宋 莎，吳亞維，馮建文，韓秀梅，趙 凱

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴陽 550006）

甜櫻桃（Prunus aviumL.）又名歐洲甜櫻桃、大櫻桃，果實(shí)個(gè)大、硬度高，近些年浙江、江蘇、上海、湖北等地均在引種，尤其是與貴州省相鄰的云南和四川甜櫻桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，使貴州省很多企業(yè)和果農(nóng)受到影響也開始嘗試種植。但“花而不實(shí)”、坐果率低和落果嚴(yán)重等問題限制了貴州省甜櫻桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

前些年，需冷量不足通常被認(rèn)為是溫暖地區(qū)甜櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展遲滯的主要限制因素[1]。近些年發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)比較溫暖的南方地區(qū)每年冬季0～7.2 ℃的低溫累積量可以使中需冷量品種順利通過休眠[2]，冬季低溫不足并不是南方地區(qū)甜櫻桃坐果率低的關(guān)鍵因素，而春季開花坐果期的降雨會(huì)直接影響甜櫻桃授粉和坐果[3]，夏季雨水偏多會(huì)影響花芽分化數(shù)量和質(zhì)量[4]。貴州省科研工作者自2008 年起對省內(nèi)引進(jìn)的甜櫻桃開展觀察和試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)影響貴州省甜櫻桃開花坐果的主要因素是降水較多，且自2015 年起在貴陽市開展了甜櫻桃避雨栽培試驗(yàn)，已報(bào)道避雨栽培雖然影響甜櫻桃的光合速率[5]，但有利于花束狀果枝和花芽的形成[6]，也可提高植株開花數(shù)量和花器官質(zhì)量，現(xiàn)需進(jìn)一步研究避雨栽培對其雌配子體發(fā)育的影響。果樹雌雄配子體正常發(fā)育是授粉受精成功的基礎(chǔ)，在薔薇科果樹中，雌配子體發(fā)育異常會(huì)導(dǎo)致坐果率低[7]，因而研究果樹雌配子體的發(fā)育具有重要的實(shí)踐意義。

果樹雌雄配子體發(fā)育的相關(guān)研究較多，桃[8]、番荔枝[9]、棗[10-11]等均有報(bào)道。朱東姿等[12]應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察甜櫻桃‘美早’和‘布魯克斯’的雌配子體發(fā)育過程，并統(tǒng)計(jì)了胚囊發(fā)育情況，推測‘美早’胚囊容易敗育而‘布魯克斯’胚囊活力高。張雪等[13]利用常規(guī)石蠟切片法觀察‘馬哈利’櫻桃的雌雄蕊發(fā)育過程，探討了其授粉結(jié)實(shí)率低的解剖學(xué)原因。王玉等[14]統(tǒng)計(jì)了甜櫻桃‘拉賓斯’‘艷陽’和‘馬哈利CDR-1’自花授粉坐果率，并通過石蠟切片法對其雌雄配子體發(fā)育過程進(jìn)行了觀察。

本試驗(yàn)以避雨栽培的‘布魯克斯’和‘薩米脫’2個(gè)甜櫻桃品種為試材，以露地栽培為對照，通過石蠟切片方法觀察了甜櫻桃雌配子體形態(tài)發(fā)育過程，分析了避雨栽培對甜櫻桃雌雄配子體發(fā)育的影響，以期為探討貴州省甜櫻桃露地栽培坐果率低的原因提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所貴陽市烏當(dāng)區(qū)百宜鎮(zhèn)果樹試驗(yàn)基地，海拔1 330 m，年平均氣溫14.30 ℃，平均年降水量1 240 mm，年日照時(shí)數(shù)1 300～1 400 h。避雨設(shè)施為四連棟大棚，頂膜兩側(cè)可卷起1.5 m，側(cè)膜可卷至距離地面2.0 m 高處。供試品種為5 年生‘布魯克斯’和‘薩米脫’，砧木為‘吉塞拉6號’，行株距4.0 m×2 m，樹形采用紡錘形[7]。避雨栽培和露地栽培的‘布魯克斯’和‘薩米脫’2個(gè)甜櫻桃品種各隨機(jī)選取5 株樹掛牌試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

