劉謙鴻，曾柏全

中南林業(yè)科技大學生命科學與技術學院（長沙 410000）

橘子樹作為中國重要的經濟型果樹，在中國南部大量種植，2018年全國橘子生產總量為4138.14萬 t，每年產生大量橘子皮，但是由于得不到合理利用，大量橘子皮被當作垃圾丟棄，造成巨大浪費和環(huán)境污染[1]。近年來歐美國家為提高原料的綜合使用，達到縮減成本、提高產品開發(fā)價值的目的，從橘子果品中提取功能成分，得到一系列有附加值的產品，其在食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)擁有廣泛開發(fā)價值，具有一定抗癌癥效果[2]。在國內，橘皮中的生理活性成分的開發(fā)還處在起步階段。

橙皮苷又名二氫黃酮苷[3]，是橘皮黃酮的重要組成部分，根據國內外文獻研究發(fā)現(xiàn)橙皮苷具有良好的醫(yī)藥食用價值：（1）通過抑制炎癥反應相關的酶來抑制炎癥[4]；（2）降低白細胞與血管內皮細胞的粘附與移行，減少崩解后的炎性物質（如組胺、緩激肽、補體、白三烯、前列腺素、過多的自由基等）的釋放，從而使毛細血管通透性降低[5]；（3）有效地降低血液黏度，加速血液循環(huán)，從而減輕微循環(huán)瘀滯[6]；（4）改善淋巴循環(huán)，使組織液快速回流，減輕水腫，如地奧斯明（Diosmin）橙皮苷[7]用于痔瘡，既可減輕其爆發(fā)性癥狀，也能在發(fā)作時間和頻率上起到不錯效果；（5）具有顯著的抗癌、抗氧化、抗菌作用，并且可以保護神經[8]。大部分的中藥材的有效成分被包裹在細胞壁內，植物細胞的細胞壁主要成分為纖維素[9]和豐富的果膠[10]，為獲取有效成分，必須破壞其細胞壁，才能釋放出目標成分，而纖維素酶能夠有效地破壞植物細胞壁主要成分纖維素的β-1, 4糖苷鍵，使纖維素結構破壞[11]，進而提高有效成分的提取收率。使用熱回流提取法，選取能溶解橙皮苷的乙醇作為提取劑[12]，通過加熱乙醇，將其溶解蒸發(fā)，達到提取橙皮苷的目的。

試驗從陳皮中提取橙皮苷，使用纖維素酶對陳皮進行預處理[13]，聯(lián)合使用熱回流提取法[14]進行橙皮苷提取，得到一種環(huán)境友好型且適合大規(guī)模工業(yè)生產的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳皮購買自湖南亞飛中藥飲片有限公司。

橙皮苷標準品（Hesperidin，HPLC，98%，LotNo P06DF77001，上海源葉生物技術有限公司）；纖維素酶粗品（活力單位約1100 U/g，滄州夏盛生物技術有限公司）；其他化學試劑均為分析純或化學純。

1.2 儀器與設備

旋轉蒸發(fā)儀（R-1001-VN，鞏義市中天儀器科技有限公司）；電子天平[BSA223S-CW，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；紫外分光光度計（UV-1700，日本島津公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線制定

精確稱取5 mg（精確到0.0001 g）橙皮苷標準品，用乙醇溶解，定容至50 mL，配制成質量濃度0.1 mg/mL的橙皮苷標準品溶液。

精密吸取橙皮苷標準溶液，以分析純乙醇為空白對照，用紫外分光光度計在100～500 nm波長掃描，在285 nm處有強吸收峰，確定橙皮苷檢測波長285 nm。分別取1，2，3，4和5 mL橙皮苷標準溶液于10 mL容量瓶中，定容，得到質量濃度分別為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.10 mg/mL的系列溶液，在285 nm波長處檢測吸光度，每一濃度測3次，結果取平均值。以橙皮苷標準樣品質量濃度（mg/mL）為橫坐標，以其吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程y=29.919x-0.0771，R2=0.999。

1.3.2 橙皮苷提取試驗

1.3.2.1 工藝流程與操作

工藝流程：陳皮→粉碎過0.150 mm孔徑篩→酶法預處理→加入乙醇→熱回流提取→橙皮苷提取液。

操作說明：將陳皮粉碎，過0.150 mm孔徑的細篩，在燒杯中進行預處理，分別稱取纖維素酶和陳皮粉，按照纖維素酶∶陳皮為1∶30（W/W）比例添加，加入蒸餾水，調節(jié)pH 4.8，置于磁力攪拌器上，攪拌預處理1.5 h，在預處理后加入乙醇，分別考察不同乙醇體積分數(shù)、時間、料液比對橙皮苷提取率的影響。

1.3.2.2 提取液中橙皮苷含量測定

取提取液稀釋至適當濃度，用紫外分光光度計在285 nm處測吸光度，比較吸光度大小，橙皮苷提取率按式（1）計算。

2 結果與分析

2.1 乙醇體積分數(shù)對橙皮苷提取率的影響

固定溫度90 ℃、提取時間4 h、料液比1∶30（g/mL），考察乙醇體積分數(shù)對橙皮苷提取率的影響，結果見圖1。

根據圖1可以看出，在溫度90 ℃、提取時間4 h、料液比1∶30（g/mL）條件下，乙醇體積分數(shù)從60%提高到75%，橙皮苷提取率顯著提高，乙醇體積分數(shù)75%時提取率達到最大，而后增加乙醇體積分數(shù)，提取率反而降低，可能是高體積分數(shù)的乙醇會增加一些醇溶性雜質的溶出量，這些成分與橙皮苷競爭結合乙醇，降低橙皮苷向溶劑的擴散，導致橙皮苷提取率減少，同時會增加成本，因此選擇乙醇體積分數(shù)70%，75%和80%作為正交試驗的3個水平。

