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        花椒殘?jiān)悬S酮類成分的提取工藝及其抗氧化活性

        2021-08-25 06:49:32額爾敦巴雅爾扈寧軒鄧雅文云雪艷董同力嘎
        食品工業(yè) 2021年8期
        關(guān)鍵詞:殘?jiān)?/a>花椒光度

        額爾敦巴雅爾,扈寧軒,鄧雅文,云雪艷,董同力嘎

        內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院(呼和浩特 010018)

        花椒(Zanthoxylum bungeanum)原產(chǎn)于中國平原和海拔較高的山地[1],因含有豐富的揮發(fā)性物質(zhì)而具有特殊香氣。近年來,黃酮物質(zhì)因具有廣泛的藥理作用而備受關(guān)注,以抗氧化活性尤為突出,并且在降低膽固醇、抑制炎癥物質(zhì)流出、抑制癌細(xì)胞產(chǎn)生方面具有突出功效[2]。花椒也由于較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值而不斷擴(kuò)大種植面積,但中國對(duì)花椒中黃酮物質(zhì)的研究相對(duì)不足,對(duì)提取物的系統(tǒng)性研究也比較欠缺[3]。因此,從花椒黃酮提取物的提取工藝、純化工藝、提取物定性分析及體外抗氧化活性4個(gè)方面展開,為該物質(zhì)的環(huán)保工業(yè)化提取及體外活性研究提供參考依據(jù),對(duì)中國花椒產(chǎn)品的開發(fā)利用具有重要意義。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        花椒殘?jiān)ㄏ磧艉蠛娓蓚溆茫拇h源);蘆丁(≥98%,上海順勃有限公司);D101大孔吸附樹脂(南開大學(xué)化工廠);無水乙醇、石油醚(30~60 ℃)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(均為分析純);乙腈、異丙醇、甲酸(均為質(zhì)譜純)。

        1.2 儀器與設(shè)備

        高效液相色譜儀Agilent 1100系列(美國Agilent公司);Agilent Poroshell 120 SBC18色譜柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm,美國Agilent公司);Waters Acquity UPLC液相色譜儀(美國Waters公司);Synapt G2-S Q-TOF質(zhì)譜儀(配有Empower 3.0工作站和MassLynxV 4.1分析軟件,美國Waters公司)。

        1.3 溶劑法提取花椒渣中的黃酮

        1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        參考謝宗波等[4]的方法,配制0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,于20 mL比色管依次加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液、5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液和5%氫氧化鈉溶液,用30%甲醇稀釋至比色管刻度,分別配制為0,0.01,0.02,0.03,0.04和0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品,搖勻放置15 min后測定其在508 nm下吸光度。

        1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        將溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比和提取時(shí)間作為變量設(shè)置4個(gè)單因素試驗(yàn),產(chǎn)物過濾后得到花椒渣黃酮粗提物,分別測得花椒渣黃酮得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

        4個(gè)單因素試驗(yàn)依次確定工藝參數(shù)。分別測定甲醇體積分?jǐn)?shù)40%,50%,60%,70%和80%時(shí)的花椒渣黃酮得率。選擇最佳體積分?jǐn)?shù)甲醇作為萃取溶劑,分別測定提取溫度15,25,35,45和55 ℃這5個(gè)溫度下的花椒渣黃酮得率。保持上述溶劑濃度,選擇最佳提取溫度,分別測定料液比1∶4,1∶6,1∶8,1∶10和1∶12(g/mL)時(shí)的花椒渣黃酮得率。在試驗(yàn)得出的最佳條件下,分別測定提取靜置時(shí)長2,3,4,5,6和7 h時(shí)的花椒渣黃酮得率,得出最優(yōu)組合的工藝參數(shù)。

        1.3.3 黃酮得率的測定

        取3.0 mL粗提液置于10 mL比色管中,按1.3.1中提到的方法顯色,以試劑空白作為對(duì)照測定其508 nm處吸光度,由標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線按式(1)計(jì)算出黃酮得率。

        式中:C為樣液的質(zhì)量濃度,mg/mL;V為樣液的體積,mL;W為花椒殘?jiān)|(zhì)量,g。

        1.3.4 黃酮純度的測定

        稱取10.0 g干燥的花椒渣粉末,萃取后除去溶劑甲醇,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用烘箱干燥得到黃酮粉末。用30%甲醇溶解20 mg花椒殘?jiān)S酮粉末定容至400 mL,取6.0 mL該溶液移入20 mL比色管中,按照1.3.1的方法進(jìn)行顯色,以試劑空白作為對(duì)照測定其508 nm處的吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線計(jì)算提取液質(zhì)量濃度C,并按式(2)計(jì)算花椒殘?jiān)S酮純度。

