朱鴻超，何暢，侯佩莉，王洪梅，李雪漫，唐文娟，何洪彬

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院／反芻動物疾病研究中心，山東 濟(jì)南 250014；2.山東師范大學(xué)附屬中學(xué)國際部，山東 濟(jì)南 250014）

牛流行熱病（bovine ephemeral fever，BEF）是一種通過空氣、同槽、節(jié)肢動物（主要是蚊子）引起動物牛（黃牛、水牛和乳牛）的急性熱性傳染?。?－3］，其特征為突然高燒，呼吸道、消化道嚴(yán)重的卡他性炎癥以及運(yùn)動障礙。該病多發(fā)生在6—9月份，流行面廣、傳播速度快、病勢猛，尤其是高溫多雨時發(fā)病率極高，短期內(nèi)可使任何品種、性別、年齡的大批牛只黏膜化膿、奶量降低、癱瘓以及死亡，具有發(fā)病率、死亡率高等特點(diǎn)，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前在亞洲（中國的28個?。?、非洲和大洋洲的40多個國家發(fā)現(xiàn)有BEF的廣泛流行傳播，防控牛流行熱病已成為中國畜牧業(yè)的重中之重［4］。

牛流行熱病病原為牛流行熱病毒（bovine ephemeral fever virus，BEFV）［5］。該病毒為彈狀病毒科、牛流行熱病毒屬的單股負(fù)鏈RNA病毒，只有一個血清型，病毒粒子主要存在于病牛呼吸道分泌物、血液及糞便中。該病毒基因組大小約為14.9 Kb，編碼5個典型的彈狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、M、G和L）和6個非結(jié)構(gòu)蛋白（Gns、α1、α2、α3、β和γ）［6，7］。其中α3蛋白是牛流行熱病毒基因組編碼的一個非結(jié)構(gòu)蛋白，其功能報(bào)道較少［8］。

目前尚未有牛流行熱病商品化診斷試劑盒，已上市批準(zhǔn)的牛流行熱病毒疫苗種類較少且單一［9－13］。因此本研究旨在通過生物信息學(xué)分析α3蛋白相關(guān)特征，構(gòu)建pGEX－4T－1－α3原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化此蛋白，為進(jìn)一步制備α3多克隆抗體、建立相關(guān)的血清學(xué)檢測方法、研制高效準(zhǔn)確的診斷試劑和新型疫苗等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病毒RNA提取試劑盒購自成都福際生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher；BEFV山東分離株、pGEX－4T－1載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；2×Phata max master mix、膠回收試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；rTaq聚合酶購自天根生化科技（北京）有限公司；Ex taq聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ／XhoⅠ、DNA Marker購自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)、大腸桿菌BL21感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素、IPTG誘導(dǎo)劑、胰蛋白酶抑制劑、胃蛋白酶抑制劑、咪唑、0.45 μm PVDV膜、5×SDS上樣緩沖液為Solarbio公司產(chǎn)品；電泳液（5×）、轉(zhuǎn)膜液（10×）、TBST（10×）購自上海雅酶生物科技有限公司；GST抗體購自Abways公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BEFVα3基因的擴(kuò)增 根據(jù)BEFV山東分離株α3的基因序列，利用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1）。引物由青島擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

按試劑說明書提取BEFV的全基因組并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板采用PCR擴(kuò)增α3基因片段。反應(yīng)體系（50μL）：18μL ddH2O，3μL cDNA模板，25μL 2×Phata max master mix，2μL（10 μmol／L）上游引物，2μL（10μmol／L）下游引物。擴(kuò)增條件：95℃3 min；95℃15 s，60℃15 s，72℃30 s，共35個循環(huán)；72℃5 min。將符合預(yù)期的瓊脂糖凝膠電泳條帶進(jìn)行回收［14］?；厥债a(chǎn)物連接pEASY－T載體，挑取單克隆菌落，送青島擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 α3序列同源性分析 從GenBank中查找到3株來自中國和1株來自泰國的BEFVα3參考序列（表2）。使用DNAStar中的MegAlign將BEFV山東分離株α3基因與參考毒株信息進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列同源性比對分析［15］。

表2 參考毒株信息

1.2.3 生物信息學(xué)分析 測序獲得牛流行熱病毒山東分離株α3蛋白完整的基因序列，利用ProtParam 軟件和抗原表位分析軟件（Immune Epitope Database Analysis Resource，http：／／tools.immuneepitope.org／bcell／）中 的Bepipred Linear Epitope方法預(yù)測氨基酸水平的B細(xì)胞線性表位及親水性關(guān)系，以確定α3蛋白是否為親水性的可溶性蛋白［16］。

