解云輝，林樹乾，黃中利，殷斌，楊世發(fā)，祝鈺瑋，閆振貴，吳家強，劉月月

（1.山東省農業(yè)科學院家禽研究所，山東 濟南 250100；2.山東省畜禽綠色保健品創(chuàng)制工程實驗室，山東 濟南 250023；3.山東農業(yè)大學動物科技學院，山東 泰安 271018；4.山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟南 250100）

豬流感病毒（swine influenza virus，SIV）屬正粘病毒科甲型流感病毒屬，是一種具有廣泛感染范圍的分節(jié)段的、單股負鏈的RNA病毒［1］，主要感染哺乳類動物和禽類［2］。甲型流感病毒根據(jù)其表面抗原血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）的不同，目前分為17個亞型（H1～H17）和10個亞型（N1～N10），流感病毒可根據(jù)HA和NA多樣的排列組合，形成多種不同的亞型［3，4］。SIV含有8個基因組片段，當同類型的兩種或兩種以上不同的病毒感染同一個宿主細胞時，這些病毒的所有基因片段都可以在病毒增殖傳播中交換、重組，從而產生新的基因重組病毒［5］。在流感病毒感染細胞后，病毒的RNA進入細胞核中，并在此進行復制，從而產生新的子代病毒，并轉運出核［6］。甲型流感病毒的NP蛋白是最主要的結構蛋白，因此可以通過檢測NP蛋白的核定位從而對甲型流感病毒感染細胞的程度進行初步判斷。目前用于治療流感病毒感染的藥物主要包括M2離子通道阻滯劑和神經氨酸酶抑制劑［7］，然而由于氨基酸的突變，耐藥性越來越強［8］。因此，迫切需要開發(fā)新的抗流感藥物。中藥有多成分、多途徑、多靶點的特點［9］，不僅能夠抑制病毒，還有提高機體免疫功能的保健功效。H1N1 SIV在流感病毒流行中扮演重要角色，因其不僅能夠感染豬，還能夠感染其他哺乳動物和禽類，甚至是人類［10，11］，從而導致流感大流行和季節(jié)性流行。因此本研究旨在開發(fā)一種新的抗SIV藥物，為在臨床上降低SIV的感染率、發(fā)病率提供基礎。

清營口服液由古方清營湯改造而成，以前廣泛用于治療太陰溫病、手厥陰暑溫、暑癇、陽明溫病等［12］?，F(xiàn)代藥理學研究也證明了清營湯在疾病治療中的作用，如清營湯合生脈散加減可用于治療膿毒癥［13］；清營湯治療別嘌醇過敏致急性腎損傷［14］；清營湯加減對糖尿病腎病熱毒血瘀型在臨床上也起到了積極效果［15］。在獸醫(yī)臨床方面，通過動物試驗發(fā)現(xiàn)清營口服液對Wistar大鼠和雞感染大腸桿菌有良好的預防和治療效果，適合治療由大腸桿菌引起的家禽熱證［16］。由于清營口服液主治熱入營分證，豬流感能夠引起豬的熱證，因此，本試驗針對體內和體外試驗對清營口服液抑制甲型H1N1亞型豬流感病毒的作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥物 清營口服液組方（500 g）：水牛角69 g、金銀花69 g、麥冬51 g、生地黃69 g、連翹52 g、玄參69 g、黃連35 g、竹葉34 g、丹參52 g，將原材料加10倍量水浸泡30 min，煎煮2 h，過濾；第二次加5倍量水，煎煮0.5 h，過濾。合并兩次濾液，濃縮至500 mL，4℃保存，備用。上述原材料采購自濟南市建聯(lián)中藥有限公司；連花清瘟顆粒由北京以嶺藥業(yè)有限公司提供；利巴韋林對照品購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 試驗動物 SPF雞（9～11日齡）由山東省農業(yè)科學院家禽研究所昊泰動物繁育中心提供，C57BL／6小鼠購自濟南朋悅試驗動物繁育有限公司。