        式中:C為提取液質(zhì)量濃度,mg/mL;V為提取液體積,mL;W為黃酮粉末質(zhì)量,mg。

        1.4 花椒渣黃酮的定性分析

        1.4.1 樣品液的制備

        取10~20 mg樣品,以甲醇∶水∶甲酸比例1∶1∶0.5%的超聲條件溶解,以12000 r/min 離心后,取上清液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,即得樣品液。

        1.4.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析條件

        質(zhì)譜條件:電噴霧電離(ESI)離子源,質(zhì)量掃描范圍是m/z50~1200,毛細(xì)管電壓3 kV(負(fù)離子模式),樣品錐電壓40 V,提取錐電壓4 V,源溫110 ℃,脫溶劑氣溫度300 ℃,脫溶劑氣流速度700 L/h,質(zhì)量掃描范圍m/z200~2000。

        液相色譜分析條件:Agilent Poroshell 120 SBC18色譜柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm);流動(dòng)相,A相為乙腈,B相為0.5%甲酸水溶液;梯度洗脫程序:0~35 min,60%~84% A,35~114 min,84%~100% A,114~120 min,100%~60% A;流速0.2 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

        1.5 體外活性評(píng)價(jià)

        1.5.1 樣品液的制備

        花椒總黃酮粗提物的制備:粉碎花椒后準(zhǔn)確稱取2.0 g粉末,用石油醚脫脂處理1 h。以70%甲醇作為溶劑,料液比1∶8(g/mL),室溫下浸提4 h,烘干得到粗提物粉末。

        花椒總黃酮純化樣的制備:上述粗提物通過D101型的大孔樹脂的純化。純化控制條件:樣品液質(zhì)量濃度1.0 mg/mL,pH 4.0,以70%甲醇作為洗脫劑,用量3 BV,放入烘干箱烘干得到純化樣粉末。

        1.5.2 DPPH自由基清除能力測定

        試驗(yàn)參考張宇思等[5]提到的方法并稍作改動(dòng)。用甲醇將50 mg DPPH定容至250 mL容量瓶中,得到5×10-4mol/L DPPH溶液。以甲醇分別溶解花椒及花椒殘?jiān)傸S酮粗提物、精制花椒及精制花椒殘?jiān)傸S酮、BHT及VC,獲得質(zhì)量濃度0.01,0.02,0.04,0.08,0.12,0.16和0.20 mg/mL的7組溶液。在這7組溶液中分別加入1.0 mL 5×10-4mol/L DPPH,添加甲醇至5 mL。室溫靜置30 min后測定517 nm處的吸光度。根據(jù)式(3)計(jì)算樣品的DPPH自由基清除率。

        式中:A為不加樣的DPPH溶液(2.0 mL DPPH+2.0 mL甲醇)的吸光度;A1為樣品和DPPH混合后吸光度;A2為不加DPPH的樣液(樣品2.0 mL+2.0 mL甲醇)吸光度。

        1.5.3 還原力的測定

        試驗(yàn)參考Oyaizu[6]和Amarowicz等[7]的方法并稍作改動(dòng)。以70%甲醇為溶劑,配成質(zhì)量濃度0.20~0.50 mg/mL的樣品液。各取3 mL樣液于10支20 mL試管中,分別加入3 mL的0.01 g/mL鐵氰化鉀,混勻后在50 ℃水浴中保持30 min。加入3 mL 0.1 g/mL三氯乙酸,混合并以3000 r/min離心15 min。取3 mL上清液加入3 mL蒸餾水和1 mL 0.1 g/100 mL氯化鐵,混合靜置15 min后測700 nm處的吸光度,所有測定值取平均值3倍。

        1.5.4 抑制脂質(zhì)過氧化活性的測定

        試驗(yàn)參考任紅榮等[8]的方法。用30 mL 10 mmol/L PBS(pH 7.4)溶解200 mg卵磷脂,冰浴振蕩混勻。取0.5 mL該液體,加入1.0 mL PBS(pH 7.4)、質(zhì)量濃度樣液1.0 mL,以及1 mL 2.5 mmol/L EDTA-Fe(Ⅱ),混勻后于37 ℃水浴反應(yīng)45 min,加2.0 mL 0.28 g/mL三氯乙酸及1.0 mL 0.01 g/mL硫代巴比妥酸,搖勻靜置5 min,100 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min,冷卻后測各樣品在532 nm處的吸光度。每3個(gè)平行樣計(jì)算1次平均值。按式(4)計(jì)算脂質(zhì)過氧化抑制效率。