1.2.4 原核表達(dá)載體pGEX－4T－1－α3的構(gòu)建采用BamHⅠ／XhoⅠ分別雙酶切pGEX－4T－1載體和α3基因序列。酶切目的基因α3的體系為：BamHⅠ3μL，XhoⅠ3μL，10×Fast Green Buffer 5μL，膠回收后的α3基因39μL，37℃；酶切載體的體系為：BamHⅠ3μL，XhoⅠ3μL，10×Fast Green Buffer 5μL，pGEX－4T－1載體4 μL，ddH2O 35μL，37℃。采用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切鑒定。用T4 DNA連接酶將α3基因序列與pGEX－4T－1載體連接。連接體系為：T4 DNA ligase 0.8μL，5×T4 DNA ligase Buffer 2 μL，pGEX－4T－1載體2μL，α3基因4μL，ddH2O 1.2μL，25℃連接15 min。將連接的重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－α3轉(zhuǎn)化DH5α，而后在有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上涂板，待長出菌落后挑取單克隆放入含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)8 h后交由擎科生物科技有限公司測序，測序正確的克隆提取質(zhì)粒－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 α3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物純化 將測序正確的重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－α3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)，接種到含有氨芐固體LB培養(yǎng)基上，長出菌落后挑取單克隆菌落到液體LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12～14 h后保存菌液。取pGEX－4T－1－α3重組菌液2 mL加入到200 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r／min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為0.4～0.6時，加入200μL IPTG誘導(dǎo)4 h，同時設(shè)置空載體pGEX－4T－1作為對照。菌液離心后將沉淀的菌體用NPI－10重懸，隨后進(jìn)行超聲破碎（350 W，工作5 s，停止5 s，超聲破碎1 h），12 000 r／min離心10 min，取出上清加入GST磁珠，在旋轉(zhuǎn)搖床上結(jié)合過夜，用NPI－20沖洗結(jié)合蛋白的GST磁珠5次，每次5 min，將洗雜完的磁珠轉(zhuǎn)入純化柱中，分裝3個1 mL的離心管收集α3蛋白。將菌液超聲后的上清、純化的α3融合GST、GST空載的菌液超聲后的上清和純化的GST磁珠進(jìn)行SDS－PAGE電泳（150 V，1 h），電泳結(jié)束后加入10 mL的考馬斯亮藍(lán)染液，放入孵育搖床上4 h后觀察蛋白表達(dá)情況。

1.2.6 Western Blot鑒定α3重組蛋白 通過Bio－Rad濕轉(zhuǎn)電泳儀（220 mA，160 min）冰浴條件下將空載體表達(dá)GST純化蛋白和α3融合GST純化蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳，膠分離后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后放入10 mL含5%脫脂奶粉溶液中，室溫條件下封閉2 h后棄去封閉液，重新加入GST的單克隆抗體血清，室溫孵育2 h后棄去一抗，用PBST洗滌3次，每次5 min，然后加入1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，再用PBST洗滌3次，每次5 min。最后滴加ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色，并用化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 α3基因的PCR擴(kuò)增

以BEFV的cDNA為模板，采用特異性引物α3－F和α3－R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增條帶156 bp，與預(yù)期的α3基因大小一致。連接T載體后進(jìn)行基因測序，序列與參考基因的序列一致。

圖1 RT－PCR擴(kuò)增α3基因片段電泳圖

2.2 α3序列的同源性分析

測序比對結(jié)果表明，從山東分離株上克隆的α3基因片段長度為156 bp，編碼51個氨基酸。該基因核苷酸序列與參考毒株的同源性為98.0%～100.0%，氨基酸的同源性也為98.0%～100.0%（表3）。表明α3蛋白具有較高的保守性。

表3 BEFV山東分離株與參考毒株的α3序列同源性分析（%）

2.3 α3蛋白結(jié)構(gòu)和功能分析

根據(jù)ProtParam軟件預(yù)測，α3蛋白的理論等電點(diǎn)為9.23，不穩(wěn)定系數(shù)為48.73，總平均疏水性為－0.737，說明α3是一個可溶性蛋白。

