卓俊納，吳衛(wèi)宇，陳 靜，蘇占元，趙金松，3

（1.四川輕化工大學(xué)，四川宜賓 644000；2.四川國檢檢測(cè)有限責(zé)任公司，四川瀘州 646000；3.四川省酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司，四川瀘州 646500）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，簡(jiǎn)稱EC，分子式為H2NCOOC2H5）又稱尿烷，是一種無色、無味的晶體或者白色粉末，普遍存在于發(fā)酵食品（面包、醬油[1]和酸奶等）和酒精飲料（威士忌[2]、黃酒[3]、葡萄酒[4]等）中。研究表明，EC 是一種多位點(diǎn)致癌物，可導(dǎo)致嚙齒類動(dòng)物患淋巴癌、肺癌、肝癌和皮膚癌等疾病[5]。乙醇對(duì)EC的致癌性有促進(jìn)作用，而酒精飲類更是人類攝入EC的主要來源[6]。國際癌癥研究署在1987年將其歸為2B 類致癌物，并在2007年對(duì)其進(jìn)行再次評(píng)估后改為2A 類致癌物[7-8]。加拿大衛(wèi)生與防疫部門規(guī)定蒸餾酒中EC的限量為150 μg/L，目前我國尚未出臺(tái)有關(guān)EC的限量標(biāo)準(zhǔn)[6，9]。

EC 的形成途徑主要有兩條，一是乙醇與氨基甲酸酯化合物（尿素，氨基甲酸酯磷酸和瓜氨酸）反應(yīng)生成，二是在非酶條件下乙醇與氰化物之間反應(yīng)生成[10-11]。pH 值、溫度、光照水平、銅離子和精氨酸濃度等許多因素均會(huì)影響EC 的形成[12]。高溫顯著增加了EC的形成，尤其是在蒸餾和存儲(chǔ)階段[13]。

白酒是我國特有的傳統(tǒng)酒種，是世界六大蒸餾酒之一，它擁有獨(dú)特的釀造工藝和獨(dú)特的酒體風(fēng)味，因此深受消費(fèi)者的喜愛。目前，國內(nèi)關(guān)于EC的研究報(bào)道主要集中在黃酒、葡萄酒等酒精飲料中，對(duì)白酒中EC 的研究報(bào)道較少。在研究檢測(cè)方法方面，陳路露等[14]應(yīng)用GC-MS 方法檢測(cè)白酒中EC 含量，并通過考察日內(nèi)差和日間差，進(jìn)一步證明該法有良好的精密度和準(zhǔn)確度。薛錫佳等[15]采用液液萃取法，建立了白酒中氨基甲酸乙酯含量的快速檢測(cè)方法。在含量分析方面，張順榮等[16]采用衍生化和GC-MS/MS 聯(lián)用技術(shù)研究了多種香型原酒和成品酒中EC 的含量，但是并未進(jìn)行更清晰明了的數(shù)據(jù)對(duì)比。蘇占元等[17]應(yīng)用GC-MS 方法對(duì)濃香型、醬香型、清香型白酒和原酒中的EC含量進(jìn)行檢測(cè)，但并未進(jìn)行直觀的分類分析。

本研究以3 種香型白酒為研究對(duì)象，采用國標(biāo)所制定的GC-MS 方法[18]檢測(cè)分析了不同等級(jí)成品酒中EC 的含量，并采用SPSS 聚類分析法探討白酒香型與等級(jí)和EC 含量的關(guān)系，期望為我國相關(guān)部門制定白酒中氨基甲酸乙酯風(fēng)險(xiǎn)控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

共有34 個(gè)酒樣，包括濃香型成品酒12 個(gè)（均為52%vol，包含高端酒樣4 個(gè)、中端酒樣4 個(gè)、低端酒樣4 個(gè)），醬香型成品酒12 個(gè)（均為53%vol，包含高端酒樣4 個(gè)、中端酒樣4 個(gè)、低端酒樣4 個(gè)），清香型成品酒10 個(gè)（均為53 %vol，包含高端酒樣4 個(gè)、中端酒樣3個(gè)、低端酒樣3個(gè)）。

