楊曉暉，李超，崔茂香，梁金環(huán)，吳曉華，王梅，侯振江

(滄州醫(yī)學高等?？茖W校 a.甲狀腺疾病研究所，b.科技實驗中心，c.基礎醫(yī)學部，d.醫(yī)學系，河北 滄州 061001)

甲狀腺功能減退癥是由于甲狀腺激素合成或分泌不足、生物效應降低所致的以甲狀腺功能減退為主要特征的內(nèi)分泌疾病。腎臟是甲狀腺激素在人體內(nèi)代謝和清除的重要器官，同時也是甲狀腺激素在人體內(nèi)發(fā)揮生理效應的主要靶器官。近年來甲狀腺功能減退癥發(fā)病率逐年升高，甲狀腺功能減退癥所致的腎損傷逐漸引起臨床醫(yī)師的重視，目前臨床上主要采用甲狀腺素替代治療，但患者長期服藥可引發(fā)多種不良反應，且病情易復發(fā)。因此，研發(fā)有效防治甲狀腺功能減退癥性腎病的藥物或輔助治療藥物具有重要臨床意義。近年來，中藥在治療甲狀腺功能減退癥方面取得了顯著的療效[1-2]。黃芪作為傳統(tǒng)補氣中藥，具有抗氧化、抗炎、降脂及抗腫瘤作用[3-4]。研究表明，黃芪具有預防甲狀腺癌的作用，可調(diào)節(jié)機體甲狀腺素水平[5]。黃芪發(fā)酵物可使黃芪的有效成分充分利用。但目前關(guān)于黃芪發(fā)酵物改善甲狀腺功能減退癥的研究報道較少，本研究復制甲狀腺功能減退癥大鼠模型，給予不同劑量的黃芪及其發(fā)酵物，觀察藥物對甲狀腺功能減退癥大鼠腎損傷和氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 無特定病原體級Wistar大鼠80只，斷乳1個月，體重180～220 g，雌雄各半，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0002。

1.1.2主要藥物與試劑 黃芪購自北京同仁堂制藥廠，制備黃芪提取液[6]和黃芪發(fā)酵提取液[7]，并分別配制成低(0.25 g/mL)、中(0.50 g/mL)、 高(1.00 g/mL)三種劑量備用。丙硫氧嘧啶(上海朝輝藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20181205)，用0.9%氯化鈉溶液配成0.1%懸濁液，備用。超氧化物歧化酶(批號：20181202)、肌酐(批號：20181202)、尿素氮(批號：20181202)、丙二醛(批號：20181202)、蘇木素-伊紅染色試劑盒(批號：20181202)均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3主要儀器 Spectra MaxM4全波長酶標儀(美國Molecular Devices公司)，全自動生化分析儀(中山新銳醫(yī)療設備科技有限公司)，Sigma 3K15型超速冷凍離心機(德國Sigma公司)，SHA-B水浴恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)，Milli-Q Academic超純水器(美國Millipore公司),石蠟切片機(德國Leica公司)。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組及處理 80只Wistar大鼠雌雄分籠飼養(yǎng)，適應性飼養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字法分為正常對照組(10只)和造模組(70只)。參照Pantos等[8]方法并進行改進，復制甲狀腺功能減退癥大鼠模型。造模組大鼠飲用含0.05%丙硫氧嘧啶的自來水，正常對照組給予等量的自來水，4周后取大鼠股動脈血檢測甲狀腺功能(三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、游離三碘甲腺原氨酸、游離甲狀腺素、促甲狀腺激素)進行模型驗證[9]，造模成功后給藥干預。造模組依據(jù)隨機數(shù)字法分為甲狀腺功能減退癥模型組、黃芪低劑量組、黃芪中劑量組、黃芪高劑量組、黃芪發(fā)酵物低劑量組、黃芪發(fā)酵物中劑量組、黃芪發(fā)酵物高劑量組，每組10只。黃芪低、中、高劑量組分別給予黃芪提取液250、500、1 000 mg/100 g，每日1次，持續(xù)4周；黃芪發(fā)酵物低、中、高劑量組分別給予黃芪發(fā)酵物提取液250、500、1 000 mg/100 g；甲狀腺功能減退癥模型組灌服同體積蒸餾水，每日1次，持續(xù)4周。整個實驗共8周，腹主動脈取血處死大鼠采集樣本。