根據(jù)蛋白抗原表位分析α3蛋白B細(xì)胞線性表位結(jié)果表明，α3蛋白包含5個線性表位，其中區(qū)段3～5 aa、9～47 aa是α3蛋白的優(yōu)勢抗原表位區(qū)段（圖2）。明確α3蛋白的線性表位區(qū)段，為獲得特異性的抗原區(qū)段提供了較好的依據(jù)。

圖2 α3蛋白的B細(xì)胞線性表位分析

2.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

將擴(kuò)增目的片段和pGEX－4T－1載體用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接轉(zhuǎn)化后構(gòu)建pGEX－4T－1－α3重組載體，重組載體用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切（圖3），得到α3目的片段和pGEX－4T－1的線性片段且基因片段大小與預(yù)期相符?；驕y序分析表明插入目的基因正確，說明成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX－4T－1－α3。

圖3 pGEX－4T－1－α3重組載體雙酶切鑒定

2.5 融合α3蛋白的表達(dá)純化及鑒定

蛋白表達(dá)結(jié)果（圖4）顯示，通過泳道1和泳道2對比，說明α3蛋白正常表達(dá)，泳道3和泳道4說明GST空載正確表達(dá)，泳道1和泳道4說明GST及α3融合GST純化效果好，與預(yù)期相符。

圖4 重組α3蛋白表達(dá)和純化檢測

2.6 α3融合蛋白Western Blot鑒定

Western Blot鑒定結(jié)果（圖5）顯示，純化后的α3和GST融合蛋白、GST蛋白能夠與GST的抗體在大約30 kDa處發(fā)生特異性反應(yīng)，與預(yù)期大小一致，表明α3目的蛋白表達(dá)正確。

圖5 純化后的α3蛋白Western Blot檢測

3 討論與結(jié)論

BEFV與狂犬病毒、水泡性口炎病毒均屬于彈狀病毒科［17］。但BEFV在基因組大小及編碼蛋白上存在較大差異，除了5個結(jié)構(gòu)蛋白外，還編碼6個非結(jié)構(gòu)蛋白，這些非結(jié)構(gòu)蛋白是BEFV所特有，關(guān)于其功能研究報(bào)道較少［18－22］。本研究表明，山東分離毒株牛流行熱病毒α3基因片段大小為156 bp，編碼51個氨基酸，與參考毒株的核苷酸序列及氨基酸序列同源性均大于98.0%，因此推測α3蛋白在不同毒株之間具有很高的保守性。牛流行熱病毒實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要為核酸檢測與血清學(xué)檢測，應(yīng)用的靶蛋白主要是病毒的G糖蛋白，但是G糖蛋白容易發(fā)生突變，從而導(dǎo)致檢測的特異性低。鑒于α3蛋白具有一定的保守性，可能是BEFV血清學(xué)診斷的重要抗原［5，23］。

本研究首先通過生物信息學(xué)軟件對α3蛋白的抗原表位進(jìn)行分析，結(jié)果表明，α3蛋白包含5個B細(xì)胞線性表位，其中區(qū)段3～5、9～47 aa是α3蛋白的優(yōu)勢抗原表位區(qū)段，推測α3蛋白可能具有免疫原性。趙慶亮等［16］利用ProtParam軟件分析蛋白的親水性，以判斷該蛋白是以包涵體形式存在還是可溶性形式存在。本研究根據(jù)Prot-Param軟件預(yù)測α3蛋白的總平均疏水性為－0.737，推測其為可溶性蛋白。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了pGEX－4T－1－α3重組載體，將其轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)中，IPTG誘導(dǎo)4 h后，α3蛋白能夠高效以可溶性蛋白表達(dá)，進(jìn)一步通過GST磁珠純化獲得較高濃度的α3蛋白，這提示BEFV的α3蛋白可能是一個重要潛在亞單位疫苗的候選蛋白，需要進(jìn)一步進(jìn)行免疫原性的研究［24－28］。純化的α3融合GST蛋白與磁珠可作為GST pull－down試驗(yàn)的誘餌蛋白，免疫沉淀BEFV感染的宿主細(xì)胞蛋白，可為研究α3蛋白的相關(guān)功能奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)將α3蛋白與GST融合可溶表達(dá)，純化具有天然免疫構(gòu)像活性且產(chǎn)量高的蛋白，具有極大的商品化潛力，為下一步診斷方法的創(chuàng)新、尋找與α3相互作用的蛋白及研制新型的BEFV疫苗提供了理論基礎(chǔ)。