2019—2020 年，自2 月下旬花芽開始萌動(dòng)起至3 月下旬，每3 d 采1 次花芽（后為花蕾），每次隨機(jī)在每株掛牌樹上采10個(gè)發(fā)育良好、無病蟲害的花芽或花蕾，F(xiàn)AA 固定液固定，常規(guī)石蠟切片法制片，番紅固綠染色，NIKON ECLIPSE E100 型正置光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，記錄形態(tài)特征和配子體發(fā)育時(shí)期。觀察胚囊形態(tài)，統(tǒng)計(jì)胚珠和胚囊發(fā)育正常、有胚珠無胚囊、無胚珠無胚囊的花朵數(shù)量，計(jì)算百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 避雨栽培對甜櫻桃花蕾形態(tài)發(fā)育過程的影響

通過觀察不同栽培模式下甜櫻桃花蕾縱切圖（圖1）發(fā)現(xiàn)，避雨栽培模式下‘布魯克斯’和‘薩米脫’的雌配子體小孢子母細(xì)胞3 月13 日開始發(fā)育，雄配子體3 月7 日開始發(fā)育；露地栽培模式下甜櫻桃雌配子體小孢子母細(xì)胞3 月16 日開始發(fā)育，雄配子體3 月10 日開始發(fā)育。對2種栽培模式下的完整花蕾切片各選了100個(gè)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，避雨栽培模式下甜櫻桃花蕾形態(tài)發(fā)育基本正常，露地栽培模式下7%的甜櫻桃花蕾切開后內(nèi)部組織細(xì)胞變形（圖1-K）或降解（圖1-L）?？梢姡苡暝耘嗫墒固饳烟掖菩叟渥芋w發(fā)育時(shí)期提前，并促進(jìn)其正常形態(tài)發(fā)育。

圖1 避雨栽培模式下‘薩米脫’花蕾縱切形態(tài)

2.2 避雨栽培對甜櫻桃雌配子體形態(tài)發(fā)育的影響

利用石蠟切片法未能觀察到甜櫻桃雌配子體形態(tài)發(fā)育全過程，僅能看到3 月13—16 日子房開始發(fā)育。部分可以觀察到胚珠和胚囊的存在以及形態(tài)是否正常，但很難在一張切片中同時(shí)觀察到胚囊發(fā)育過程中的幾個(gè)核，無法界定具體時(shí)期。對2種栽培模式下的完整子房切片各選了100個(gè)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)雌配子體主要為正常胚珠和胚囊（圖2-A）、無胚囊有胚珠（圖2-B）、無胚珠無胚囊（圖2-C）3種形態(tài)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表1），避雨栽培模式下，‘布魯克斯’和‘薩米脫’的正常發(fā)育胚囊均在50%以上；露地栽培模式下，‘布魯克斯’和‘薩米脫’的正常發(fā)育胚囊均小于15%?？梢姡苡暝耘嗫商岣咛饳烟艺Ｅ咧?、胚囊的比例。

圖2 ‘薩米脫’雌配子體的3種形態(tài)

表1 避雨栽培對甜櫻桃胚珠、胚囊形態(tài)的影響

2.3 避雨栽培‘薩米脫’雄配子體形態(tài)發(fā)育過程

由避雨栽培‘薩米脫’的雄配子體切片（圖3）可以看出，甜櫻桃雄配子體發(fā)育過程主要為造孢細(xì)胞時(shí)期、小孢子母細(xì)胞時(shí)期、小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期、小孢子單核居中時(shí)期、小孢子單核靠邊時(shí)期、二核花粉時(shí)期、成熟花粉時(shí)期等。造孢細(xì)胞孢原細(xì)胞是上年分化形成的，2 月26 日處于造孢細(xì)胞時(shí)期，造孢細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核大，呈不規(guī)則多邊形，其他細(xì)胞沒有明顯變化（圖3-A）；3 月7日進(jìn)入小孢子母細(xì)胞時(shí)期，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核更明顯，細(xì)胞的棱角鈍化變圓，已經(jīng)形成小孢子母細(xì)胞，花藥壁絨氈層細(xì)胞大多處于有絲分裂期，體積明顯增大（圖3-B）；3 月10 日小孢子母細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)期，能看到四分體排列為四面體形（圖3-C）；3 月13 日四分體已分離成單個(gè)小孢子，小孢子有1個(gè)核位于中央，液泡不明顯，細(xì)胞質(zhì)濃（圖3-D）；3 月16 日小孢子體積增大，細(xì)胞內(nèi)形成中央大液泡，細(xì)胞核在細(xì)胞一側(cè)，部分細(xì)胞核形成了2個(gè)核即生殖核和營養(yǎng)核，進(jìn)入二核階段（圖3-E），這一時(shí)期進(jìn)行時(shí)間較長；到3 月25日開始形成成熟的二核花粉。