1.1.3 細胞與毒株 MDCK細胞（犬腎細胞）由山東省家禽疫病診斷與免疫重點實驗室贈與；H1N1病毒株分離自發(fā)病豬（山東省泰安市某養(yǎng)殖場）的肺臟組織。

1.1.4 主要試劑 Anti-H1N1甲型流感virus Nucleocapsid蛋白抗體購自Abcam公司；Evo MMLV反轉錄試劑盒Ⅱ、SYBR GreenPro TaqHS預混型qPCR試劑盒購自Accurate Biology公司；Foetal Bovine Serum購自Biological Industries公司；Star Marker D2000購自GenStar公司；Phosphate Buffered Saline、DMEM／HIGH GLUCOSE購自HyClone公司；Cy3標記山羊抗兔IgG購自Servicebio公司；DAPI溶液購自Solarbio公司；rTaq酶、RNAiso Plus購自TaKaRa公司；Cell Counting Kit－8購自北仁化學科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒分離鑒定及純化 取發(fā)病豬的肺臟組織，使用Trizol法提取病毒RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA，按照TakararTaq說明書PCR擴增病毒后進行核酸電泳檢測。PCR擴增程序：95℃5 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，共36個循環(huán)；72℃5 min。引物序列如表1所示。

表1 試驗所用引物

取肺臟組織研磨至勻漿狀，使用0.22μm濾器過濾，接種到SPF雞胚中，96 h后收取雞胚尿囊液為第一代病毒液并連續(xù)傳代5代。

1.2.2 體內抗病毒試驗 （1）中藥制劑反復給藥急性毒性試驗：取24只雄性小鼠，適應性喂養(yǎng)5 d，稱重后隨機分為4組，每組6只，分為空白對照組，清營口服液高、中、低（1.50、0.75、0.38 g／kg）劑量組。小鼠每天固定時間灌胃，0.02 mL／g連續(xù)灌胃7 d，對照組灌胃等體積PBS，每天觀察臨床表現(xiàn)，每兩天稱重一次，共觀察14 d，計算體重比。體重比＝當天的體重／初始體重。試驗結束前12～16 h禁食不禁水，采血做血常規(guī)和生化檢測。

（2）流感病毒半數(shù)感染量（ID50）測定：將H1N1 SIV在SPF雞胚內增毒，收集雞胚尿囊液后依次稀釋10倍為10－1、10－2、10－3、10－4濃度的病毒液。取25只雄性小鼠，適應性喂養(yǎng)5 d，稱重后隨機分為5組，每組5只，分別為空白對照組和病毒對照組（10－1～10－4）。病毒對照組小鼠經乙醚麻醉后，滴鼻感染不同濃度的病毒液50μL，空白對照組小鼠滴鼻50μL PBS，每天觀察臨床反應，記錄死亡時間，統(tǒng)計死亡數(shù)（24 h內死亡的不計入死亡數(shù)）、體重下降小鼠數(shù)、精神不佳小鼠數(shù)，觀察14 d，利用Reed-Muench法計算病毒的半數(shù)感染量。

（3）小鼠感染模型建立及給藥：將42只雄性小鼠適應性喂養(yǎng)5 d，稱重后隨機分為6組，每組7只，分為空白對照組，病毒對照組，清營口服液38、75、150 mg／kg劑量組，連花清瘟（藥物對照）組。乙醚麻醉后用PBS滴鼻作為空白對照組，其余各組100ID50滴鼻50μL／只，病毒感染4 h后開始灌胃藥物，連續(xù)灌胃5 d，空白對照組和病毒對照組給予與中藥等體積的生理鹽水。每兩天測量一次小鼠體重，計算體重比。

（4）肺指數(shù)測定：連續(xù)灌胃5 d后，將小鼠用脊椎脫臼法處死，稱取體重后剖開胸腔取出肺組織稱重。肺指數(shù)＝肺重／體重。

（5）肺組織切片觀察：取各組小鼠相同部位的肺組織，4%多聚甲醛進行固定后，送至武漢塞維爾生物科技有限公司切片制作，蘇木精－伊紅染色法染色（HE染色），于顯微鏡下觀察肺臟的病變情況并拍照。