        式中:A0為不含樣品的吸光度;A1為含樣品的吸光度。

        1.5.5 測定總抗氧化能力

        按照南京建城生物工程學(xué)院TAC測量試劑盒的說明進(jìn)行試驗(yàn)。在37 ℃時(shí),萃取液每分鐘使反應(yīng)體系中的吸光度增加0.01~1 TAC單位(IU),以IU/mL表示。測量花椒殘?jiān)傸S酮總抗氧化能力為IU/mg,并做3次重復(fù)以獲所需數(shù)據(jù)平均數(shù)值,將抗壞血酸(VC)為陽性對(duì)照。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

        按照1.3.1中的方法,用最小二乘法得到關(guān)于蘆丁質(zhì)量濃度C和吸光度A的線性回歸曲線圖,由圖1可以看出,標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度C在一定范圍內(nèi)與吸光度A呈現(xiàn)較好線性相關(guān)。

        圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

        2.2 工藝參數(shù)的確定

        2.2.1 甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)

        由圖2可以看出,甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)40%~80%時(shí),花椒殘?jiān)狞S酮得率隨著甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)增加而出現(xiàn)逐漸升高趨勢,并在甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)達(dá)到最大值。隨著甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加,曲線緩慢下降,這是由于溶劑體積分?jǐn)?shù)過高,導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝固變性,抑制提取過程。所以甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)選擇70%。

        圖2 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花椒殘?jiān)S酮得率的影響

        2.2.2 提取溫度

        由圖3看出,提取溫度15~55 ℃時(shí),提取黃酮類物質(zhì)得率隨著提取溫度升高呈現(xiàn)先上升后緩慢下降趨勢,可能是由于低溫下體系的擴(kuò)散系數(shù)比較小,影響提取效率;隨著溫度逐漸升高,黃酮可能存在一定氧化損失。提取溫度25 ℃時(shí)所對(duì)應(yīng)的黃酮得率最高,因此提取溫度選擇25 ℃。

        圖3 提取溫度對(duì)花椒殘?jiān)S酮得率的影響

        2.2.3 料液比

        由圖4可以看出,料液比達(dá)到一定數(shù)值后,溶出物質(zhì)的能力就達(dá)到飽和,曲線呈現(xiàn)一種趨于平衡狀態(tài)。因此為避免溶劑浪費(fèi),提取料液比選擇1∶8(g/mL)。

        圖4 料液比對(duì)于花椒殘?jiān)S酮得率的影響

        2.2.4 浸提時(shí)間

        由圖5可以看出,靜置時(shí)間2~7 h時(shí),黃酮得率隨著提取時(shí)間增加在5 h達(dá)到最大值,而后開始下降。這是因?yàn)樘崛r(shí)間過長,提取液被氧化,以及放置時(shí)間過久而滋生細(xì)菌,其中的黃酮類物質(zhì)被微生物分解和利用。因此,浸提時(shí)間選擇5 h。

        圖5 浸提時(shí)間對(duì)于花椒殘?jiān)S酮得率的影響

        綜上所述,溫度為室溫25 ℃時(shí),溶劑法提取花椒殘?jiān)悬S酮最優(yōu)工藝條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)70%,料液比1∶8(g/mL),浸提靜置時(shí)間5 h。在此條件下,花椒殘?jiān)S酮得率為7.65%,干燥后的粗黃酮粉純度為23.4%。

        2.3 花椒渣黃酮的定性分析

        試驗(yàn)使用正離子模式,結(jié)合黃酮物質(zhì)譜特征碎片(分別為m/z191,m/z289,m/z353,m/z431,m/z447和m/z463),并根據(jù)數(shù)據(jù)庫篩查,對(duì)提取的黃酮樣液中8種物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定,見表1?;ń窔?jiān)S酮總離子流色譜圖見圖6。

        圖6 花椒殘?jiān)S酮總離子流色譜圖

        試驗(yàn)利用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)純化后的花椒殘?jiān)S酮進(jìn)行分析[8],純化精制后的花椒殘?jiān)S酮中主要含有8種物質(zhì),通過UV光譜定性后,質(zhì)譜鑒定結(jié)果見表1。其中,山茶黃酮苷A、3’, 5, 7-三羥基-4’-甲氧基黃酮7蕓香苷、Lethedioside A和山奈酚-3-蕓香糖苷是首次在花椒殘?jiān)邪l(fā)現(xiàn)的。