1.2.2指標檢測 ①抗氧化能力測定：大鼠麻醉后，股動脈放血，取新鮮血液，4 ℃條件下11 000×g離心15 min，分離血清，于-20 ℃低溫保存?zhèn)溆?；采用比色法測定血清超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。②腎功能測定：取-20 ℃低溫備用血清采用全自動生化分析儀測定肌酐、尿素氮水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。③腎臟病理學觀察：摘取腎組織，去除筋膜，用預冷的磷酸鹽緩沖溶液清洗，于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋并進行蘇木精-伊紅染色，鏡下觀察各組大鼠腎臟形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般情況 正常對照組大鼠毛發(fā)光亮緊密，動作靈活，反應較靈敏。甲狀腺功能減退癥模型組大鼠皮毛顏色較暗且稀疏，精神萎靡，體態(tài)相對緩慢，反應遲緩。應用黃芪及發(fā)酵物治療后的大鼠在皮毛光澤、精神及行為等方面均有一定程度的改善。

2.2黃芪及其發(fā)酵物對大鼠抗氧化能力的影響 各組大鼠超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與正常對照組相比，甲狀腺功能減退癥模型組大鼠超氧化物歧化酶活性明顯降低(P<0.01)，丙二醛水平明顯升高(P<0.05)；與甲狀腺功能減退癥模型組相比，黃芪中、高劑量組和黃芪發(fā)酵物中、高劑量組大鼠超氧化物歧化酶活性均明顯增高(P<0.01)，丙二醛水平均顯著降低(P<0.05)，黃芪低劑量組和黃芪發(fā)酵物低劑量組超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平無明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平比較

2.3黃芪及其發(fā)酵物對大鼠腎功能的影響 各組大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與正常對照組比較，甲狀腺功能減退癥模型組大鼠血清尿素氮和肌酐水平明顯升高(P<0.01)；與甲狀腺功能減退癥模型組相比，黃芪中、高劑量組和黃芪發(fā)酵物中、高劑量組大鼠血清尿素氮和肌酐水平均明顯降低(P<0.01)，黃芪低劑量組和黃芪發(fā)酵物低劑量組大鼠血清尿素氮水平無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清尿素氮、肌酐水平比較

2.4黃芪及發(fā)酵物對大鼠腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 光鏡下蘇木精-伊紅染色切片顯示，與正常對照組相比，甲狀腺功能減退癥模型組腎小球體積增大，球囊腔有明顯狹窄，毛細血管球基膜增厚，毛細血管管腔狹窄，系膜區(qū)增寬，腎小球內(nèi)細胞及基質(zhì)增生明顯，腎小管基底膜增厚；與甲狀腺功能減退癥模型組相比，黃芪低、中劑量組和黃芪發(fā)酵物低、中劑量組毛細血管球基膜增厚及系膜細胞和基質(zhì)增生改善不明顯，黃芪高劑量組毛細血管球基膜增厚及系膜細胞和基質(zhì)增生、球囊腔狹窄均有明顯減輕，黃芪發(fā)酵高劑量組毛細血管球基膜增厚和基質(zhì)增生、毛細血管管腔狹窄及腎小管基底膜增厚均明顯減輕。見圖1。

a：正常對照組；b：甲狀腺功能減退癥模型組；c：黃芪低劑量組；d：黃芪中劑量組；e：黃芪高劑量組；f：黃芪發(fā)酵低劑量組；g：黃芪發(fā)酵中劑量組；h：黃芪發(fā)酵高劑量組