圖3 避雨栽培模式下‘薩米脫’雄配子體形態(tài)發(fā)育過程

2.4 避雨栽培對甜櫻桃雄配子體形態(tài)發(fā)育的影響

同一日期采集的不同栽培模式、不同品種甜櫻桃的花蕾雄配子體發(fā)育時(shí)期不同。由表2 可知，避雨栽培模式下，‘布魯克斯’和‘薩米脫’的雄配子體發(fā)育時(shí)期在3 月13 日之前基本相同，之后‘薩米脫’稍早于‘布魯克斯’進(jìn)入小孢子單核靠邊期；露地栽培模式下，‘布魯克斯’進(jìn)入小孢子母細(xì)胞、小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂、小孢子單核居中等時(shí)期均稍早于‘薩米脫’，而形成成熟花粉的時(shí)期基本一致。避雨栽培模式下2個(gè)甜櫻桃品種的雄配子體的幾個(gè)發(fā)育時(shí)期均早于露地栽培，但到3 月28 日均形成了成熟花粉。對2種栽培模式下3 月28 日的完整花藥切片各選了100個(gè)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，露地栽培模式下甜櫻桃雄配子體會(huì)發(fā)生進(jìn)入小孢子母細(xì)胞時(shí)期后不再進(jìn)行減數(shù)分裂（圖4-A）、逐漸降解（圖4-B）或小孢子時(shí)期形成空花粉囊（圖4-C）等現(xiàn)象使雄配子體敗育，其中小孢子母細(xì)胞不進(jìn)行減數(shù)分裂或逐漸降解的占5%，空花粉囊占4%；而避雨栽培模式下雄配子體形態(tài)發(fā)育正常。可見，避雨栽培不僅促使甜櫻桃雄配子體發(fā)育時(shí)期提前，還能促進(jìn)雄配子體正常發(fā)育。

表2 避雨栽培對甜櫻桃雄配子體形態(tài)發(fā)育時(shí)期的影響

圖4 露地栽培模式下‘薩米脫’雄配子體敗育形態(tài)

3 討論與結(jié)論

植物雌配子體發(fā)育與受精存在直接關(guān)系，雌配子體發(fā)育不良將導(dǎo)致不能正常受精與坐果[15]。胚囊是雌性器官的重要組成部分，也是受精和胚珠形成種子的重要場所，胚囊異常發(fā)育會(huì)導(dǎo)致無法正常受精發(fā)育成果實(shí)。朱東姿等[12]應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡清楚地觀察了甜櫻桃雌配子體的大孢子母細(xì)胞時(shí)期、四分體時(shí)期、一核胚囊時(shí)期、二核胚囊時(shí)期、四核胚囊時(shí)期、八核胚囊時(shí)期等6個(gè)發(fā)育時(shí)期，發(fā)現(xiàn)‘布魯克斯’和‘美早’的胚囊敗育率分別為21%和41%。因采樣時(shí)間和石蠟切片方法的限制，未能在同一張切片中同時(shí)觀察到胚囊發(fā)育過程中的幾個(gè)核，無法界定甜櫻桃雌配子體具體發(fā)育時(shí)期，本研究中未能很好地觀察到雌配子體的發(fā)育過程，僅根據(jù)觀察到的情況統(tǒng)計(jì)了雌配子體胚珠和胚囊的存在情況。避雨栽培模式下甜櫻桃形態(tài)發(fā)育正常的胚囊、胚珠在50%以上，而露地栽培模式下小于15%；雌配子體發(fā)育成有胚珠無胚囊類型比例較高，是造成雌配子體敗育的重要原因。本研究中甜櫻桃雄配子體的形態(tài)發(fā)育過程主要有造孢細(xì)胞時(shí)期、小孢子母細(xì)胞時(shí)期、小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期、小孢子單核居中時(shí)期、小孢子單核靠邊時(shí)期、二核花粉時(shí)期、成熟花粉時(shí)期等，這與王玉等[14]的觀察結(jié)果基本一致，但雄配子體發(fā)育過程中有9%左右出現(xiàn)未進(jìn)行減數(shù)分裂、降解或空花粉囊現(xiàn)象。雌配子體胚囊敗育和雄配子體發(fā)育過程中降解可能是露地栽培甜櫻桃落花落果的主要原因。