圖1 乙醇體積分數(shù)對橙皮苷提取率的影響

2.2 提取時間對橙皮苷提取率的影響

固定溫度90 ℃、乙醇體積分數(shù)75%、料液比1∶30（g/mL），考察提取時間對橙皮苷提取率的影響，結果見圖2。

根據圖2可以看出，在溫度90 ℃、乙醇體積分數(shù)75%、料液比1∶30（g/mL）的條件下，隨著提取時間的延長，提取率逐漸增加，3 h時橙皮苷提取率達到最大值。而后繼續(xù)增加提取時間，提取率下降，可能是長時間的高溫處理會導致橙皮苷結構破壞分解，最終導致提取率的降低，因此選擇提取時間2.5，3.0和3.5 h作為正交試驗的3個水平。

圖2 提取時間對橙皮苷提取率的影響

2.3 料液比對橙皮苷提取率的影響

固定溫度90 ℃、乙醇體積分數(shù)75%、提取時間3 h，考察料液比對橙皮苷提取率的影響，結果見圖3。

根據圖3可以看出，在溫度90 ℃、乙醇體積分數(shù)75%、提取時間3 h的條件下，隨著料液比不斷減小，橙皮苷提取率上升，料液比1∶20（g/mL）時，橙皮苷提取率達到最大。因為隨著料液比減小，乙醇和陳皮之間的接觸面變大，增大橙皮苷溶出量。隨著溶劑繼續(xù)增多，生產成本會增加，不利于工業(yè)大規(guī)模生產，因此選擇料液比1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）為正交試驗的3個水平。

圖3 料液比對橙皮苷提取率的影響

2.4 溫度對橙皮苷提取率的影響

固定乙醇體積分數(shù)75%、提取時間3 h、料液比1∶20（g/mL），考察提取溫度對橙皮苷提取率的影響，結果見圖4。

根據圖4可以看出，在乙醇體積分數(shù)75%、提取時間3 h、料液比1∶20（g/mL）的條件下，隨著提取溫度的升高，提取率逐漸增加，當溫度達到80 ℃時，橙皮苷提取率達到最大值。而后繼續(xù)升高提取溫度，提取率下降，可能是過高的提取溫度處理會導致橙皮苷結構破壞分解，最終導致提取率的降低，因此選擇提取溫度75，80和85 ℃作為正交試驗的3個水平。

圖4 溫度對橙皮苷提取率的影響

2.5 提取橙皮苷的正交試驗結果

根據單因素試驗，對橙皮苷提取率影響的4個因素（乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比、溫度）每個因素選取3個水平，選取的水平見表1。固定陳皮粉20 g，其他物料以陳皮粗粉為標準計算，根據L9(34)的正交表安排正交試驗，試驗結果見表2。

表1 提取橙皮苷試驗因素水平選取表

根據表2中的正交試驗結果分析極差值，4個因素對橙皮苷提取率影響大小依次為A＞B＞D＞C，其中乙醇體積分數(shù)影響力最大，提取時間次之，料液比影響最小，通過考察4個因素在三水平上橙皮苷的提取率，得出最佳反應條件：A1B2C3D3，即乙醇體積分數(shù)75%、提取時間3 h、料液比1∶25（g/mL）、溫度85 ℃，此時橙皮苷的提取率達到6.04%。

表2 提取橙皮苷試驗因素水平表

2.6 驗證試驗

通過維素酶預處理的單因素試驗和正交試驗，找到橙皮苷最佳提取條件，在此條件下做驗證試驗，進行驗證分析，固定陳皮粗粉20 g、乙醇體積分數(shù)70%、提取時間3 h、料液比1∶25（g/mL）、溫度85 ℃，進行3次重復試驗，測定橙皮苷的提取率，結果分別為5.98%，5.97%和6.02%，平均提取率為5.99%，與正交試驗結果基本一致，且重復性較好，證實最佳反應條件有效性。

3 結論與討論

使用纖維素酶進行預處理，調節(jié)pH 4.8、溫度45 ℃、酶解時間1.5 h、酶∶陳皮粉1∶30（W/W），在此條件下，進行熱回流提取，通過正交試驗結果進行分析，得到最佳提取工藝條件：溫度85 ℃、乙醇體積分數(shù)70%、提取時間3 h、料液比1∶25（g/mL）。在此條件的處理下，橙皮苷提取率為5.99%，相對標準偏差（SRSD）為2.16%（n=3）。

纖維素酶能很好地破壞細胞壁結構，且不破壞橙皮苷結構，使得目標物橙皮苷釋放，有效提高產率，選取乙醇作為提取劑是因為甲醇有毒性，會造成環(huán)境污染，而水的提取效果相對甲醇、乙醇過低。選擇使用纖維素酶預處理，聯(lián)合乙醇熱回流提取法提取橙皮苷，使用該方法能夠一定程度地提高橙皮苷提取率，在對于橙皮苷這一生物資源開發(fā)利用的過程中提供新思路，采用多種處理方法相結合，在一定程度上會降低污染，提高產率，增加工業(yè)生產價值。