3 討 論

甲狀腺功能減退癥屬于中醫(yī)學“虛勞”“水腫”等范疇，臨床主要表現(xiàn)為正氣匱乏、氣血不足、脾腎受損等陽虛氣耗的證候，其中以脾腎陽虛型最為多見，表現(xiàn)為身乏無力、四肢不溫、懶言少語等怠乏癥狀[10]。其治療多用補精益氣、溫腎健脾類的中藥[11]。無論是基于甲狀腺功能減退癥的中醫(yī)學發(fā)病機制還是基于甲狀腺功能減退癥的現(xiàn)代研究，甲狀腺功能減退癥長期不愈均會引起不同程度的腎損傷[12]。

氧化應激是由于機體抗氧化調(diào)節(jié)失衡，導致氧化中間產(chǎn)物過多，體內(nèi)自由基物質(zhì)大量堆積[13-14]，過量的自由基物質(zhì)可引起機體氧化損傷。超氧化物歧化酶是機體重要的抗氧化酶，對清除氧自由基和防止氧自由基而致的分子損傷具有重要作用。超氧化物歧化酶還能保護谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶免受氧自由基的滅活作用；丙二醛水平可間接反映機體組織細胞氧化損傷的程度[15-16]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，甲狀腺功能減退癥模型組大鼠血清超氧化物歧化酶活性明顯降低，丙二醛、尿素氮、肌酐水平明顯升高，表明腎臟對氧化反應較敏感，甲狀腺功能減退癥大鼠腎臟的抗氧化能力減弱，自由基過量氧化損傷是甲狀腺功能減退癥的分子病理基礎。正常生理狀態(tài)下，機體內(nèi)超氧化物歧化酶和丙二醛處于平衡狀態(tài)，甲狀腺功能減退癥大鼠血清超氧化物歧化酶活性下降，丙二醛水平明顯增加，表明甲狀腺功能減退癥引起氧化應激損傷導致超氧化物歧化酶活性明顯降低，且脂質(zhì)過氧化程度增高?？寡趸笜俗兓c腎功能減退、腎組織病理改變相一致，說明氧化應激可能在甲狀腺功能減退癥模型大鼠腎臟損傷中發(fā)揮重要作用。

黃芪含有黃酮類、皂苷類、多糖類等活性成分，是臨床常用補氣中藥，藥用歷史久遠[17-18]。目前臨床上黃芪入藥多為傳統(tǒng)飲片，水煎煮后取濾液為藥用，隨著中藥的現(xiàn)代化發(fā)展，通過微生物發(fā)酵制備的黃芪發(fā)酵物可使黃芪的有效成分充分利用。本研究采用黃芪及其發(fā)酵物干預甲狀腺功能減退癥模型大鼠，與甲狀腺功能減退癥模型組相比，黃芪中、高劑量組和黃芪發(fā)酵物中、高劑量組大鼠血清超氧化物歧化酶活性均明顯增高，丙二醛、尿素氮、肌酐水平均顯著降低，表明黃芪及其發(fā)酵物可有效上調(diào)甲狀腺功能減退癥大鼠超氧化物歧化酶水平，抑制體內(nèi)自由基產(chǎn)生和氧化應激反應，減少脂質(zhì)過氧化，利于損傷區(qū)域組織修復和功能重建，從而改善腎臟病理形態(tài)學變化及腎功能。雖然應用含有黃芪的中藥復方治療甲狀腺功能減退癥引起的腎病取得了較為滿意的療效[19]，但其作用機制尚未完全闡明，現(xiàn)代研究表明黃芪具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等藥理作用[20-21]。

綜上所述，黃芪及其發(fā)酵物可提高甲狀腺功能減退癥大鼠抗氧化能力，改善腎損傷。但因本研究條件所限，其作用機制還有待進一步研究。