1.1.2 試劑與儀器

試劑及耗材：堿性硅藻土固相萃取柱（10 mL），博納艾杰爾；無水硫酸鈉（Na2SO4），成都市科隆化學(xué)品有限公司；氯化鈉（NaCl），重慶萬盛川東化工有限公司；正己烷（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）、乙醚（色譜純），西隴化工股份有限公司；甲醇（色譜純），OmniGene LLC；氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（Ethyl carbamate，C3H7O2N：純度大于或等于99.0 %）；D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)液（Ethan-d5-ol,carbamate，C3H2D5NO2：純度大于或等于98.0%）。

儀器設(shè)備：氣相色譜-質(zhì)譜儀（6890N-5975B，Agilent Technologies）；氮吹儀（N-EVAP111，Organomation Associates,Jnc.）；分析天平（T200），江蘇常熟雙杰儀器公司；Milli-Q 超純水儀，美國Milipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理

取2 g 酒樣，加100 μL 的2.0 mg/L D5-氨基甲酸乙酯使用液，混合均勻，加樣到10 mL 堿性硅藻土固相萃取柱上，讓試樣慢慢滲入到固相萃取柱中，靜置約10 min。用10 mL 正己烷淋洗，棄去淋洗液。然后采用10 mL 的5%乙酸乙酯-乙醚洗脫液洗脫，洗脫液經(jīng)裝有2 g 無水硫酸鈉的玻璃漏斗脫水后，收集于10 mL 具塞刻度試管中，在40 ℃下氮吹儀吹至近干,用甲醇溶解并定容至1 mL 制成測(cè)定液，供GC-MS分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：DB-WAX（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent Technologies）；進(jìn)樣口溫度：220 ℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積2 μL；色譜柱升溫條件：初溫50 ℃保持1 min，然后以8 ℃/min 升至180 ℃，10 ℃/min升至240 ℃保持10 min。載氣為高純氦氣（99.999%），流速1.0 mL/min。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊源（EI），電子轟擊能量70 eV；溶劑延遲時(shí)間11 min；四級(jí)桿溫度：150 ℃；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；選擇離子監(jiān)測(cè)方式(SIM mode)，EC 監(jiān)測(cè)離子為m/z 44、62、74、89。其中m/z 62 豐度大且干擾小，作為定量離子，其他離子用來定性。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

氨基甲酸乙酯儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取0.01838 g 的氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至100 mL，配制成濃度為0.1838 mg/mL的氨基甲酸乙酯儲(chǔ)備液。

D5-氨基甲酸乙酯使用液：(1)準(zhǔn)確吸取D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)液（200 mg/L）1 mL，用甲醇定容至50 mL，配制成濃度為4 mg/L 的D5-氨基甲酸乙酯使用液；(2) 準(zhǔn)確吸取D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)液（200 mg/L）250 μL，用甲醇定容至25 mL，配制成濃度為2.0 mg/L的D5-氨基甲酸乙酯使用液。

氨基甲酸乙酯中間液：準(zhǔn)確吸取氨基甲酸乙酯儲(chǔ)備液（0.1838 mg/mL）500 μL，用甲醇定容至50 mL，配制成濃度為0.001838 mg/mL 的氨基甲酸乙酯中間液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液：準(zhǔn)確吸取0.1838 mg/mL氨基甲酸乙酯中間液90 μL、225 μL、450 μL、900 μL、1800 μL、3600 μL、9000 μL，并分別加4 mg/L D5-氨基甲酸乙酯使用液500 μL，用甲醇定容至10 mL得到0.016542 mg/L、0.041355 mg/L、0.08271 mg/L、0.16542mg/L、0.33084mg/L、0.66168mg/L、1.6542mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法線性范圍

由于所測(cè)酒樣中的EC 含量差異較大，為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)確定了兩個(gè)線性范圍，并做出兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表1 可以看出，在0.016542～0.33084 mg/L 與0.08271～1.6542 mg/L范圍內(nèi)，氨基甲酸乙酯的線性回歸方程均具有良好的線性關(guān)系R2＞0.999。