（6）肺組織病毒載量測定：每組取3只小鼠相同部位、相同大小的肺組織，放入1.5 mL離心管，加入1 mL RNAiso Plus，研磨成肺組織勻漿，提取RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA。按照SYBR GreenPro TaqHS預混型qPCR試劑盒說明書進行體系配制，熒光定量PCR程序：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，72℃10 s，共40個循環(huán)；95℃10 s，65℃60 s，97℃1 s。使用2－ΔΔCt方法計算基因表達水平的倍比變化，所有PCR反應均重復3次。

1.2.3 體外抗病毒試驗 （1）病毒毒力檢測：將MDCK細胞鋪于96孔板中培養(yǎng)至單層，棄去孔中液體，用PBS清洗細胞2次。用病毒生長液將病毒按10倍倍比稀釋為不同濃度，加入96孔板，每孔100μL，每個濃度8復孔；設空白對照組（正常細胞），加入病毒生長液，每孔100μL。放入細胞培養(yǎng)箱中吸附2 h后棄去病毒液，加入病毒生長液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞病變情況，直到細胞不再出現(xiàn)新的病變。顯微鏡觀察并記錄每個稀釋倍比下出現(xiàn)細胞病變的孔數(shù)，記錄細胞病變效應（CPE），按照Reed-Muench法計算病毒的組織細胞半數(shù)感染量（TCID50）。

（2）供試品細胞毒性檢測：將MDCK細胞鋪于96孔板中培養(yǎng)至單層，棄去孔中液體，將對半稀釋后不同濃度的清營口服液、利巴韋林分別加入96孔板，對照組細胞不加藥品，培養(yǎng)72 h后棄去含藥培養(yǎng)基，PBS清洗2次，每孔加入10μL的CCK－8溶液，混勻。繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀檢測每孔的吸光度（A）值，檢測波長為470 nm，根據(jù)測得的A值，按照公式計算細胞存活率。

細胞存活率（%）＝試驗組A值／對照組A值×100。

（3）清營口服液對H1N1 SIV的抑制作用：將MDCK細胞鋪于24孔板中培養(yǎng)至單層，棄去24孔板中液體，用PBS清洗細胞2次。加入100TCID50病毒液與不同濃度清營口服液的混合物，作用48 h后提取RNA。

為探究清營口服液在不同階段的作用效果，設置三種模式：吸附前期、吸附期和吸附后期（圖1），同時設立正常細胞對照組和病毒對照組。

圖1 藥物作用模式圖

吸附前期：將清營口服液不同濃度稀釋液分別加入細胞中，37℃孵育2 h后換液成100TCID50病毒液，作用2 h后棄去24孔板中液體，加入400 μL維持液（含2% FBS的DMEM），48 h后提取RNA。

吸附期：向細胞中加入100TCID50病毒液，37℃感染2 h后換液成清營口服液不同濃度稀釋液，48 h后提取RNA。

吸附后期：將100TCID50病毒液分別與清營口服液不同濃度稀釋液混合，將混合物放于37℃作用1 h后分別加入24孔板中，作用4 h后棄去24孔板中的液體，加入400μL維持液，48 h后提取RNA。

（4）細胞病毒載量測定：將上一步提取的RNA用試劑盒反轉錄成cDNA，進行實時熒光定量檢測。

（5）免疫熒光試驗：將MDCK細胞鋪于24孔板至細胞長至單層，吸出培養(yǎng)基，加入病毒與不同濃度藥物的混合物，同時設置空白對照組、病毒對照組、利巴韋林對照組，作用48 h后進行免疫熒光試驗。