        表1 花椒殘?jiān)S酮的質(zhì)譜分析結(jié)果

        2.4 花椒渣黃酮的體外活性測定

        2.4.1 DPPH自由基的清除能力

        花椒殘?jiān)傸S酮對(duì)DPPH自由基的清除效果見圖7。在質(zhì)量濃度較低范圍內(nèi)曲線不斷上升,清除率增長。VC質(zhì)量濃度達(dá)到0.08 mg/mL后曲線上升緩慢,清除率基本保持不變?;ń窔?jiān)兓瘶淤|(zhì)量濃度0~0.20 mg/mL范圍之內(nèi),各組清除能力隨濃度增加而不斷增強(qiáng)?;ń窔?jiān)傸S酮純化樣對(duì)DPPH自由基清除能力顯著強(qiáng)于其他組?;ń窔?jiān)兓瘶淤|(zhì)量濃度0.20 mg/mL時(shí)清除率達(dá)89%,僅低于同質(zhì)量濃度下清除率93.1%的VC。

        圖7 花椒殘?jiān)傸S酮的DPPH自由基清除能力

        2.4.2 花椒渣總黃酮還原力的測定

        一種物質(zhì)潛在的抗氧化性能與還原能力有著較為密切的聯(lián)系。由圖8可知,在質(zhì)量濃度0~0.40 mg/mL,各組還原能力均隨著其濃度升高而增強(qiáng),但幅度不同?;ń窔?jiān)傸S酮純化樣的還原力比BHT強(qiáng),更高于其他提取物,但弱于VC。

        圖8 花椒殘?jiān)傸S酮的還原力

        2.4.3 花椒渣總黃酮抗脂質(zhì)過氧化的能力

        由圖9可知,花椒殘?jiān)兓傸S酮對(duì)Fe2+誘導(dǎo)的卵磷脂脂質(zhì)體外過氧化具有抑制作用;而花椒殘?jiān)醇兓傸S酮、花椒純化總黃酮和花椒未純化總黃酮的抑制率低于BHT,證明花椒殘?jiān)兓傸S酮具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)氧化能力。

        圖9 花椒殘?jiān)傸S酮抗脂質(zhì)過氧化能力

        2.4.4 花椒渣總黃酮的總抗氧化能力

        從圖10能看出4種提取樣的總抗氧化能力均隨其質(zhì)量濃度增加而不斷增強(qiáng),這與抗壞血酸的抗氧化活性走向相同。

        圖10 花椒殘?jiān)傸S酮與VC的總抗氧化能力圖

        經(jīng)過計(jì)算得出各組質(zhì)量濃度0.10 mg/mL時(shí)的總抗氧化能力:殘?jiān)兓瘶?2.1 IU/mg,殘?jiān)醇兓瘶?4.3 IU/mg,花椒純化樣65.4 IU/mg,花椒未純化樣31.4 U/mg,VC總抗氧化力強(qiáng)于各提取樣。

        經(jīng)過體外抗氧化試驗(yàn)對(duì)花椒殘?jiān)傸S酮的DPPH自由基清除能力、還原力、抗脂質(zhì)氧化能力和總抗氧化性能的研究,不難看出,殘?jiān)械目傸S酮在清除羥自由基和抑制脂質(zhì)抗氧化的方面優(yōu)于合成的傳統(tǒng)抗氧化劑,可以確定該物質(zhì)具有較強(qiáng)抗氧化活性。

        3 結(jié)論

        花椒殘?jiān)械狞S酮沒有明顯的毒副作用,具有作為天然抗氧化劑用于食品加工的潛力。通過4個(gè)單因素試驗(yàn),確定溶劑法提取花椒殘?jiān)悬S酮的最佳溫度為25 ℃、甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%,料液比為1∶8(g/mL)、浸提時(shí)間為5 h。在此條件下,花椒殘?jiān)傸S酮的得率達(dá)7.65%,花椒殘?jiān)傸S酮干燥后的純度為23.4%。

        采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)花椒殘?jiān)械狞S酮進(jìn)行定性分析,共鑒定出8種化合物,其中山茶黃酮苷A、3’, 5, 7-三羥基-4’-甲氧基黃酮7蕓香苷、Lethedioside A和山奈酚-3-蕓香糖苷是首次在花椒殘?jiān)邪l(fā)現(xiàn)的。試驗(yàn)結(jié)果可為開發(fā)花椒殘?jiān)悬S酮類全系列有效成分提供理論數(shù)據(jù)。

        由體外試驗(yàn)得知,花椒殘?jiān)兓傸S酮的DPPH自由基清除效果強(qiáng)于同質(zhì)量濃度的抗氧化劑BHT,但略微弱于VC;其還原力弱于VC,但高于同質(zhì)量濃度下BHT,其過氧化抑制率也高于BHT。此外,花椒殘?jiān)傸S酮純化樣的總抗氧化能力高于花椒總黃酮純化樣。

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