表1 氨基甲酸乙酯的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 3種香型成品酒中EC含量

實(shí)驗(yàn)收集了國內(nèi)34 種白酒，按照香型和等級(jí)進(jìn)行分類，其中濃香型12 種（低端酒樣品編號(hào)NX1—4，中端酒樣品編號(hào)NX5—8，高端酒樣品編號(hào)NX9—12）、醬香型12 種（低端酒樣品編號(hào)JX1—4，中端酒樣品編號(hào)JX5—8，高端酒樣品編號(hào)JX9—12）、清香型10 種（低端酒樣品編號(hào)QX1—4，中端酒樣品編號(hào)QX5—7，高端酒樣品編號(hào)QX9—10），測(cè)定各白酒中的EC 含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果見表2。

表2 不同白酒樣品分析結(jié)果 (μg/kg)

由表2可知，濃香、清香、醬香3種香型成品酒中EC檢測(cè)率達(dá)到100%，且因?yàn)橄阈筒煌⒌燃?jí)不同，其含量分布也不同。高端濃香型白酒中EC平均含量最高(201.3 μg/kg)，高端醬香型次之(195.03 μg/kg)，其次是中端醬香型(122.24 μg/kg)，高端清香型(107.71 μg/kg)，中端濃香型(94.46 μg/kg)，低端醬香型(77.83 μg/kg)，中端清香型(39.14 μg/kg)，低端濃香型(21.6 μg/kg)，低端清香型白酒(17.11 μg/kg)EC平均含量最低。高粱是我國白酒釀酒的主要原料，其富含生氰糖苷［19］，不同酒廠使用的高粱品種不同也很可能導(dǎo)致最終白酒中EC 水平的差異，不同香型白酒由于其生產(chǎn)工藝的不同，也會(huì)導(dǎo)致最終EC含量的不同[20]。從表2 中也看出，同一香型不同等級(jí)白酒之間的EC 含量存在較大差異，且不同香型白酒均符合高端白酒中的EC 含量明顯高于中低端白酒的規(guī)律，這是由于三大香型白酒的主要原料均為高粱，同一香型不同等級(jí)的白酒在生產(chǎn)過程中高粱的品種不同，高端白酒使用的高粱品種優(yōu)于低端白酒，因而導(dǎo)致了3 種等級(jí)白酒中EC 含量的差異，這也和范文來等[21]報(bào)道的EC 主要在發(fā)酵過程中通過尿素途徑和氰化物途徑生成氨基甲酸乙酯相吻合。不同香型同一等級(jí)白酒之間的EC 含量存在較大差異，且醬香型與濃香型白酒的EC 含量遠(yuǎn)高于清香型白酒，這是由于不同香型白酒有不同的生產(chǎn)工藝。白酒中EC 的產(chǎn)生主要是釀酒發(fā)酵過程、蒸餾過程和存儲(chǔ)過程[9]。醬香型白酒的主要原料之一是高粱，且其采用高溫制曲，高溫堆積，高溫蒸餾，長(zhǎng)期發(fā)酵，總共要經(jīng)歷九次蒸煮、八次發(fā)酵、七次取酒[22]，這些工藝會(huì)使EC 形成的前體物質(zhì)增加。濃香型白酒的主要原料也是高粱，且一般都采用續(xù)米查法釀造，混蒸混糟、老窖續(xù)米查工藝[22]，因此高粱及濃香型白酒老窖的多次使用使老窖中微生物豐富，腐殖質(zhì)含量增加，從而使EC 的前體物質(zhì)增加[23]，使EC 含量增高。而醬香型白酒與濃香型白酒EC 含量的差異，可能是由于醬香型白酒的窖池結(jié)構(gòu)和濃香型白酒的窖池結(jié)構(gòu)有一定區(qū)別，濃香型白酒生產(chǎn)使用的是泥窖，而醬香型白酒使用的是泥底石窖，窖池除窖底外并未接觸窖泥，因此氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)要比濃香型白酒低一些[24]。清香型白酒的生產(chǎn)工藝與濃香型、醬香型白酒有較大區(qū)別，其采用的是地缸發(fā)酵，發(fā)酵溫度較低[22]，導(dǎo)致微生物群落不太豐富，因而EC形成的前體物質(zhì)較少，且低溫也在一定程度上不利于EC 的形成[13]，所以清香型白酒的EC含量遠(yuǎn)低于醬香型與濃香型白酒。