吸出孔中液體，每孔加入400μL用PBS配置的4%甲醛室溫固定20 min；棄掉孔中液體，每孔加入400μL PBS洗滌3次，每次3 min；每孔加入400μL用PBS配置的0.1% Triton X－100，室溫通透15 min；每孔加入400μL PBS洗滌5次，每次3 min；每孔加入400μL用PBS配置的5%BSA，室溫封閉30 min；每孔加入400μL PBS洗滌3次，每次3 min；用PBS按照一抗說明書濃度配置好一抗稀釋液，每孔加入200μL，將12孔板置于濕盒中，4℃過夜；吸出一抗，每孔加入400 μL PBS洗滌5次，每次3 min；用PBS按照二抗說明書配置好二抗稀釋液，每孔加入200μL，置于37℃溫箱避光孵育1 h；每孔加入400μL PBS洗滌3次，每次3 min；每孔加入400μL DAPI，室溫避光染色10 min；使用熒光倒置顯微鏡觀察細胞，拍照。

2 結果與分析

2.1 豬流感病毒的分離與鑒定

發(fā)病豬在1月齡左右（圖2A），表現(xiàn)高熱發(fā)抖，皮膚發(fā)紅，食欲減退，活動減少，并伴有噴嚏、鼻炎、咳嗽等癥狀。隨著病程發(fā)展，發(fā)病豬出現(xiàn)呼吸困難、臥地不起，最終死亡。對豬場其余豬進行抗流感藥物治療后，癥狀有所緩解。剖檢后發(fā)現(xiàn)氣管粘膜充血，喉頭有輕微出血，肺臟有充血、實變等癥狀（圖2B）。對死亡豬的病料進行RNA提取，RT－PCR檢測，確診為H1N1流感病毒，同時對引起豬高熱的其他常見疾病，包括豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)、豬偽狂犬進行病原檢測，結果均為陰性（圖2C）。將該病毒樣研磨稀釋100倍后接種至SPF雞胚，于96 h后收集尿囊液，連續(xù)傳代5代后，測得血凝效價為25，收集尿囊液凍于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

圖2 發(fā)病豬（A）、臨床剖檢病變（B）和PCR鑒定結果（C）

2.2 體內抗病毒試驗結果

2.2.1 清營口服液對小鼠的毒性作用 本試驗在開始給藥后的第0、2、4、6、8、10、12、14 d對小鼠進行體重測量，結果顯示，0.38、0.75、1.50 g／kg劑量組和空白對照組的小鼠體重均為上升趨勢（圖3），PBS對照組最大增幅為原體重的5.77%，0.38 g／kg清營口服液組最大增幅為原體重的5.95%，0.75 g／kg清營口服液組最大增幅為原體重的7.24%，1.50 g／kg清營口服液組最大增幅為原體重的6.49%，表明3種劑量清營口服液均未對小鼠體重增長產生不良影響。

圖3 不同劑量清營口服液對小鼠體重比的影響

血常規(guī)檢測結果（表2）和生化檢測結果（表3）均顯示，各給藥組與空白組均無明顯差異，表明清營口服液按最大劑量給藥對小鼠無毒性。

表2 小鼠血常規(guī)測定

表3 小鼠生化指標測定

2.2.2 半數(shù)感染量（ID50） 利用Reed-Muench法計算病毒的半數(shù)感染量（ID50）為10－4.48。

2.2.3 小鼠感染給藥后體重比 由圖4可知，0～2 d所有小鼠體重均上漲，空白對照組體重增長率為11.0%，病毒對照組為10.6%，給藥組平均為14.0%；第2～4 d空白對照組體重增長率為11.5%，病毒對照組為9.7%，給藥組平均為11.9%；第4～6 d所有小鼠體重較前兩天均下降，空白對照組體重增長率為10.8%，病毒對照組為5.1%，給藥組平均為5.7%。綜上，從清營口服液對感染H1N1 SIV后小鼠體重的影響來看，藥物全程均有抗病毒效果，在0～2 d藥效最明顯。