花器官是與甜櫻桃產(chǎn)量關(guān)系最密切的器官，它的正常發(fā)育是獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵[16]。開花期統(tǒng)計(jì)露地栽培‘布魯克斯’和‘薩米脫’開花數(shù)量，每株僅60 朵左右；實(shí)際上，冬季統(tǒng)計(jì)露地栽培甜櫻桃結(jié)果枝和花芽數(shù)量時(shí)并不僅僅形成幾十個(gè)花芽[6]。這與試驗(yàn)地氣候條件有關(guān)。自2 月26 日至3 月9 日，試驗(yàn)地露地日平均氣溫高于避雨設(shè)施內(nèi)，甜櫻桃雌雄配子體發(fā)育較慢；3 月10 日起，避雨設(shè)施內(nèi)日平均氣溫高于露地，小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)期開始快速發(fā)育；3 月25—28 日是日平均氣溫較高的幾天，雄配子體形態(tài)發(fā)育基本完成，形成成熟的二核花粉。可見，在甜櫻桃雌雄配子體發(fā)育過程中低溫可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)育不完全或畸形現(xiàn)象出現(xiàn)。試驗(yàn)地冬季降雨或大霧天氣較多，到翌年2 月花芽開始萌動(dòng)前，因生長環(huán)境的濕度持續(xù)較大對露地栽培甜櫻桃花芽發(fā)育產(chǎn)生了不可逆?zhèn)?，部分花芽腐爛或停止生長，從而發(fā)生本研究中外部正常的花蕾切開后內(nèi)部結(jié)構(gòu)均已降解的現(xiàn)象。自2 月26 日至3 月28日，僅有3～4 d 避雨設(shè)施內(nèi)濕度略高于露地，其余時(shí)間避雨設(shè)施內(nèi)濕度比露地低；避雨設(shè)施內(nèi)雖然濕度降低幅度不大，但甜櫻桃發(fā)育的花蕾上沒有水滴，大多處在干燥狀態(tài)，大多可正常發(fā)育；而露地栽培甜櫻桃的花芽、花蕾等在濕度較大時(shí)整個(gè)組織處于潮濕狀態(tài)，進(jìn)行形態(tài)發(fā)育的花蕾易出現(xiàn)畸形現(xiàn)象，還有部分花芽腐爛?？梢姡杭窘涤晔怯绊戀F州省中部露地栽培甜櫻桃開花結(jié)實(shí)的重要因素。

雖然避雨設(shè)施影響了甜櫻桃的光合速率[5]，但避雨栽培明顯促進(jìn)甜櫻桃花芽形成[6]，也提高了雌雄配子體正常發(fā)育的比例，貴州省中部避雨栽培甜櫻桃意義重大，降低避雨設(shè)施成本以及提高覆蓋材料透光率的技術(shù)值得進(jìn)一步研究。本研究雖然對甜櫻桃雄配子體的形態(tài)發(fā)育狀況觀察得較為完善，但由于選片沒能對雌配子體進(jìn)行仔細(xì)的研究，對甜櫻桃雌配子體形態(tài)發(fā)育過程只能提供相對可靠的數(shù)據(jù)。在今后的工作中對甜櫻桃胚珠、胚囊及后續(xù)的胚胎形態(tài)發(fā)育等問題有待解決。