2.3 聚類分析

聚類分析（cluster analysis，CA）是目前數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)發(fā)展最好的分支之一，是將數(shù)據(jù)集的相似性樣本歸為若干類的方法[25]。采用SPSS22 對(duì)不同香型、不同等級(jí)的34 種白酒樣品進(jìn)行聚類分析，把性質(zhì)相近的白酒歸為一類。采用系統(tǒng)聚類分析，選擇組間連接聚類，以歐氏距離平方為測(cè)量準(zhǔn)則，聚類結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 濃香型(a)、醬香型(b)和清香型(c)白酒中EC含量聚類分析圖

圖2 低端(a)、中端(b)和高端(c)白酒中EC含量聚類分析圖

2.3.1 同一香型不同等級(jí)白酒

從圖1 中可以看出，當(dāng)歐氏距離為7～25 時(shí)，12種濃香型白酒樣品被分為兩類，其中NX1、10、6、5、3、8、9、12 為第一類，NX7、11、4、2 為第二類。當(dāng)歐氏距離為2～7 時(shí)，12 種醬香型白酒樣品很好的被分為四類，其中JX10、12、1、4、3、9為第一類，JX2、8為第二類，JX5、11 為第三類，JX6、7 為第四類。歐氏距離為10～18 時(shí)，10 種清香型白酒樣品被分為三類，其中QX1、10、7、6、3、8 為第一類，QX2、4、5為第二類，QX9 為第三類。可以看出，同一香型不同等級(jí)的白酒之間的聚類比較清晰，除個(gè)別特殊以外，基本按照等級(jí)進(jìn)行歸類。

2.3.2 不同香型同一等級(jí)白酒

從圖2 中可以看出，當(dāng)歐氏距離為8～12 時(shí)，12種低端白酒樣品被分為三類，其中JX3、QX1、NX3、1、JX4、1、2、QX3 為第一類，QX2、4 為第二類，NX2、4 為第三類。當(dāng)歐氏距離為7～16 時(shí)，11 種中端白酒樣品被分為三類，其中NX6、QX6、NX5、8、QX7、JX8 為第一類，JX6、7 為第二類，NX7、QX5、JX5 為第三類。歐氏距離為7～25 時(shí)，11 種高端白酒樣品被分為兩類，其中JX10、12、NX10、9、JX9、QX10、NX12、QX8 為第一類，NX11、JX11、QX9 為第二類?？梢钥闯?，不同香型同一等級(jí)的白酒聚類比較雜亂，沒有很好的將同一類別的樣品進(jìn)行歸類。

3 結(jié)論

本研究主要應(yīng)用GC-MS方法對(duì)不同等級(jí)的濃香型、醬香型、清香型成品酒中氨基甲酸乙酯含量進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明，香型不同、等級(jí)不同，EC 含量也不同。不同香型不同等級(jí)白酒中EC 的平均含量順序?yàn)椋焊叨藵庀阈停靖叨酸u香型＞中端醬香型＞高端清香型＞中端濃香型＞低端醬香型＞中端清香型＞低端濃香型＞低端清香型。采用SPSS22 對(duì)不同香型、不同等級(jí)的34 種白酒樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，當(dāng)香型相同而等級(jí)不同時(shí)，酒樣聚類比較清晰，除個(gè)別特殊以外，基本按照等級(jí)進(jìn)行歸類；當(dāng)香型不同而等級(jí)相同時(shí)，酒樣聚類比較雜亂，沒有很好的將同一類別的樣品進(jìn)行歸類。綜上所述，白酒中氨基甲酸乙酯含量會(huì)因?yàn)橄阈筒煌虻燃?jí)不同而有明顯差異，因此制定白酒中氨基甲酸乙酯含量的控制標(biāo)準(zhǔn)具有復(fù)雜性與多變性，期望本研究能為我國相關(guān)部門制定白酒中氨基甲酸乙酯風(fēng)險(xiǎn)控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。