圖4 感染給藥模型小鼠體重比

2.2.4 小鼠感染給藥后肺指數(shù) 對小鼠剖檢時發(fā)現(xiàn)，空白對照組小鼠肺臟呈淡紅色，無病變；病毒對照組小鼠肺臟出現(xiàn)明顯水腫，呈暗紅色，表面有出血點；各藥物治療組小鼠肺呈淡紅色，偶見出血點。數(shù)據(jù)分析結果（圖5）顯示，病毒對照組與空白對照組肺指數(shù)有顯著差異；各藥物治療組與空白對照組差異不顯著，表明清營口服液對小鼠體內H1N1流感病毒有良好的治療效果。

圖5 感染給藥后小鼠肺指數(shù)

2.2.5 各組病毒載量的變化 肺組織病毒載量檢測結果（圖6）顯示，給藥組與病毒對照組小鼠肺組織病毒載量差異達極顯著水平，說明清營口服液對小鼠體內H1N1 SIV有抑制作用，平均抑制率達99.41%。

圖6 感染給藥后小鼠肺組織病毒載量

2.2.6 小鼠肺組織病理檢查 染色結果（圖7）顯示，空白對照組肺泡壁較薄，無充血、出血現(xiàn)象，肺巨噬細胞較少；病毒對照組肺泡壁增厚，毛細血管充血，肺巨噬細胞增多；150 mg／kg清營口服液給藥后與連花清瘟給藥后肺巨噬細胞少量增多，無充血、出血現(xiàn)象，肺泡壁無明顯變化；75 mg／kg清營口服液給藥后肺泡壁輕微增厚，有輕微的出血現(xiàn)象，肺巨噬細胞增多；38 mg／kg清營口服液給藥后肺泡壁嚴重增厚，充血現(xiàn)象明顯，肺巨噬細胞增多。因此，150 mg／kg清營口服液對小鼠體內H1N1 SIV的治療效果最好，75 mg／kg和38 mg／kg清營口服液效果一般。

圖7 感染給藥后小鼠肺組織病理切片結果

2.3 體外抗病毒試驗結果

2.3.1 H1N1 SIV對MDCK細胞的TCID50測定流感病毒感染MDCK細胞后會出現(xiàn)細胞變圓、空泡，細胞之間出現(xiàn)星狀聚集成團、脫落、核固縮等現(xiàn)象；正常對照組的細胞狀態(tài)良好，排列緊密。利用Reed-Muench法計算病毒的半數(shù)感染量（TCID50），每100μL為10－3.66。

2.3.2 細胞給藥最大安全濃度測定 檢測供試藥物的細胞毒性是評價抗病毒藥效的前提，在本試驗中，細胞存活率≥85%被認為藥物對細胞沒有損傷。由圖8可知，當清營口服液濃度為100 mg／mL和50 mg／mL時，細胞存活率小于85%，濃度≤25 mg／mL時，細胞存活率大于90%。使用同樣方法測得對照藥物利巴韋林的最大安全濃度為1.25 mg／mL。后續(xù)試驗均以清營口服液和利巴韋林的最大安全濃度進行。

圖8 清營口服液細胞毒性檢測

2.3.3 藥物對H1N1 SIV的抑制作用 病毒載量檢測結果（圖9）顯示，在藥物的安全范圍內，隨藥物濃度增加，對H1N1 SIV的抑制效果增強，并且呈一定的量效關系。清營口服液和利巴韋林均可顯著抑制流感病毒的增殖，其中25 mg／mL清營口服液對H1N1 SIV的抑制作用最明顯。

圖9 不同藥物及濃度下H1N1 SIV載量

為確定清營口服液在病毒生命周期中發(fā)揮作用的階段，分別將不同濃度的藥物作用于病毒吸附前期、吸附期和吸附后期并進行藥效分析。結果（圖10）表明，3種作用模式下，清營口服液均對H1N1 SIV表現(xiàn)出極顯著（P＜0.01）抑制效果，其中吸附后期的抑制效果最佳，25 mg／mL清營口服液在吸附后期對H1N1 SIV 的抑制率達96.8%，而吸附前期和吸附期的抑制率分別為95.6%和73.3%。以上結果表明，清營口服液具有抗H1N1 SIV活性，在感染的吸附后期效果最好。

