脅迫應答［24］等。研究表明，miR1432、miR444、miR319 響應植物的低鉀脅迫［25］；miR1139在調節(jié)小麥對Pi缺乏的耐受性中起關鍵作用［26］；miR167則參與小麥的發(fā)育和抗?jié)B透脅迫［27］。此外，近來的研究表明，miR396參與包括溫度［9，8］、鹽［7，28］和干旱［29］等多種非生物脅迫響應的調控。本研究結果表明，tae－miR396b對高低溫逆境脅迫均有響應，在根系、莖尖和葉片中表現(xiàn)出不同的響應模式，這可能與溫控脅迫的信號通路有關。通過tae－miR396b基因上游調控區(qū)域啟動子預測分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域存在著與脅迫響應相關的調控元件，如MYB鹽脅迫啟動子元件、MYC抗寒性啟動子功能元件、ARE抗氧化調節(jié)元件、脫落酸響應元件（ABRE和A－box）、光響應元件（G－box、Sp1、AE－box和GT1－motif）、溫度響應元件（MYC和LTR）等，這些調控元件可能是影響tae－miR396b參與逆境脅迫響應的調控因子。

綜上，miRNAs在小麥生長發(fā)育過程和非生物脅迫響應過程中存在調節(jié)作用。本研究克隆了不同小麥品種中的tae－miR396b基因，并對其在不同品種中的組織表達特性以及對高低溫脅迫的應激響應進行了分析。下一步將繼續(xù)對taemiR396b進行生物學功能分析，為完善小麥非生物脅迫響應生理機制和分子機制提供必要的理論依據，確定tae－miR396b調控的下游靶基因，并進行功能分析和試驗驗證，闡明其內在的調控網絡。