圖10 清營口服液不同作用時期H1N1 SIV載量

2.3.4 藥物對H1N1豬流感病毒核蛋白的抑制作用 NP蛋白在流感病毒復制過程中起重要作用，通過免疫熒光試驗發(fā)現(xiàn)，H1N1 SIV感染MDCK細胞48 h后，病毒對照組NP蛋白彌散在細胞核和細胞質中（圖11B），經過藥物處理后，6.25 mg／mL清營口服液處理過的細胞核和細胞質中都存在綠色熒光（圖11D），但12.5 mg／mL和25 mg／mL藥物組只見細胞核中有明顯綠色熒光，未見細胞質中有熒光存在（圖11E、F），利巴韋林對照組細胞核內見明顯熒光，細胞質中無熒光（圖11C）。表明清營口服液能夠有效抑制H1N1 SIV的NP蛋白核輸出。

圖11 免疫熒光檢測清營口服液對H1N1 SIV的NP蛋白核輸出的影響

3 討論與結論

流感病毒可導致機體產生急性呼吸道癥狀，對人類公共衛(wèi)生與健康造成極大威脅，豬有流感病毒“混合器”之稱，與流感病毒的流行和爆發(fā)有著密不可分的聯(lián)系。2009年爆發(fā)的豬源H1N1流感導致人體嚴重的流感樣癥狀并引發(fā)了多種并發(fā)癥，在人際間具有很高的傳播性［17］。H1N1豬流感在我國豬群中一直存在并保持較高的流行率，2011年我國出現(xiàn)了人感染類禽H1N1亞型SIV事件［18］；有研究人員監(jiān)測到一株重組流感病毒G4EAH1N1，自2016年已成為國內豬流感病毒的主體［17］，并具備在人群中流行的潛力。本課題組對山東省豬流感病毒進行檢測時發(fā)現(xiàn)2020年的發(fā)病率和致死率均較往年有所升高，暗示該亞型病毒毒性可能逐漸增強?？梢妼υ摬《具M行防控具有重要的社會意義和經濟意義。

中藥是我國的瑰寶，在治療疾病中發(fā)揮了重要角色，銀屑病和阿爾茨海默癥就被發(fā)現(xiàn)可以通過中藥來治療［19，20］，尤其在2020年抗擊新型冠狀病毒肺炎的關鍵時刻，中草藥的合理使用也在臨床一線發(fā)揮出了重要優(yōu)勢［21］。清營口服液是本課題組研制的三類新獸藥，由古方清營湯改造。清營湯目前對膿毒血癥、糖尿病腎病熱毒血瘀型發(fā)揮了良好的治療效果，但對H1N1 SIV的抑制效果有待研究，故本課題使用改良方清營口服液針對體內和體外兩方面進行了抗豬流感病毒效果的研究。

本課題組在山東省泰安市某養(yǎng)豬場病死豬的病料中鑒定出一株H1N1亞型豬流感病毒，通過對該株病毒的純化，測得其血凝效價為25，在MDCK細胞上測得TCID50，每100μL為10－3.66。試驗發(fā)現(xiàn)，清營口服液對小鼠無毒性，且對小鼠感染H1N1 SIV有明顯的抑制效果。為進一步檢測清營口服液抗流感病毒的作用，在細胞水平上對清營口服液抗豬流感病毒的藥效進行了探究，結果發(fā)現(xiàn)清營口服液對病毒的抑制效果顯著，且在吸附后期對H1N1 SIV的抑制效果最好，說明藥物可以在細胞水平上起到良好的抗H1N1 SIV效果。利用免疫熒光試驗檢驗清營口服液對NP蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)25 mg／mL和12.5 mg／mL濃度的藥物能夠有效抑制NP蛋白的核輸出，抑制病毒復制。綜上所述，清營口服液在體內外對H1N1 SIV的復制均有明顯的抑制作用。